El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Los tampones y técnica quirúrgica se describen en detalle.
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Artículo de método
La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Este es un requisito previo para el estudio de la fisiología del órgano aislado y para muchas aplicaciones innovadoras que pueden ser posibles en el futuro, incluyendo descelularización la perfusión de bioingeniería renal o la administración de anti-rechazo o drogas genoma de edición en altas dosis para cebar el riñón para el trasplante. Durante el tiempo de la perfusión, el riñón puede ser manipulado, la función renal puede ser evaluada, y diversos productos farmacéuticos administrado. Después del procedimiento, el riñón puede ser trasplantado o tratados con la biología molecular, análisis bioquímicos, o microscopía.
Este artículo describe el líquido de perfusión y la técnica quirúrgica necesaria para la perfusión ex vivo de los riñones de ratones. Los detalles del aparato de perfusión y se dan los datos se presentan mostrando la vESPONSABILIDAD de la preparación del riñón: el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, y de orina de datos como, micrografías electrónicas de transmisión funcionales de los diferentes segmentos de la nefrona como lecturas morfológicas, y transferencias Western de las proteínas de transporte de los diferentes segmentos de la nefrona como lectura molecular.
Introducción
La perfusión aislada de órganos ha sido objeto de un esfuerzo continuo entre los fisiólogos durante muchas décadas 1. La técnica permite la función del órgano, sin influencias sistémicas como la hipertensión arterial, las hormonas, o los nervios, para ser estudiado. Carl Eduard Loebell se considera que es el primero que ha descrito la perfusión con éxito de un riñón aislado, en 1849 2. Desde entonces, el aparato de perfusión ha sufrido refinamiento significativo. Frey y Gruber introdujeron un pulmón artificial para las bombas de oxigenación y perfusión continua para pulsátiles 2. Mientras que los primeros investigadores estudiaron pri....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con la legislación suiza y aprobados por la administración veterinaria del Cantón de Zurich, Suiza.
1. tampón de preparación de
- Preparar soluciones de 1 - 4 y la solución de la hormona antidiurética (ADH) (Tabla 1).
- Preparar el tampón de diálisis (Tabla 1).
NOTA: Este es el tampón utilizado como el tampón de diálisis durante la perfusión. Más tarde, los eritrocitos se diluyeron en este tampón para formar el líquido de perfusión final. - preparado de eritrocitos.
- Diluir 2....
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Resultados
Con el método descrito, aislados riñones de ratón pueden permanecer viables durante al menos 1 hr. Hemos probado la viabilidad del tejido después de 1 hora de perfusión continua con el funcional (flujo sanguíneo renal y la resistencia vascular, el análisis de gases en sangre del flujo venoso, la tasa de filtración glomerular, urinaria fraccional de Na + y K + excreción, y la osmolaridad urinaria) y morfológica (electrónica de transmisión microscopía, TEM).......
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Discusión
El ratón aislados del riñón perfundido es una herramienta para el estudio de la función renal en un ambiente controlado ex vivo durante 1 hora, reduciendo la brecha entre los experimentos in vivo en animales intactos, lo que puede ser defectuoso por el impacto de numerosos factores sistémicos, y los experimentos in vitro en segmentos de la nefrona aisladas o células cultivadas, lo que necesariamente descuidar el impacto de la estructura de los órganos intactos en la función. Hay, al c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos y nada más que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Hans-Joachim Schurek por sus valiosos consejos científicos. Los autores desean agradecer a Monique Carrel y Michèle Heidemeyer por su excelente asistencia técnica, a David Penton Ribas y Nourdine Faresse por la lectura crítica del manuscrito y a Carsten Wagner y Jürg Biber por el anticuerpo NaPi-2a. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional Suizo para la Competencia en Investigación "Kidney.CH" y por una subvención de proyecto (310030_143929/1) de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Circuito de perfusión: | |||
| Cámara húmeda 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular con cesta y puerto lateral | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Termostato TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Bomba de rodillos Reglo | Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Depósito encamisado para solución tampón 1 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Depósito encamisado para solución tampón 0,5 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Transductor de presión APT300 | Aparato de Harvard/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| Transductor TAM-D Plugsys | Aparato de Harvard/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Servocontrolador Plugsys | Aparato de Harvard/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| Adquisición de datos HSE-USB | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Dializador de bajo flujo Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE Tubo para canulación de aorta 1,19 mm de diámetro interno x 1,70 mm de diámetro exterior | Materias Primas Científicas Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Reactivos tampón: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Ácido glutámico sal monosódica hidrato | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| Ácido L-(-)-Málico sal sódica | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodio-L-Lactato | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| ácido alfa-cetoglutárico sal sódica | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinina | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicilina | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haë n | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Hormona antidiurética dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulina | Sigma-Aldrich Filtro Sigma-Aldrich | ||
| utilizado para la filtración de eritrocitos | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Análisis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Microscopio electrónico: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
Referencias
- Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
- Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
- Nizet, A.
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Reimpresiones y permisos
