Artículo de método

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

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DOI:

10.3791/54710

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25 de enero de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Immunoregulation, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

Describimos aquí un modelo de ratón reportero transgénico para visualizar las células productoras de IL-22 dentro de diferentes tejidos de ratón. Este método se puede utilizar para rastrear la ubicación de otras citocinas o proteínas secretaria en el ratón.

Resumen

reportero ratones han sido ampliamente utilizados para observar la localización de la expresión de determinados genes. Este protocolo se centra en una estrategia para establecer un nuevo modelo de ratón transgénico reportero. Elegimos para visualizar la expresión de genes de interleucina (IL) 22, porque esta citocina tiene actividades importantes en el intestino, donde contribuye a reparar los tejidos dañados por la inflamación. Los sistemas indicadores ofrecen considerables ventajas sobre otros métodos de identificación de productos en vivo. En el caso de IL-22, otros estudios habían aislado primero las células de los tejidos y luego se volvieron a estimular las células in vitro. IL-22, que normalmente se secreta, estaba atrapado dentro de las células usando un fármaco, y la tinción intracelular se utiliza para visualizar la misma. Este método identifica células capaces de producir IL-22, pero no determina si lo hacían en vivo. El diseño reportero incluye la inserción de un gen de una proteína fluorescente (tdTomato) en el gen IL-22 en un wa talesy que la proteína fluorescente no puede ser secretada y por lo tanto permanece atrapado dentro de las células productoras en vivo. Productores fluorescentes pueden ser visualizados en secciones de tejido o por análisis ex vivo a través de citometría de flujo. El proceso de construcción real para el reportero incluido recombinería un cromosoma artificial bacteriano que contenía el gen de IL-22. Se introdujo entonces este cromosoma por ingeniería genética en el genoma del ratón. IL-22 expresión reportero homeostático se observó en diferentes tejidos de ratón, incluyendo el bazo, timo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, y el intestino, por citometría de flujo análisis. La colitis se indujo mediante la transferencia de células T (CD4 + CD45RBhigh), y la expresión del indicador se visualizó. células T positivos fueron primero presente en los ganglios linfáticos mesentéricos, y luego se acumulan dentro de la lámina propia de los pequeños tejidos delgado y el colon distal. La estrategia de usar BAC dio expresión del indicador buena fidelidad en comparación con IL-22 expresSion, y es más simple que los procedimientos de knock-in.

Introducción

Celular de expresión de tipo específico de genes informadores es útil para identificar células que expresan activamente el objetivo en los tejidos debajo de estados homeostáticos y perturbados. También permite la purificación de estas células, que se mantienen viables, para estudiar sus otras propiedades. reportero ratones se han utilizado para elucidar el mecanismo de acción de citoquinas específicas, factores de transcripción, y elementos reguladores. Estrategias anteriores 1, 2, 3 se han basado en gran medida en golpear el reportero en el locus diana en el cromosoma de ratón, un procedimiento que consume tiempo y costoso. Por lo tanto, un método más simple para la generación de ratones reportero es deseable.

Las citoquinas son una amplia clase de pequeñas, proteínas secretadas / péptidos que regulan la respuesta inmune a través de la señalización intercelular. La interleucina 22 (IL-22) es una citoquina con muchas actividades reportados, incluyendo fu barreranción, reparación de tejidos, la inflamación y 4. Aunque la IL-22 se descubrió inicialmente como un producto de las células T 5, los informes posteriores demostraron su expresión en las células asesinas naturales (NK) en los seres humanos y los ratones 6 7 y en otras clases de linfocitos innatas 8. A pesar de una extensa observación de las células productoras-22 IL, visualización de la IL-22 se requería previamente la estimulación ex vivo y permeabilización a las manchas con anticuerpos. Por lo tanto, la novela de IL-22 reportero ratones serían una herramienta muy útil para investigar la función de IL-22 en los procesos homeostáticos y patógenos.

Aquí, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico reportero simplificada para observar las células IL-22-que producen in vivo e in vitro. El uso de un método de BAC recombinería 9, insertamos la secuencia de ADNc tdTomato con poli A fragmentos de señal en el loc IL-22nosotros y reemplazado exón 1. Las otras regiones, los exones, y elementos reguladores sin traducir no fueron perturbados, ya que nos gustaría imitar la regulación natural de la IL-22 tanto como sea posible. El sitio de inserción reportero interrumpe la secuencia señal, lo que resulta en la acumulación de la reportera en el interior de las células que producen, a diferencia de IL-22 en sí, que es secretada rápidamente. Este nuevo método puede aplicarse también a la generación de ratones reportero de otras proteínas secretadas.

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Protocolo

Todos los animales recibieron la atención adecuada de acuerdo con los procedimientos experimentales descritos en la Guía 2011 para Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio Comité del Laboratorio Nacional de Investigación del Cáncer de Frederick.

1. Generación de IL-22-tdTomato reportero ratones por BAC Recombinería

NOTA: Los ratones deben estar inconsciente y no se mueven en respuesta a un estímulo nocivo. Esterilizar el área quirúrgica con 70% de etanol y esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos utilizando un esterilizador de perlas de vidrio.

  1. Purificar el ADN de BAC (RP23-401E11, longitud clon 228391 bps) utilizando un método de extracción alcalina 10, 11. Caracterizar el clon BAC por digestión SpeI de 5 g de RP23-401E11 para confirmar el tamaño correcto del gen diana. NOTA: El ADN de BAC se digirió en 14 fragmentos.
  2. Insertar el gen reportero tdTomato en el sitio Not I / Sal I del vector lanzadera PLD53SC-A-GFP-B11 y reemplazar el gen GFP en el mismo sitio. Luego, utilizando RP23-401E11 BAC como plantilla, amplificar las cajas de homología (A y B) para el primer exón traducido de Il-22 (exón 1) por PCR (95 ° C 2 min; 30 ciclos de 95 ° C para 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 30 seg, y una extensión final a 72 ° C durante 10 min). En un sistema de reacción de PCR 50 l, añadir 50 ng (1 l) de BAC de ADN, 0,5 l de cebadores (10 mM), 40 l de PCR Supermix de alta fidelidad, y 8 l de H 2 O.
    NOTA: Los cebadores para las cajas A y B son los siguientes: Un cuadro adelante: 5'-T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG y retroceso: 5'-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B Caja adelante: 5'-G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA y retroceso: 5'-T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Los sitios de las enzimas de restricción (Asc I y Pac I) están subrayados.
  3. Ligar 500 ng de digerido con Asc A y 500 ng de Fragm B digerido con Pacentos en 50 ng de PLD53SC-ATB (tdTomato) vectores a 16 ° C durante 1 hora.
  4. Transformar el vector PLD53SC-ATB purificada en células Bac-competente 11 y cultura ellos en Luria-Bertani (LB) placas de agar con cloranfenicol (20 mg / ml) y ampicilina (30 mg / ml) a 37 ° C. Escoja dos o tres colonias de co-integración de las placas maestras de Ch / Amp.
  5. Inocular cada colonia en 1 ml de LB suplementado con 20 g de cloranfenicol / ml y se incuba ellos durante 1 hora a 37 ° C y 225 rpm. Extender 100 l de cada mezcla en una placa de LB-agar (10 g de peptona 140, 5 g de extracto de levadura, 12 g de agar, y 1 L de agua; pH 7,5) suplementado con cloranfenicol y 4-4,5% de sacarosa. Incubar el cultivo durante la noche a 37 ° C.
  6. Recoger ambas colonias grandes y pequeños y replate ellos en dos placas de agar LB con cloranfenicol. A continuación, se exponen las placas ya sea con o sin luz UV durante 30 segundos y recoger las colonias sensibles a UV para su posterior análisis.
  7. Identificar el ADN de BAC modificado por PCR utilizando tdTomato / IL-22 imprimación heterocigóticos (adelante: 5 'ACT TGT GCG ATC GAT TCT GGT; inverso: 5' TGT TGT AAT Cgg ggA Cgg C). Las condiciones del termociclador son las siguientes: 95 ° C durante 2 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 56 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 30 s; y una extensión final a 72 ° C durante 10 min.
  8. Confirmar la secuencia de la zona modificada del BAC BAC por secuenciación directa de gran prep BAC ADN 12.
  9. Anestesiar un ratón receptor con una dosis de 0,25% tribromoetanol en la cavidad peritoneal cuando la implantación de los cigotos microinyectados en ratones / 6c C57BL pseudo embarazada.
  10. Linealizar el IL-22-tdTomato BAC construir (10 g) mediante digestión con 5 l de restricción endonucleasePi-SceI en 100 l de sistema de reacción y microinyectar el ADN BAC linealizado en huevos fertilizados de ratones C57BL / 6 hembras en la etapa pronuclear 13. screen los ratones transgénicos mediante análisis de transferencia Southern de ADN aislado a partir de biopsias de la cola utilizando procedimientos estándar.

2. Preparación de celda única a partir de bazos, el timo, los ganglios linfáticos y los parches de Peyer

NOTA: reportero ratones IL-22-tdTomato se mantuvieron en el Instituto Nacional del Cáncer (NCI, Frederick, MD). El método de eutanasia se ajusta a las directrices más recientes AVMA sobre la eutanasia. Todos los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2 14.

  1. La eutanasia a un IL-22-tdTomato ratón en una cámara de CO 2 y lo puso en una almohadilla limpia. Esterilizar la piel del abdomen mediante pulverización 70% de alcohol y lo abrió. Extirpar el bazo en el flanco izquierdo y el timo detrás del esternón.
  2. Para cosechar los nodos mesentericlymph (ubicada en el tejido mesentérico) y las placas de Peyer (pequeños lymphoidnodules en toda la región del íleon del intestino delgado), tomar la mesentérica blanco nacarado de nodos cerca dque la pared del intestino delgado mediante la disección fórceps con puntas de punta fina dentados primero y luego eliminar todo el intestino delgado y el colon fuera del cuerpo. Encuentra los parches ovales extendidos (placas de Peyer) a lo largo del intestino y se cortan con tijeras. Moler estos tejidos linfoides (ganglios linfáticos y los parches de Peyer) individualmente entre dos portaobjetos esmerilados en una suspensión de una sola célula en / 1% de suero bovino fetal PBS (FBS) de tampón en hielo.
  3. Picar el bazo o el timo tejidos utilizando el mismo método que en el paso 2.2. Se centrifuga la suspensión esplénica durante 8 minutos a 500 x g y 4 ° C. Añadir 1 ml de tampón de lisis ACK por bazo a los sedimentos celulares.
  4. Mezclar bien y dejar reposar durante 1 minuto. Añadir 9 ml de tampón de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) a cada muestra. Centrifugar por centrifugación durante 8 minutos a 500 xg y 4 ° C para eliminar las células rojas de la sangre.
    NOTA: No añadir tampón de lisis ACK a las células del timo.
  5. Resuspender los leucocitos resultantes en 5 ml de PBS y pass las células a través de un filtro de células de 100 micras. Recoger los sedimentos celulares por centrifugación a 500 xg durante 8 min.
  6. Resuspender las células en 5 ml de medio RPMI o tampón FACS y contar las células viables utilizando solución de 0,4% de azul tripan colorante / PBS.

3. Aislamiento de intraepitelial linfocitos y células de la lámina propia de los intestinos

  1. Abra la piel del abdomen como en el paso 2.1, cortar el intestino delgado, desde el duodeno (próxima al estómago) para íleon (cerca del apéndice), y todo el colon, justo por encima del ano. Quitar el tejido adiposo extra y el uso de fórceps mesentéricas. Ponga los intestinos de inmediato en helado de PBS.
  2. Busque las placas de Peyer, nódulos (en bruto pequeños) a lo largo de la región distal del intestino delgado. Retire las masas mediante el uso de fórceps andopen el intestino longitudinalmente con unas tijeras. A fondo lavar el intestino con 10 ml de PBS enfriado en hielo.
  3. Incubar los tejidos en 20 ml de tampón de pre-digestión (mM EDTA 5y ditiotreitol 1 mM en solución salina equilibrada de Hank (HBSS)) durante 30 min a 37 ° C con rotación lenta (50 rpm) en un agitador. Después de cada una de las incubaciones 2, eliminar la capa de células epiteliales, que contiene los linfocitos intraepiteliales (IEL), mediante agitación intensa (30 segundos a 12.000 rpm) y pasar todos los tejidos a través de un filtro de células de 100 micras.
  4. Añadir 20 ml de solución de EDTA nuevo al tejido para segunda incubación de 30 min a 37 ° C. Pasar las fracciones de IEL a través de un filtro de células de 100 micras y poner en común con las fracciones anteriores. Mantenga los fragmentos restantes del intestino en el hielo se va a tratar en el paso 3.9.
  5. Centrifugar las fracciones agrupadas IEL a 800 xg durante 5 min a 4 ° C. Se lavan las fracciones agrupadas IEL con 10 ml de HBSS / FBS al 5% y girar hacia abajo durante 5 minutos a 800 x g y 4 ° C.
  6. Resuspender las células en 8 ml de medio de 44% de sílice coloidal 15 y revestirlos de medio sílice coloidal 5 ml de 67%. Centrifugar el 44% / 670,5% gradiente de mezcla de células durante 20 min a temperatura ambiente y 1.500 x g.
  7. Recoger las células IEL de la banda en la interfase. En primer lugar, eliminar la capa superior del sobrenadante (aproximadamente 5 ml) usando 1 ml de la pipeta. Entonces va a componer la cosecha en la interfase del gradiente medio de sílice coloidal.
  8. Lavar los IELs mediante la adición de 10 ml de medio RPMI. Girar las células hacia abajo durante 5 minutos a 800 x g y 4 ° C. Volver a suspender las IELs en 5 ml de RPMI para el paso de 3.15.
  9. Para el aislamiento de los linfocitos de la lámina propia (LPL), pelos en los fragmentos de tejido delgado de la etapa 3.4 en trozos pequeños con tijeras (1 mm) y digerir las piezas con 10 ml de tampón de digestión (0,05 g de colagenasa, 0,05 g de ADNasa I, y 0,3 g de dispasa II en RPMI / FBS al 5%) durante 15-20 min a 37 ° C.
  10. Se filtra la mezcla a través de un filtro de células de 70 micras. El sobrenadante de flujo continuo contiene la LPL en libertad.
  11. Totalmente digerir los fragmentos de intestino repitiendo los pasos 3.9 hasta 3.10 (normalmente, deben estarrepetido 3 veces). Cada vez, agrupar los sobrenadantes que contienen la LPL.
  12. Recoger las células por centrifugación durante 5 min a 1500 xg y la temperatura ambiente y volver a suspender los gránulos en RPMI / FBS al 5%. Pasarlos a través de un filtro de células de 40 micras.
  13. Resuspender los sedimentos celulares en 10 ml de la fracción 40% de un medio de gradiente de 40:80 de sílice coloidal y superponer ellos en 5 ml de la fracción de 80% en un tubo de 15 ml.
  14. Realizar la separación en gradiente de densidad por centrifugación durante 20 min a 1.500 xg y la temperatura ambiente 15.
  15. Recoger la LPL, como se describe en el paso 3.7. Lavarlos una vez con 10 ml de PBS y resuspender las pastillas en 1 ml de / 1% de FBS medio PBS o tampón RPMI.
  16. Contar las células viables (tanto IELS y LPLS) utilizando solución al 0,4% de colorante azul de tripano / PBS.

4. Expresión de IL-22-tdTomato en la colitis

  1. Preparar suspensiones de células de bazo de los ratones individuales IL-22-tdTomato a una concentración de 1 x 10 7 células / ml en PBS estéril, como se describe en los pasos 2.1-2.4.
  2. Purificar las células T CD4 + utilizando el Método de aislamiento negativo ratón CD4 de la célula 10. Etiquetar con anti-CD4-APC (clon RM4-5, 0,5 l / 1 x 10 6 células en PBS / 1% de tampón FBS) y anti-CD45RB-FITC (clon 16A, 0,5 l / 1 x 10 6 células en PBS tampón FBS / 1%) por incubación a 4 ° C durante 30 min.
  3. Girar las células hacia abajo durante 5 minutos a 500 x g y 4 ° C. Lavar las células con 2 ml de tampón de PBS / 1% de FBS y resuspender en 1 ml de tampón de tinción FBS PBS / 1%.
  4. Ejecutar las células T marcadas en una máquina de citometría de flujo 16. Puerta de las células en una población de células T y ordenar las células doble positivas altas CD4 + CD45RB (la longitud de onda detectada a 488 nm y 633 nm) láseres.
  5. Recoger las células clasificadas por centrifugación durante 5 min a 500 xg y 4 ° C. Resuspender los sedimentos celulares en tampón de PBS estéril a 1 x 10 6 células / ml. Inyectar las células (0,5 x 10 6) en el peritoneo ofeach Rag1 - ratón receptor - /.
  6. Sacrificar los ratones receptores menores de CO 2 en diversos puntos temporales. Cosechar los nódulos linfáticos mesentéricos y los intestinos delgado y grueso, como se describe en los pasos 2.1 y 2.2. Ponga cada ganglio linfático mesentérico y cut-open delgado (papel / delgado / papel sándwich) en 4% de paraformaldehído (PFA; manejar bajo una campana de extracción) durante la noche para reparar los tejidos. Vuelva a colocar la PFA con un 18% de sacarosa durante 16-24 horas y luego congelar los tejidos para seccionar.
  7. Utilice la máquina criostato para cortar el tejido 17, 18, 19. Calentar las secciones de tejido a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 min y colocarlos en acetona durante 10 min a temperatura ambiente. Secarlos a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos.
  8. Añadir FBS en exceso, y eliminar mediante una pipeta, y añadir anti-RFP en una proporción 1: 200 dilución de BSA en 0,1% / 1x PBS. Incubar el anticuerpo a 37 ° C durante 60 min.
  9. Enjuagar las secciones en 1X PBS durante 10 minutos y se aplica el anticuerpo secundario correspondiente (de cabra anti-conejo 568) para el tejido, se diluyó 1: 300 en 1% BSA / 1 x PBS, por 30 min a temperatura ambiente.
  10. Se lavan los portas en 1X PBS durante 10 min, séquelos, y añadir cubreobjetos.
  11. Visualizar todas las muestras con un microscopio de fluorescencia bajo iluminación constante (RFP: 540-580 nm filtro de excitación) con el objetivo de 40X.

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Resultados

A murino IL-22 transgén reportero se ha creado usando recombinería para modificar un cromosoma artificial bacteriano que lleva el locus de IL-22. La figura 1 muestra un diagrama de vector que contiene el gen pBACe3.6 sacBII, un marcador de selección de positivo, y el gen de resistencia a cloranfenicol antibiótico 11. Después de la introducción de tdTomato en el exón 1, la secuencia de péptido señal fue interrumpido, como se muestra en la ...

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Discusión

IL-22 juega un papel esencial en la defensa innata y tejido huésped remodelación. Células-22 productoras de IL han identificado ex vivo mediante tinción intracelular. Sin embargo, sigue siendo difícil de rastrear la expresión de IL-22 in situ, ya sea en el estado normal o en condiciones inflamatorias. Este protocolo describe un nuevo método para desarrollar un IL-22 reportero modelo de ratón, lo que nos permite localizar las células indicadoras que expresan in vivo. El gen informador codifica ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Kelli Czarra y Megan Karwan por la asistencia técnica con animales, a Kathleen Noer y Roberta Matthai por su asistencia en citometría de flujo, y a Donna Butcher y Miriam R. Anver por el análisis de patología. Este proyecto fue apoyado por una subvención de la Fundación Ely y Edythe Broad (a Scott Durum) y ha sido financiado en su totalidad o en parte con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. HHSN261200800001E (ARM).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RP23-401E11BAC Thermo Fisher ScientificRPCI23. CNecesita identificación del gen: 50929
NucleoBond BAC 100Takara Clontech740579
PCR SuperMix de alta fidelidadThermo Fisher Scientific10790020
PI-SceINew England BiolabsR0696S
SpeINew England BiolabsR0133S
LB CaldoThermo Fisher Scientific10855-0011 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Extracto de Levadura, 5 g de cloruro de sodio 
Anti-ratón CD3eBioscience11-0031
Anti-ratón CD4eBioscience17-0041
Anti-ratón CD45Thermo Fisher ScientificMCD4530
Anti-ratón CD45RBeBioscience11-0455
Anti-ratón RFPAbcamAb62341
HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin fenol rojoThermo Fisher Scientific14175145KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucosa
Dnase IRoche10104159001
Tampón de lisado ACKThermo Fisher ScientificA1049201
PercollGE ciencias de la vida para la salud17-0891-01
Colagenasa DRoche11088858001
Dispasa II (proteasa neutra, grado II)Roche4942078001
IX70 Microscopio de fluorescencia invertidaOlympusSolicitar presupuesto
Microscopio Nikon Eclipse 80iNikonSolicitar presupuesto
Agitador dinalMicroscopía electrónica Science61050-10
FACSAriaBD BioscienceSolicitar presupuesto
LSRII SORP/citometría de flujoBecton, Dickinson and Company Pedir presupuesto

Referencias

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