Artículo de método

La expansión de nanoestructurada Los sustratos usando la técnica de la puntada para Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

DOI:

10.3791/54840

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8 de diciembre de 2016

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

En este artículo

Resumen

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Se presenta un protocolo para producir una gran área de sustrato nanomodelado a partir de pequeños moldes nanomodelados para el estudio de la modulación nanotopográfica del comportamiento celular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La nanotopografía de sustrato ha demostrado ser un potente modulador del fenotipo y la función celular. Para diseccionar la modulación nanotopográfica del comportamiento celular, es deseable una gran área de sustrato nanomodelado para que se puedan cultivar suficientes células en la nanotopografía para posteriores análisis bioquímicos y de biología molecular. Sin embargo, las técnicas actuales de nanofabricación tienen limitaciones para generar nanopatrones altamente definidos en un área grande. En este artículo, presentamos un método para expandir sustratos nanopatrones desde un nanopatrón pequeño y altamente definido hasta un área grande utilizando la técnica de puntada. El método combina múltiples técnicas, que involucran litografía blanda para replicar moldes de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) a partir de un molde bien definido, técnica de puntada para ensamblar múltiples moldes de PDMS en un solo molde grande y nanoimpresión para generar un molde maestro en sustratos de poliestireno (PS). Con el molde maestro PS, producimos sustratos de trabajo PDMS y demostramos la modulación nanotopográfica de la dispersión celular. Este método proporciona una vía sencilla, asequible y versátil para generar nanopatrones bien definidos en grandes áreas, y se puede ampliar para crear dispositivos a micro/nanoescala con componentes híbridos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una serie de hallazgos recientes revelan que la nanotopografía de sustratos tiene una influencia pronunciada en el comportamiento celular, desde la adhesión, propagación y migración celular, hasta la proliferación y diferenciación1-6. Por ejemplo, se ha observado un menor tamaño celular y una menor tasa de proliferación en células cultivadas en nanorredes profundas, lo que incluso conduce a la apoptosis, aunque la alineación, elongación y migración celular mejoraron, en comparación con los controles planos2,7-10. Además, se ha demostrado que la nanotopografía facilita la diferenciación de las células madre en ciertos linajes, como la neurona2,11,12, el músculo13 y el hueso3,4. Además, debido a la creciente preocupación por la toxicidad de los nanomateriales modificados14,15, es necesario incorporar la nanotopografía en modelos in vitro fisiológicamente relevantes para una evaluación precisa de los riesgos de los nanomateriales. Para llevar a cabo los análisis bioquímicos y de biología molecular, se necesitan suficientes células para cultivar en una gran área de sustrato con nanopatrones. Sin embargo, las técnicas convencionales de nanofabricación tienen limitaciones para generar nanopatrones altamente definidos en un área grande.

El autoensamblaje, incluida la litografía coloidal16 y la desmezcla de polímeros17, puede generar fácilmente nanoestructuras de gran área a bajo costo. Debido a que el autoensamblaje se basa en las interacciones entre los elementos de ensamblaje, como las partículas coloidales y las macromoléculas, y en las posibles interacciones entre estos elementos y el sustrato, no puede ser un método independiente para producir nanoestructuras con un posicionamiento espacial preciso y formas arbitrarias18. La alta densidad de defectos que acompaña también es un inconveniente. El control espacial preciso de los nanopatrones se puede lograr mediante el empleo de autoensamblaje con plantillas, que utiliza enfoques litográficos de arriba hacia abajo para proporcionar la plantilla topográfica y / o química para guiar el ensamblaje de abajo hacia arriba de los elementos de ensamblaje19-21. Se han desarrollado técnicas alternativas de nanofabricación, como la litografía escalonaday flash 22 y la litografía de nanoimpresión rollo a rollo23, pero su uso es limitado debido a su sofisticado proceso o a la necesidad de equipos especializados. Sin embargo, se necesita una plantilla o un molde maestro con patrones de nanoescala definidos para las técnicas de nanofabricación con plantillas o alternativas.

Tales plantillas y moldes maestros se generan convencionalmente mediante el uso de litografía de haz de electrones enfocados, iones o fotones. Por ejemplo, la litografía por haz de electrones (EBL)24 y la litografía por haz de iones focalizados25 pueden generar patrones definidos con una resolución inferior a 5 nm. La litografía de dos fotones ha demostrado un tamaño de característica tan pequeño como 30 nm26. Aunque las técnicas de litografía de haz focalizado permiten la generación de estructuras a nanoescala bien definidas, la inversión de capital y el proceso costoso y que requiere mucho tiempo restringen su uso generalizado en la investigación académica27. Por lo tanto, es muy deseable desarrollar técnicas habilitantes pero asequibles para producir una gran área de superficies con nanopatrones con alta fidelidad.

Hemos reportado una técnica de puntada simple y rentable para generar una gran área de superficie nanomodelada a partir de un molde pequeño y bien definido28. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso desde la replicación de moldes de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) utilizando un patrón escrito por EBL, hasta el ensamblaje de múltiples moldes de PDMS en un solo molde grande, hasta la generación de un molde maestro en sustratos poliméricos como el poliestireno (PS), hasta la producción de sustratos de trabajo. Con los sustratos nanopatrones expandidos, demostramos la modulación nanotopográfica de la propagación celular.

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Protocolo

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1. La replicación de PDMS moldes de un molde de EBL

  1. Fabricar molde de silicona 29
    1. capa de la vuelta 200 l polimetacrilato de metilo (PMMA) solución sobre un sustrato de 1 × 1 cm de silicio (Si) a 2.500 rpm durante 1 min para formar una película delgada.
    2. Hornear la película de PMMA en el sustrato de Si a 180 ° C durante 2 min.
    3. Escribir la nanopattern diseñado sobre la película de PMMA mediante el uso de un haz de electrones enfocado a una dosis área de 300 mu c / cm 2.
    4. Desarrollar la nanopattern PMMA en el revelador de 80 seg.
    5. Depositar el nanopattern PMMA con una capa de níquel de 50 nm de espesor utilizando un evaporador de haz de electrones a un voltaje de salida de 10 kV, corriente de emisión de 0,5 mA y una velocidad de deposición de 0,5 Å / s.
    6. Levante la parte PMMA en 20 removedor ml a 80 ° C durante 20 minutos.
    7. etch iones reactivos (RIE) la nanopattern en el sustrato de Si para obtener un molde de Si de la profundidad deseada.
      NOTA: Mezclas de gas de TetRafluoromethane (CF 4) / oxígeno (O 2) (90% / 10%) con una potencia de plasma de acoplamiento inductivo (ICP) de 400 W de potencia y RIE de 150 W se utiliza para grabar sustrato de Si a una profundidad de 560 nm.
  2. Si molde silaniza
    1. Ponga un cubreobjetos de vidrio y el molde de Si en un 100 mm placa de Petri PS y transferirlos en un desecador de vidrio situado en una campana de humos.
    2. Caída de 10 l 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane sobre el cubreobjetos.
      Precaución: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane puede causar la corrosión de la piel y lesiones oculares graves. Use equipo de protección personal adecuado (PPE).
    3. Cubrir la placa de Petri parcialmente.
    4. Mantenga el desecador a vacío durante 5 horas en una campana extractora para completar la silanización del molde Si.
  3. Preparar PDMS prepolímero
    1. Pesar 10 g de resina de PDMS y 1,05 g de agente de curado en un recipiente pesado desechable.
    2. Mezclar el prepolímero PDMS a fondo mediante el uso de una cuchara de plástico.
    3. Desgasificar la prepolímero PDMS en un desecador de plástico al vacío durante unos 20 minutos hasta que se observa una mezcla clara.
  4. Replicar moldes de PDMS
    1. Ponga el molde Si silanizada en una placa de Petri 60 mm.
    2. Verter el prepolímero PDMS sobre el molde de Si en la placa de Petri.
    3. Coloque la placa de Petri en un desecador de plástico y desgasificar durante aproximadamente 10 minutos hasta que todas las burbujas desaparecen.
    4. La transferencia de la placa de Petri con una placa calefactora y curar el prepolímero PDMS a 70 ° C durante 4 horas.
    5. Despegar el molde de PDMS del molde Si cuidadosamente usando pinzas.
      NOTA: moldes de PDMS se pueden almacenar en condiciones ambientales durante hasta una semana. Después de curar, hay algunas moléculas de resina PDMS no reticuladas y agente de curado residual en los moldes de PDMS 30. Las moléculas de bajo peso molecular se difunden gradualmente y se acumulan en la superficie con el tiempo. Esto afecta a las propiedades topográficas y mecánicas de la superficie PDMS 31. el DIFfusión no es significativo dentro de una semana.

2. Costura de PDMS moldes en una grande, solo molde

  1. Preparar moldes múltiples PDMS repitiendo el paso 1.4.
    NOTA: Pesar misma cantidad de mezcla de PDMS cada vez para obtener moldes de PDMS de igual espesor.
  2. Determinar la orientación de anisotrópicos PDMS nanopatrones como nanogratings bajo un microscopio óptico y se marca en la parte posterior de los moldes de PDMS con un rotulador.
    NOTA: No es necesario marcar la orientación de nanotopografía isotrópico como nanopilares.
  3. Limpiar un sustrato de Si con etanol en una campana de humos y se seca con aire comprimido.
  4. Se quita las áreas sin patrón de cada molde de PDMS con una cuchilla.
    NOTA: Para obtener los moldes de PDMS que serán colocados en la periferia del molde cosido, sólo las áreas no pautadas en contacto con otras personas deben ser recortados.
  5. Coloque el molde de PDMS adornado con la nanopattern boca abajo enel espejo lateral del sustrato de Si y luego se suman otros moldes cerca pero sin tocar el molde (s) de los alrededores.
  6. Preparar una capa adhesiva PDMS
    1. Reparto de 1 g desgasifica PDMS prepolímero (resina de PDMS y curado relación de agente: 10: 1,05) en un portaobjetos de vidrio limpio (7,5 cm x 2,5 cm) para formar una capa de espesor de 0,5 mm.
    2. Hornear la capa de PDMS a 100 ° C sobre una placa caliente durante 3-5 min. Use una aguja a tocar la capa y asegurar que la capa está parcialmente pero no completamente curada.
      NOTA: PDMS parcialmente curado no puede fluir como prepolímero de PDMS sin curar, pero es pegajoso en comparación con PDMS curados.
  7. Coloque la capa de PDMS en la parte trasera de moldes de PDMS alineados e invertir rápidamente esta asamblea y transferirlo a la zona de cocción.
  8. Aplicar una fuerza de compresión (5 kPa) usando un bloque de metal en la parte superior del conjunto para asegurar un buen contacto entre la capa de adhesivo PDMS y la parte posterior de los moldes de PDMS, y curar la capa de adhesivo PDMS a 100 ° C durante 1 hr.
    NOTA: Ajuste cuidadosamente la posición del bloque de metal para evitar la inclinación del conjunto.
  9. Retire el bloque de metal y retire la única, del molde de PDMS cosido desde el sustrato de Si.

3. Generación de un molde principal en PS Sustratos

Nota: El molde de PDMS cosido inmovilizada sobre un portaobjetos de vidrio se puede utilizar para generar un molde maestro en una placa de PS o una película delgada PS, de la que se pueden producir de trabajo sustratos nanoestructurada.

  1. Generar un molde maestro en una placa PS
    1. Preparar una placa PS
      1. Se secan los gránulos PS en un horno de vacío a 80 ° C durante dos días.
      2. Precalentar una máquina de prensa a 230 ° C.
      3. Montar una placa de aluminio, una lámina de politetrafluoroetileno (PTFE) y el separador de aluminio en un orden de abajo hacia arriba.
      4. Carga de 3,5 g de gránulos de PS en el separador de aluminio con una abertura cuadrada de 3 cm (L) x 3 cm (W) x 0,3 cm (H).
        NOTA: El separador es de aproximadamente 0.1 cm más gruesos que los moldes de PDMS, y por lo tanto el sustrato final nanoestructurada PS es de unos 0,1 cm de espesor.
      5. Coloque otra hoja de PTFE y luego otra placa de aluminio en el separador de aluminio.
      6. Coloque el conjunto de la máquina de la prensa.
      7. Precalentar los pellets PS a 230 ° C durante 30 minutos.
      8. Aplicar una presión de compresión (0,1 MPa) sobre el conjunto durante 5 min.
      9. Liberar la presión y vuelva a aplicar una presión de compresión de 0,5 MPa en el conjunto.
      10. Repita el paso 3.1.1.9 con un aumento de presión de 0,5 MPa hasta que la presión deseable de 1,5 MPa se alcanza.
      11. Apague el calentador de la máquina de la prensa y enfriarlo por debajo de 70 ° C a una presión constante de 1,5 MPa.
      12. Tome el montaje y almacenar la placa PS en un horno de vacío a 80 ° C para evitar que la humedad vuelva a entrar en la placa PS.
    2. Nano-impresión del molde de PDMS cosido en la placa PS
      1. Coloque la placa de PS en un separador de aluminiosituado en una de 3 pulgadas oblea de Si.
        NOTA: Las dimensiones interiores del espaciador son los mismos que los de la placa de PS de modo que la placa de PS encaja perfectamente en el espaciador.
      2. Calentar la placa de PS en una placa caliente a 250 ° C durante 30 min.
      3. Ponga el molde de PDMS cosida con nanopatrones boca abajo sobre la placa PS fundido.
        NOTA: Un lado del molde de PDMS se pone en contacto con la superficie de la placa de PS primero y otro lado se disminuye gradualmente en contacto con la superficie de PS para evitar la formación de burbujas de aire en la interfase.
        Precaución: La superficie de la placa de cocción está caliente. Use thermogloves durante el proceso de nanoimpresión.
      4. Colocar una placa de aluminio en el portaobjetos de vidrio del molde de PDMS cosido.
      5. Aplicar una presión de compresión (12,5 kPa) mediante el uso de bloques de metal en la placa de aluminio y esperar 3 minutos.
        NOTA: Asegúrese de que la placa de aluminio no está inclinada.
      6. Levante y vuelva a colocar el bloque de metal de la placa de aluminio y yoaumentar la cant presión de compresión de 25 kPa.
      7. Repita el paso 3.1.2.6 con la presión aumentó a 50 kPa.
        NOTA: Este paso es eliminar el aire atrapado entre el molde de PDMS y la placa PS.
      8. Mantener la temperatura de la zona de cocción entre 240 y 250 ° C bajo la presión constante de 50 kPa durante 15 min.
      9. Apague la zona de cocción y enfriamiento toda la instalación.
        NOTA: Un ventilador puede ser usado para acelerar el proceso de enfriamiento.
      10. Retire los bloques de metal después de que la temperatura sea inferior a 50 ° C, y con cuidado retire el molde de PDMS cosido de la placa PS.
        NOTA: El sustrato PS tiene las nanopatrones inversa y se puede utilizar como un molde maestro para producir PDMS de trabajo sustratos.
  2. Generar un molde maestro en una película delgada PS
    1. Preparar una película delgada PS
      1. Disolver 1 g PS en 10 ml de tolueno en una campana de humos.
        Precaución: El tolueno puede causar la piel irritation y lesiones oculares graves, y pueden causar daños en los órganos tras exposiciones prolongadas o repetidas. Use el EPP apropiado.
      2. Spin-capa de solución de PS 1 ml en un 2-en forma de disco a 2.500 rpm durante 1 min para formar ~ 1 de película delgada m de espesor PS.
      3. Se evapora el tolueno de la película mediante el establecimiento de la película PS en oblea de Si en una campana de humos durante 3 días.
      4. Recocer la película delgada PS en un horno de vacío a 80 ° C durante la noche.
    2. Nano-impresión del molde de PDMS en una película delgada PS
      1. Ponga el molde de PDMS cosida con nanotopografía boca abajo en la película delgada PS, que se fija sobre una placa caliente.
      2. Aplicar una presión de compresión de 12 kPa en el molde de PDMS mediante el uso de bloques de metal en el lado del vidrio del molde de PDMS.
      3. Aumentar la temperatura de la placa caliente a 180 ° C y mantener durante 15 min.
        Precaución: La película PS fundido puede funcionar como un lubricante. Prestar atención a evitar que los bloques de metal se deslice fuera.
      4. Apague la zona de coccióny enfriar toda la instalación.
        NOTA: Un ventilador puede ser usado para acelerar el proceso de enfriamiento.
      5. Retire los bloques de metal después de que la temperatura desciende por debajo de 50 ° C, y con cuidado retire el molde de PDMS cosido de la película PS.
        NOTA: La película nanoestructurada PS servirá como un molde maestro para producir sustratos PDMS de trabajo.

4. Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

Nota: Las células epiteliales humanas se cultivan en las nanotopographies representativos que demuestren la modulación nanotopographical de difusión celular.

  1. Reparto de PDMS sustratos de trabajo del molde maestro generada a partir de cualquiera Paso 3.1 o 3.2 dependiendo de la aplicación.
  2. Con un punzón de arco de acero hueco, cortar los PDMS sustratos nanoestructurada en discos para adaptarse a la configuración de una placa de múltiples pocillos específica (por ejemplo, la placa, de 24 pocillos).
  3. Utilizar pinzas para colocar los discos de PDMS en los pocillos ofa placa de múltiples pocillos.
  4. Esterilizar los sustratos PDMS mediante el uso de 70% de etanol y después de la exposición UV, cada uno por 30 min.
  5. Lavar los sustratos PDMS con 1x tampón fosfato salino (PBS) tres veces.
  6. Escudo el PDMS sustratos con proteína de la matriz extracelular (es decir, 20 mg / ml de fibronectina) durante 30 min a temperatura ambiente.
  7. Enjuague el PDMS sustratos tres veces con PBS estéril, cada uno de 5 min.
  8. Suspender A549 de células de cáncer de pulmón humano en un medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal 10% y contar las células usando un hemocitómetro.
  9. Placa de las células a una densidad de siembra de 2.000 células / cm 2 en los sustratos y cultura los PDMS a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 durante un día.
  10. Se lavan las células con PBS tres veces.
  11. Fijar las células en una mezcla de 4% de paraformaldehído y glutaraldehído al 2% en PBS durante 4 hr y deshidratar las células usando un CO 2 po críticosecador de int para la digitalización de la observación microscópica electrónica 29.
    Precaución: El paraformaldehído y glutaraldehído pueden causar quemaduras en la piel y lesiones oculares graves. Operar en una campana química y usar el EPP apropiado.

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Resultados

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La técnica de la puntada puede generar una gran superficie de sustratos nanoestructurada con alta fidelidad. La Figura 1a y 1b mostrar la gran área de nanopatrones transferidas desde el molde PDMS cosido a la placa de PS y PS película delgada sobre un sustrato de Si, respectivamente. La comparación entre el original molde escrito-EBL (Figura 1c) y el PDMS finales de trabajo de sustrato (Figura 1d) confirma que los nanopa...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se presenta un método simple, asequible y versátil para generar una gran superficie de sustrato nanoestructurada. Para ampliar fielmente nanopatrones altamente definidos, con gran atención debe prestarse a varios pasos críticos. La primera es para recortar los múltiples moldes de PDMS. zonas sin patrón de los moldes de PDMS necesitan ser removidas. Además, las paredes laterales de los moldes se deben cortar verticalmente tan perfecta como sea posible para minimizar los huecos entre los moldes. En conjunto, la parte de l...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue parcialmente apoyado por NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759 y Byars-Tarnay Endowment. Reconocemos con gratitud el uso de las Instalaciones de Investigación Compartidas de la Universidad de Virginia Occidental, que cuentan con el apoyo, en parte, de NSF EPS-1003907.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Emisión de campo JEOL SEMJEOLJSM-7600F
Ebl Evaporador de haz EKurt J. LeskerModelo: LAB 18 evaporador dehaz E de deposición de níquel
Trion Minilock III ICP/RIETrion technologyModelo: Minilock-phantom III
Máquina de prensaPHI Prensa hidráulica PHI Molde: SQ-230H
Barnizador de hilaturaLaurell TecnologíasModle: WS-400A-6NPP-LITE
Secador crítico de CO2TousimisModle: Autosamdri-815
Oblea de silicioUniversity Wafer1080
Placas de aluminioMcMaster-carr9057K123
Láminas de teflónMcMaster-carr8711K92
Placa de Petri de 100 mmFALCON
Placa de Petri de 60 mmFALCON353004
Cubreobjetos de vidrioFisher Scientific12-542-B
Portaobjetos de vidrioFisher Scientific12-550-34
Botes de pesaje desechablesFisher Scientific13-735-743
Desecador de vidrioFisher Scientific02-913-360
Desecador de plásticoBel-Art ProductsF42025-000
Placa calefactoraFisher Scientific1110049SH
PinzaTed Pella, inc.5726
BladeFisher ScientificS17302
McMaster-carr
PunchBrettuns Village Leather Craft SuppliesPunzón
Poli(metacrilato de metilo)MicroChem495 PMMA A4
PDMSDow CorningSylgard 184 kit
PoliestirenoDow ChemicalStyron 685D
1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmetildiclorosilanoOakwood Chemical7142
ReveladorMicroChemMIBK/IPA en relación
RemovedorMicroChemRemovedor PG
EtanolFisher ScientificBP2818500
ToluenoFisher ScientificT324-500
Solución salina tamponada con fosfatoSigma AldrichD8537
Dulbecco' s medio de águila modificadoSigma AldrichD5796
Suero fetal bovinoAtlanta BiologicalsS11550
ParaformaldehídoMicrosopía Electrónica Ciencia15712-S
Glutaraldehído Fisher ChemicalG151-1
FibronectinaCorning356008
células A549ATCCATCC CCL-185
353003Bloques metálicosde arco1:3

Referencias

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