Las sustancias controladas ópticamente son herramientas poderosas para estudiar las vías de señalización. Para ampliar el espectro de posibles experimentos, desarrollamos un dispositivo para estudiar sustancias controladas ópticamente en tiempo real mediante citometría de flujo: el LED Thermo Flow.
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Artículo de método
Thermo LED Flujo - Combinando optogenética con Citometría de Flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
Las herramientas optogenéticas permiten investigaciones aisladas y funcionales de casi cualquier molécula de señalización dentro de vías de señalización complejas. Un obstáculo importante es la entrega controlada de luz a la muestra celular y, por lo tanto, las herramientas más populares para los estudios optogenéticos son los análisis celulares basados en microscopía y los experimentos in vitro. El citómetro de flujo tiene grandes ventajas sobre un microscopio, incluida la capacidad de medir rápidamente miles de células con una resolución de una sola célula. Sin embargo, aún no se utiliza ampliamente en optogenética. Aquí, presentamos un dispositivo que combina el poder de la optogenética y la citometría de flujo: el LED Thermo Flow. Este dispositivo ilumina las células a longitudes de onda, intensidades de luz y temperaturas específicas durante las mediciones de citometría de flujo. Se puede construir a bajo costo y se puede utilizar con los citómetros de flujo más comunes. Para demostrar su utilidad, caracterizamos la cinética de fotoconmutación de proteínas Dronpa in vivo y en tiempo real. Este protocolo se puede adaptar a casi todas las sustancias ópticamente controladas y amplía sustancialmente el conjunto de posibles experimentos. Y lo que es más importante, simplificará en gran medida el descubrimiento y el desarrollo de nuevas herramientas optogenéticas.
Introducción
Herramientas Optogenética han ido ganando popularidad, en parte debido a que se pueden utilizar para descifrar el cableado de las vías de señalización de 1-4. Se basan en la capacidad de las proteínas fotoactivables para cambiar su conformación y de unión por afinidad cuando se ilumina con la luz. La fusión de estas proteínas a los elementos de señalización permite la regulación específica de un solo jugador dentro de complejas vías de señalización intracelular 5-12. Por consiguiente, una vía de señalización puede ser estudiado con alta resolución temporal y espacial.
La mayoría de los estudios optogenética basados e....
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Protocolo
1. El diseño y la construcción del artificio
- Los experimentos piloto
NOTA: La intensidad de la luz requerida para un tipo de herramienta y células optogenético específico puede variar significativamente. Los experimentos piloto con prototipos son útiles para estimar la intensidad de luz mínima necesaria. La herramienta optogenético utilizado para los siguientes experimentos es una construcción de fusión Dronpa-Enlazador Dronpa. Se obtuvo la secuencia comercialmente Dronpa (Ver Lista de Materiales). A largo enlazador se clonó en entre dos secuencias Dronpa para permitir que el constructo expresado para formar dímeros intramoleculares....
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Resultados
Utilizando el flujo de Thermo LED con un citómetro de flujo
El núcleo funcional del dispositivo es una cámara cilíndrica en la que las luces LED están dispuestos en una forma circular que apunta hacia el interior. Esta cámara se puede conectar a un suministro de agua y la bomba, lo que permite controlar la temperatura de los LED, así como la muestra de células. Los LED están conectados a un transformador y, por tanto, la intensi.......
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Discusión
El flujo de Thermo LED es un dispositivo innovador para estudiar herramientas optogenética en un citómetro de flujo.
Hasta el momento, las muestras han sido optogenética sólo iluminada con rayos láser o dispositivos de microscopía linterna 11,12. Dependiendo del ángulo y la distancia de la linterna a la muestra, se espera que la variabilidad sustancial en la cantidad de iluminación entre los experimentos. Además, hay un límite en el número de linternas una sola persona puede opera.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a J. Schmidt de la Universidad de Friburgo por construir el dispositivo. Agradecemos a P. Nielsen y D. Medgyesi por su apoyo y lectura crítica de este manuscrito. Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través de SFB746 y por la Iniciativa de Excelencia de la Fundación Alemana de Investigación (GSC-4, Spemann Graduate School).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de vidrio FACS | Thermo Fisher Scientific; Waltham, EE. UU. | 14-961-26 | Tubos de vidrio de borosilicato 12x75 mm |
| Citómetro de flujo | BD Bioscienceg; Heidelberg, Alemania | Fortessa II | Orden Especial |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N Addgene | ; Cambridge, EE. UU. | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, EE. UU. | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Alemania | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Alemania | UV5TZ-400-15 | |
| Tubo de plexiglás 15 mm | Maertin; Friburgo, Alemania | 76999 | |
| Plexiglás 3 mm | Maertin; Friburgo, Alemania | 692230 | |
| Plexiglás 2,5 mm | Maertin; Friburgo, Alemania | 692225 | |
| Plexiglás | Maertin de 1,5 mm; Friburgo, Alemania | 692215 | |
| baldosa de PVC 5 mm | Maertin; Friburgo, Alemania | 690020.005 | |
| Baldosa de PVC 6 mm | Maertin; Friburgo, Alemania | 690020.006 | |
| Bloque de PVC 50 mm | Maertin; Friburgo, Alemania | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemania | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoetanol | EMD; Alemania | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Alemania | P30-3302 | |
| Penicilina/Esttomicina (10.000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemania | 15140-122 | |
| Pegamento de plexiglás Acrifix | Evonic industries, Essen, Alemania | 1R0192 | |
| Pegamento Tangit PVC-U | Henkel, Dü sseldorf, Alemania |
Referencias
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Wein....
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Reimpresiones y permisos
