La interposición de la vena del modelo: un modelo adecuado para estudiar la permeabilidad del injerto de bypass

Summary

Este video muestra un modelo para estudiar el desarrollo de la hiperplasia miointimal después de la cirugía de interposición venosa en ratas.

Abstract

El injerto de derivación es un método de tratamiento establecido para la enfermedad de las arterias coronarias. La permeabilidad del injerto sigue siendo el talón de Aquiles de los injertos de vena safena. Los modelos de investigación para el fracaso del injerto de derivación son esenciales para una mejor comprensión de los procesos patobiológicos y fisiopatológicos durante la pérdida de permeabilidad del injerto. Los modelos animales grandes, como los cerdos o las ovejas, se asemejan a las estructuras anatómicas humanas, pero requieren instalaciones y equipos especiales. Este video describe un modelo de interposición de venas de rata para investigar la pérdida de permeabilidad del injerto de vena. Las ratas son baratas y fáciles de manejar. En comparación con los modelos de ratón, el tamaño conveniente de las ratas permite una mejor operatividad y permite obtener una cantidad suficiente de material para análisis más diversos. En resumen, se extrae la vena epigástrica inferior de una rata donante y se utiliza para reemplazar un segmento de la arteria femoral. La anastomosis se lleva a cabo a través de puntos individuales y se sella con cola de fibrina. La permeabilidad del injerto se puede monitorizar de forma no invasiva mediante ecografía dúplex. La hiperplasia miointimal, que es la principal causa de pérdida de permeabilidad del injerto, se desarrolla progresivamente con el tiempo y puede calcularse a partir de cortes transversales histológicos.

Introduction

enfermedades de las arterias coronarias y sus complicaciones se encuentran entre las principales causas de muerte en todo el mundo. estrategias terapéuticas actuales se centran en restablecer el flujo de sangre, ya sea mediante la dilatación del vaso estrechado o mediante la creación de un bypass. Cirugía de revascularización coronaria (CABG) usando autoinjertos venosos fue descrita por primera vez en 1968 y ha sido perfeccionado a lo largo de los años. Aparte de la revascularización de la arteria descendente anterior coronaria, conductos de vena safena son los más utilizados ^1. Sin embargo, la permeabilidad del injerto sigue siendo el talón de Aquiles de los injertos de vena safena (SVG). Un año después de la cirugía, la permeabilidad del injerto es del 85%, cayendo a 61% después de diez años ^2,3. Revelando los mecanismos fisiopatológicos y las causas de la pérdida de la permeabilidad SVG, por tanto, es una tarea importante.

Este video muestra una vena modelo de interposición de rata para investigar la pérdida del injerto de vena. Los objetivos generales de este método son para explorar la patobiológico subyacentey los procesos -physiological durante la progresión de la enfermedad y para desarrollar un modelo adecuado para las pruebas de opción terapéutica de drogas o. Mediante el trasplante de la vena epigástrica superficial en el sistema arterial, este modelo imita el entorno clínico de cirugía de revascularización coronaria. El trauma quirúrgico, la isquemia y el estrés de la pared son desencadenantes importantes de los cambios vasculares patológicas y son imitados en el modelo descrito.

Diferentes modelos y especies están disponibles para investigar la pérdida de la permeabilidad del injerto de vena. Modelos animales grandes, tales como cerdos, ovejas ^{4 5 6,} perros, monos y ^7, se asemejan vehículo humano y las estructuras anatómicas, permitiendo así controlar estrategias terapéuticas complejas, tales como la colocación de stents bypass o nuevas técnicas quirúrgicas, que se probarán ^8. Sin embargo, se requieren especial de vivienda, equipamiento y personal. Además, los altos costos y la necesidad de un anestesista adicional durante la cirugía impiden su aplicación más amplia. smtodos los animales, incluyendo ratas, son fáciles de manejar, no requieren especial de vivienda, y tienen costos manejables. En comparación con los modelos de ratón ^9,10, modelos de rata tienen la ventaja de una mejor capacidad de funcionamiento y por lo tanto menos variabilidad en el resultado. Las ratas son fisiológicamente y genéticamente más similares a los humanos que los ratones ^11,12. Además, la mayoría de los ratones de tipo salvaje sólo se desarrollan myointima limitada ^13, que crea modelos de ratones propensos a errores de tipo II. La histología de las principales venas del ratón, como la vena cava inferior, sólo se compone de unas pocas capas de células y hace difícil la evaluación temprana ^13. Una desventaja adicional es la pequeña cantidad de tejido disponible para su posterior análisis después de la recuperación del injerto.

El modelo descrito en este video es reproducible, barato, y fácil de realizar, y se puede establecer de forma rápida y fiable. Es especialmente adecuado para la evaluación de agentes terapéuticos experimentales caros, tales como vectores viralespara la terapia génica, de una manera económica.

Protocol

Los animales recibieron atención humanitaria de conformidad con la Guía para los Principios de Animales de Laboratorio, preparado por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y publicadas por los Institutos Nacionales de Salud. Todos los animales protocolos fueron aprobados por la autoridad local responsable ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Oficina para la Salud y Protección del Consumidor) Hamburgo").

1. Cuidado de Animales

1. Obtener ratas ratas Lewis (LEW / Crl) y ratas transgénicas ROSA / luciferasa-LEW un peso de 300-350 g en el Instituto de Animales de Laboratorio.
2. Mantenga las ratas bajo condiciones convencionales en armarios ventilados y alimentarlos con pienso estándar para ratas y tratado en autoclave agua ad libitum.
3. Realizar un trasplante de injerto utilizando las ratas transgénicas ROSA / luciferasa-ASE como los donantes y las ratas singénicas ASE / Crl como los destinatarios.

2. Preparación de la rata donante

1. Use un inductcámara de iones para anestesiar una rata con isoflurano (2,5-3%).
2. Coloque la rata en su parte posterior y mantener la anestesia con una facial que cubra la boca y la nariz. Compruebe si hay suficiente profundidad de la anestesia pellizcando las patas traseras y la verificación de la ausencia de reflejos. Aplicar un poco de ungüento veterinario para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
3. Abra las patas traseras y fijar su posición utilizando cinta.
4. Afeitar el vello inguinal con un cortador de pelo y desinfectar toda la zona utilizando povidona yodada seguido de etanol al 80%. Repita el paso de desinfección dos veces.
   NOTA: El área quirúrgica, gasas, y los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados. Mantener un campo estéril durante todo el procedimiento y el desgaste de un solo uso, guantes quirúrgicos estériles, máscaras y gorras.
5. Bajo el microscopio, realizar una incisión vertical a lo largo de los inguinalis linea. Use dos pinzas para separar suavemente los tejidos subcutáneos y exponer la vena epigástrica superficial de su origin en la vena femoral. Con cuidado, aislar la vena epigástrica superficial de los tejidos circundantes.
6. Detener el flujo sanguíneo en la vena epigástrica superficial utilizando dos pinzas micro.
7. Cosecha de un segmento de aproximadamente 0,5 a 1 cm de la vena levantando con cuidado la vena aislado con unas pinzas y el corte a través del recipiente con micro tijeras. Deja las abrazaderas micro en el muñón recipiente para evitar la pérdida de sangre. Coloque la pieza eliminado de la vena sobre una gasa estéril. Con cuidado, coloque una aguja 30 G en el interior de un extremo de la vena recogida y enjuagar el recipiente con heparina (50 unidades / ml).
   NOTA: Sea la vena con cuidado y evitar daños durante la elevación, de corte y rubor. Asegúrese de que para lavar el injerto con la cantidad apropiada de heparina.
8. Mantenga el segmento de vaso de lidocaína al 1% en hielo hasta el trasplante en la rata receptora para prevenir un espasmo de los vasos.
9. La eutanasia a la rata donante mediante el aumento de la anestesia a los 5% de isoflurano. Después de 2-3 minutos, open el abdomen a lo largo de la línea alba, cortar a través del diafragma, y ​​quitar el corazón para detener la circulación.

3. Preparación de la rata receptora

1. Anestesiar y fijar la rata receptora de la misma manera como la rata donante.
2. Afeitar el lado medial de las piernas con un cortador de pelo y desinfectar tres veces con povidona yodada y 80% de etanol.
3. Monitorear la profundidad de la anestesia y asegurarse de que es suficiente mediante la verificación de la ausencia de reflejos cuando se pellizca las patas traseras.
4. Realizar una incisión mediana femoral de la rodilla hasta el pliegue inguinal. Bajo el microscopio, utilizar 2 fórceps para separar la arteria femoral de su entorno.
5. Utilice abrazaderas micro para detener el flujo de sangre. Coloque la abrazadera proximal primero, seguido por la pinza distal.
6. Cortar un segmento corto de la arteria femoral sujetada con micro tijeras y lo descarta. Acortar el muñón arterial restante con micro tijeras, creando una brecha que es1-2 mm mayor que el injerto de vena. Enjuague el muñón arterial con heparina usando una aguja de 30 G.
   NOTA: Si la adventicia sobresale ligeramente más allá del muñón buque, el uso de fórceps para tirar de él ligeramente en el extremo del recipiente y retirar una pieza.
7. Coloque la vena recogida desde el paso 2.8 entre los muñones arteriales y ajustar la longitud para que se ajuste adecuadamente en el hueco. Tenga en cuenta la dirección de la vena.
8. Realizar la anastomosis proximal en primer lugar usando una sutura de prolene 10-0. Llevar a cabo las puntadas individuales en el orden que se muestra (Figura 1D). Comience con una sutura en cada lado lateral antes de añadir tres suturas más en la parte ventral. Después, colocar tres puntos de sutura en el lado dorsal del recipiente para completar la anastomosis.
9. Conectar los vasos distales con el injerto usando la misma técnica que para la anastomosis proximal descrito en el paso 3.8. Una vez más, comenzar con una sutura en cada lado lateral y, a continuación colocar tres puntos de sutura en el sid ventrale y el lado dorsal.
10. Cargar dos jeringas de 1 ml con componente de cola de fibrina 1 y 2. Levante con cuidado el injerto con una pinza y colocar aproximadamente 100 l de fibrina componente de pegamento 1 bajo el injerto, seguido por el componente 2.
    NOTA: Asegúrese de que los componentes 1 y 2 se aplican en una proporción de 1: 1.
11. Colocar el injerto en su posición y soltar un 100 l adicionales de los componentes 1 y 2 en la parte superior del injerto. Asegúrese de que el pegamento cubre tanto el injerto y la anastomosis con el fin de prevenir la insuficiencia anastomótica y el exceso de distensión del injerto de vena.
12. abrir con cuidado la pinza distal, seguido de la proximal.
13. Confirmar una cirugía exitosa marcando el pulso visible en la vena y la arteria trasplantado distal del injerto.
14. Retire el exceso de pegamento, lo que impide el cierre de la piel. El uso de fórceps para levantar la cola curada y retire el exceso con micro tijeras. Cierre las capas de la piel con suturas de prolene 5-0.
15. Inyectar 4-5 mg / kg de carprofeno por vía subcutánea antes de permitir que la rata se despierte. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Mantener al animal en una jaula individual hasta que esté totalmente recuperado.
16. Añadir Metamizol al agua de bebida (50 mg Metamizol por 100 ml) como medicamentos para el dolor durante los siguientes 3 días y controlar el animal a diario.

4. La ecografía dúplex

NOTA: El uso de la ecografía duxplex visualizar el flujo sanguíneo de forma no invasiva en ratas ^14.

1. Anestesiar una rata en una cámara de inducción (isoflurano 2%). Coloque la rata sobre su espalda y mantener la anestesia con una máscara que cubre la nariz.
2. Utilizar máquinas de cortar el pelo y crema de depilación para eliminar el pelo alrededor de la zona del muslo.
3. Aplique el gel de ultrasonido en el muslo. Asegúrese de que no hay burbujas de aire. Adquirir imágenes de ecografía dúplex utilizando un transductor 400 MS (frecuencia central: 30 MHz) con una velocidad de 230-400 cuadros / seg.

5. Histopatología

NOTA: Cosecha y mancha el recipiente de tinción con tricrómico de Masson para el análisis morfométrico ^15.

1. Fijar el vaso recogido en 4% de paraformaldehído durante la noche y se deshidratan en concentraciones crecientes de etanol. Incrustar la muestra en parafina y cortar en rodajas de 5 micras de grosor usando un microtomo.
   NOTA: El paraformaldehído es tóxico y debe manejarse con especial cuidado.
2. Desparafinar las diapositivas antes de la tinción con tricrómico solución de tinción. Deshidratar los portaobjetos teñidos, claro ellos con xileno, y montarlos en medio de montaje. Después de secar las diapositivas, ver las muestras con un microscopio.

6. La bioluminiscencia de imágenes (BLI)

NOTA: El injerto postoperatorio fue rastreado a través del tiempo in vivo mediante la medición de la señal bioluminiscente ¹6.

1. Disolver 1 g de sal de potasio de D-luciferina en 22 ml de PBS y se inyectan por vía intraperitoneal en la rata (375 mg / kg de peso corporal). Espere 15 min para la luciferina circule en el animal.
2. Coloque la rata en un sistema de cuantificación bioluminiscente en tiempo real y acceder a la señal de bioluminiscencia.

Results

El modelo de la interposición de vena rata es adecuado para estudiar el desarrollo de la hiperplasia myointima y el fracaso del injerto venoso. Los animales se recuperan bien de la cirugía y muestran una excelente condición física después de la operación. La Figura 1 muestra los pasos quirúrgicos clave. Después de la incisión de la piel a lo largo de los inguinalis linea, la vena superficial epigástrico y la arteria femoral se identifican (Figura 1A). La recolección del injerto debe rea...

Discussion

Este video muestra una vena modelo de interposición de rata para investigar la pérdida del injerto de vena y para permitir la exploración de los procesos patológicos subyacentes y el ensayo de nuevos fármacos u opciones terapéuticas.

La anestesia es un aspecto crucial de los procedimientos quirúrgicos. Se recomienda un sistema de anestesia por inhalación continua, ya que este es un método seguro y fácil, especialmente durante las operaciones prolongadas. Esto puede ser de gran importancia du...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rata LEW/Crl	Charles River	Número de inventario 004
Rata LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Instituto de animales de laboratorio, Universidad de Kioto, Japón	NBPR número de rata 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Ciencias de la Microscopía Electrónica	#157135S	20%
cortadora de pelo	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Pinza microquirúrgica de isoflurano
	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - Aplicador de
pinza	Fine Science Tools	18056-14
crema depilatoria	Rufin cosmético	27618
Povidona-Yodo	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Sutura de Ethilon	Ethicon	2814G
5-0 Sutura de prolene	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofeno
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizol
Heparina	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xilocaína 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocaína
EVICEL	J& J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Nº de artículo:EVK01DE	cola de fibrina
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Nº de art.: 3570160
sistema de microimagen de alta resolución Vevo 770 in vivo	Ecografía dúplex	VisualSonics
Ecogel 100 gel de ultrasonido	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, sal de potasio	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		Imágenes de bioluminiscencia
Weigerts Kit de hematoxilina de hierro	Merck	1.15973.0002	Tinción tricrómica
Resorcine-Fucsina Weigert	Waldeck	2.00E-30	Tinción tricrómica
Fucsina ácida	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Tinción tricrómica
Solución de Ponceau S	Serva Electroforesis	33427	Tinción tricrómica
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Tinción tricrómica
Hidrato de ácido molibdatofosfórico	Merck	1.00532.0100	Tinción tricrómica
Naranja G	Waldeck	1B-221	Tinción tricrmática
Verde Claro SF	Waldeck	1B-211	Tinción tricrómica
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Ácido acético glacial	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xileno	Th. Geyer	3410
Parafina	Leica biosystems	REF 39602004
Etanol absoluto	Th. Geyer	2246
Etanol 96%	Th. Geyer	2295
Etanol 70%	Th. Geyer	2270
Bandeja deslizante	Ted Pella	21057
Plato de tinción	Ted Pella	21075
Bepanthen Pomada para ojos y nariz	Bayer	1578675	ungüento para los ojos