Artículo de método

Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo

DOI:

10.3791/54707

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30 de diciembre de 2016

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1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

En este artículo

Resumen

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Las sustancias controladas ópticamente son herramientas poderosas para estudiar las vías de señalización. Para ampliar el espectro de posibles experimentos, desarrollamos un dispositivo para estudiar sustancias controladas ópticamente en tiempo real mediante citometría de flujo: el LED Thermo Flow.

Resumen

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Las herramientas optogenéticas permiten investigaciones aisladas y funcionales de casi cualquier molécula de señalización dentro de vías de señalización complejas. Un obstáculo importante es la entrega controlada de luz a la muestra celular y, por lo tanto, las herramientas más populares para los estudios optogenéticos son los análisis celulares basados en microscopía y los experimentos in vitro. El citómetro de flujo tiene grandes ventajas sobre un microscopio, incluida la capacidad de medir rápidamente miles de células con una resolución de una sola célula. Sin embargo, aún no se utiliza ampliamente en optogenética. Aquí, presentamos un dispositivo que combina el poder de la optogenética y la citometría de flujo: el LED Thermo Flow. Este dispositivo ilumina las células a longitudes de onda, intensidades de luz y temperaturas específicas durante las mediciones de citometría de flujo. Se puede construir a bajo costo y se puede utilizar con los citómetros de flujo más comunes. Para demostrar su utilidad, caracterizamos la cinética de fotoconmutación de proteínas Dronpa in vivo y en tiempo real. Este protocolo se puede adaptar a casi todas las sustancias ópticamente controladas y amplía sustancialmente el conjunto de posibles experimentos. Y lo que es más importante, simplificará en gran medida el descubrimiento y el desarrollo de nuevas herramientas optogenéticas.

Introducción

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Herramientas Optogenética han ido ganando popularidad, en parte debido a que se pueden utilizar para descifrar el cableado de las vías de señalización de 1-4. Se basan en la capacidad de las proteínas fotoactivables para cambiar su conformación y de unión por afinidad cuando se ilumina con la luz. La fusión de estas proteínas a los elementos de señalización permite la regulación específica de un solo jugador dentro de complejas vías de señalización intracelular 5-12. Por consiguiente, una vía de señalización puede ser estudiado con alta resolución temporal y espacial.

La mayoría de los estudios optogenética basados en células utilizan métodos basados en la microscopía combinado con el cultivo en presencia de luz, seguido de análisis bioquímico 11,12. Por el contrario, un flujo singulariza citómetro de células a lo largo de un capilar y mide el tamaño celular, la granularidad y la intensidad de fluorescencia. Este método tiene ventajas importantes sobre microscopía o bioquímicos métodos, incluyendo la capacidad de analizar thousands de células a una resolución de una sola célula de vivir en un tiempo muy corto. Por lo tanto, es deseable combinar optogenética con citometría de flujo.

Hasta donde sabemos, no existe un protocolo establecido para citometría de flujo optogenético. Un procedimiento ampliamente aceptado es iluminar manualmente las células desde el exterior del tubo de reacción con dispositivos de linterna. Sin embargo, la iluminación en el manual de flujo requiere citómetro de que la luz pase a través del tubo de reacción y, por imágenes de células vivas, una forma cilíndrica, cámara de agua caliente. Esto hace que la dispersión de luz y sustancial pérdida de luz. Por otra parte, la intensidad de la luz proporcionada por la iluminación manual no es reproducible entre experimentos (ángulo, distancia, etc.) y hay un límite práctico para el número de longitudes de onda en un experimento.

Mediante la construcción del dispositivo de flujo Thermo LED, hemos sido capaces de superar estas limitaciones. Con este dispositivo, las células pueden ser iluminadas con longitudes de onda específicas en un tempratura controlada de forma durante las mediciones de citometría de flujo. Esto permite que las cantidades precisas y reproducibles de la luz dentro y entre los experimentos.

Para demostrar la utilidad de nuestro dispositivo in vivo, se registró la señal de fluorescencia de Dronpa en las células B Ramos durante photoswitching. células Ramos B se derivan de un linfoma de Burkitt humano. Dronpa es una proteína fluorescente que existe como un monómero, dímero o tetrámero. En su forma monomérica, es no fluorescente. Iluminación con luz de 400 nm induce la dimerización y tetramerización y hace que la proteína fluorescente Dronpa. Este proceso puede ser revertido por iluminación con luz de 500 nm. La proteína Dronpa se ha utilizado para controlar la función y la ubicación de las proteínas de señalización de 4,13.

Aquí, hemos expresado una proteína Dronpa engarce-Dronpa en las células B Ramos para estudiar photoswitching de Dronpa en un citómetro de flujo. El uso de nuestro dispositivo, hemos sido capaces de manera eficiente yreproducible PHOTOSWITCH Dronpa durante la grabación de su intensidad de fluorescencia en tiempo real. Este método ofrece ventajas sustanciales sobre los protocolos actuales de iluminación con la iluminación manual y amplía considerablemente el repertorio experimental para herramientas optogenética y compuestos jaula. El uso de nuestro dispositivo simplificará significativamente y acelerar el descubrimiento y desarrollo de nuevas herramientas optogenética.

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Protocolo

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1. El diseño y la construcción del artificio

  1. Los experimentos piloto
    NOTA: La intensidad de la luz requerida para un tipo de herramienta y células optogenético específico puede variar significativamente. Los experimentos piloto con prototipos son útiles para estimar la intensidad de luz mínima necesaria. La herramienta optogenético utilizado para los siguientes experimentos es una construcción de fusión Dronpa-Enlazador Dronpa. Se obtuvo la secuencia comercialmente Dronpa (Ver Lista de Materiales). A largo enlazador se clonó en entre dos secuencias Dronpa para permitir que el constructo expresado para formar dímeros intramoleculares (e intermoleculares). Los pasos descritos a continuación se pueden adaptar a muchas otras herramientas optogenética o sustancias ópticamente controladas.
    1. Transducir los linfocitos B Ramos con un constructo que contiene Dronpa-Enlazador Dronpa siguiendo las instrucciones del fabricante para la transducción utilizando el sobrenadante que contiene retroviral de células de empaquetamiento. Cosecha y celdas de conteo de acuerdo con un prepublicada riormente protocolo 13.
    2. Resuspender las células a una concentración de 1 x 10 6 / ml en medio (RPMI 1640, 10% FCS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol) y transferirlos a un tubo de FACS de vidrio.
    3. Insertar el tubo en un citómetro de flujo y medir la intensidad de fluorescencia de Dronpa (canal GFP) 14,15.
    4. Utilice gafas de protección para todas las medidas adicionales para proteger los ojos de longitudes de onda posiblemente perjudiciales.
    5. colocar manualmente una luz LED 500 nm en el exterior del tubo y continuar midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa.
    6. Aumentar el número y / o la intensidad de las luces LED hasta que la intensidad de fluorescencia Dronpa disminuye.
    7. colocar manualmente una luz LED 400 nm en el exterior del tubo y continuar midiendo la intensidad de fluorescencia de Dronpa.
    8. Aumentar el número y / o la intensidad de las luces LED hasta que el fluo Dronpacencia aumenta la intensidad.
    9. Utilice al menos tantas luces LED para la construcción del dispositivo como se prevé que sea necesario desde el photoswitching en los pasos 1.1.5 y 1.1.7.
  2. La construcción del dispositivo
    NOTA: El dispositivo fue construido por un taller de mecanizado profesional, el Arbeitsgruppe Technik de la Universidad de Friburgo. La mayoría de las piezas son hechas a medida y no está disponible comercialmente. Las dimensiones exactas de cada parte se representan en las figuras 1 y 2. Para aclarar el montaje de este dispositivo, complementaria de vídeo 1 se proporciona y los pasos más esenciales se describe a continuación.
    1. Molino pieza A partir de cloruro de polivinilo (PVC) con las medidas exactas que se muestran en la Figura 1A.
    2. Inserte las luces LED en los agujeros perforados de pieza A y cerrar cada agujero con pegamento para PVC para evitar fugas de agua.
    3. Conectar los LED a un transformador multicanal (cada longitud de onda debe ocupar un chann separadael) con una potencia de salida ajustable de 0-29 mA.
    4. Coloque la cubierta exterior (B) con 3 tornillos a la pieza A como se representa para proteger el LED contra daño físico.
    5. Para poder conectar el dispositivo a una bomba de agua, pegamento en los clips de tubo (C) en los agujeros perforados de pieza A (representada en la figura 1a, la sección transversal Y: 9 mm y 61,5 mm) con pegamento de PVC.
    6. Cortar un largo tubo de plexiglás 58,5 mm (D1).
    7. Fabricación piezas D2 y D3 de Plexiglas como se representa en la Figura 2.
    8. piece pegamento D3 de la parte inferior de D1 con Plexiglas pegamento.
    9. Adjuntar una junta tórica de caucho a la pieza D2 y péguelo en la parte superior de D1 con plexiglás pegamento.
      NOTA: Las piezas D1, D2 y D3 juntos forman pieza D.
    10. Insertar pieza D en la pieza A con 3 tornillos.
    11. Pruebe el dispositivo para la salida del agua antes de suministrar energía al transformador.

2. Medición de la cinética de una herramienta Optogenética

  1. preparar las células
    1. Cultura células Ramos B en RPMI-medio (RPMI 1640, 10% FCS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina y 50 mM 2-mercaptoetanol) a una densidad de 3- 10 x 10 6 células / ml a 37 ° C y 5% de CO2.
    2. Cosecha Ramos B células por centrifugación a 350 xg y 4 ° C durante 5 min.
    3. Recuento de células utilizando una cámara de recuento Neubauer siguientes instrucciones del fabricante y resuspender 1-5 x 10 6 células en 600 l de medio.
    4. Transferir las células a un tubo de vidrio de FACS, ponerlos en hielo y protegerlos de la luz hasta la medición.
  2. Preparar el citómetro de flujo y el dispositivo.
    1. Conectar el dispositivo a una bomba de agua caliente y ajustar la temperatura a 37 ° C.
    2. Cuando se utilizan tubos de FACS vidrio, intercambiar el negro junta tórica del citómetro de flujo con una junta tórica de caucho y, además, aplicar gr de siliciofacilitar.
  3. Medición
    1. Introduzca con cuidado el tubo de FACS de vidrio en el dispositivo y conectarlo con el citómetro de flujo (Figura 3).
    2. Iniciar la medición y registrar Dronpa intensidad fluorescente (GFP canal).
    3. Iluminar la muestra de células con 400 nm o 500 nm de luz, respectivamente, y registrar la intensidad de fluorescencia Dronpa (canal GFP).
  4. Análisis de los datos
    1. Analizar los datos experimentales con flujo adecuado citómetro de software. Gráfico de dispersión hacia adelante contra la dispersión lateral y la puerta de las células vivas. Trazar la intensidad de fluorescencia Dronpa lo largo del tiempo.

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Resultados

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Utilizando el flujo de Thermo LED con un citómetro de flujo

El núcleo funcional del dispositivo es una cámara cilíndrica en la que las luces LED están dispuestos en una forma circular que apunta hacia el interior. Esta cámara se puede conectar a un suministro de agua y la bomba, lo que permite controlar la temperatura de los LED, así como la muestra de células. Los LED están conectados a un transformador y, por tanto, la intensi...

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Discusión

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El flujo de Thermo LED es un dispositivo innovador para estudiar herramientas optogenética en un citómetro de flujo.

Hasta el momento, las muestras han sido optogenética sólo iluminada con rayos láser o dispositivos de microscopía linterna 11,12. Dependiendo del ángulo y la distancia de la linterna a la muestra, se espera que la variabilidad sustancial en la cantidad de iluminación entre los experimentos. Además, hay un límite en el número de linternas una sola persona puede opera...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos a J. Schmidt de la Universidad de Friburgo por construir el dispositivo. Agradecemos a P. Nielsen y D. Medgyesi por su apoyo y lectura crítica de este manuscrito. Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través de SFB746 y por la Iniciativa de Excelencia de la Fundación Alemana de Investigación (GSC-4, Spemann Graduate School).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de vidrio FACSThermo Fisher Scientific; Waltham, EE. UU.14-961-26Tubos de vidrio de borosilicato 12x75 mm
Citómetro de flujoBD Bioscienceg; Heidelberg, AlemaniaFortessa IIOrden Especial
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N Addgene; Cambridge, EE. UU.41645
PolyJetSignaGen, Rockville, EE. UU.SL100688
LED 505 nmAvago Technologies; Boeblingen, AlemaniaHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Technologies; Boeblingen, AlemaniaUV5TZ-400-15
Tubo de plexiglás 15 mmMaertin; Friburgo, Alemania76999
Plexiglás 3 mmMaertin; Friburgo, Alemania692230
Plexiglás 2,5 mmMaertin; Friburgo, Alemania692225
PlexiglásMaertin de 1,5 mm; Friburgo, Alemania692215
baldosa de PVC 5 mmMaertin; Friburgo, Alemania690020.005
Baldosa de PVC 6 mmMaertin; Friburgo, Alemania690020.006
Bloque de PVC 50 mmMaertin; Friburgo, Alemania690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemania61870-010
2-MercaptoetanolEMD; Alemania805740
FCSPAN Biotech; Aidenbach, AlemaniaP30-3302
Penicilina/Esttomicina (10.000 U/mL)Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemania15140-122
Pegamento de plexiglás AcrifixEvonic industries, Essen, Alemania1R0192
Pegamento Tangit PVC-UHenkel, Dü sseldorf, Alemania

Referencias

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