La cuantificación histológica de miocardio infarto crónico en ratas

Resumen

La evaluación post-mortem del infarto de miocardio (IM) en roedores se basa en la cuantificación del infarto en secciones de corazón teñidas. Describimos un método preciso para cuantificar el tamaño del infarto utilizando el muestreo sistemático de corazones de rata recolectados desde la base hasta el ápice y análisis de imágenes de secciones histológicas teñidas con tricrómicos.

Resumen

El infarto de miocardio se define como la muerte de los cardiomiocitos debido a una isquemia prolongada; una respuesta inflamatoria y la formación de cicatrices (fibrosis) siguen a la lesión isquémica. Tras la fase aguda inicial, la remodelación crónica del ventrículo izquierdo (VI) modifica la estructura y la función del corazón. La ligadura coronaria permanente en pequeños animales ha sido ampliamente utilizada como modelo de referencia para un modelo crónico de IM. El adelgazamiento de la pared infartada evoluciona progresivamente a fibrosis transmural. La evaluación histológica del tamaño del infarto se realiza comúnmente; Sin embargo, falta una estandarización de los métodos de cuantificación. De hecho, aspectos metodológicos importantes, como el número de secciones analizadas y los métodos de muestreo y cuantificación, generalmente no se describen y, por lo tanto, impiden la comparación entre investigaciones. Con demasiada frecuencia, la cuantificación se realiza en una sola sección obtenida a nivel de los músculos papilares. Debido a que se están investigando nuevas estrategias destinadas a reducir la expansión y remodelación del infarto, existe una necesidad importante de estandarizar protocolos precisos de muestreo cardíaco. Describimos un método preciso para cuantificar el tamaño del infarto utilizando un muestreo sistemático de corazón de rata recolectado y análisis de imágenes de secciones histológicas teñidas con tricrómata obtenidas desde la base hasta el ápice. También aportamos evidencias de que el cálculo del índice de expansión (IE) permitió evaluar el tamaño del infarto, teniendo en cuenta los cambios del ventrículo izquierdo a lo largo de la remodelación.

Introducción

El infarto de miocardio (IM) es una causa principal de muerte y discapacidad en todo el mundo. La enfermedad coronaria es la causa principal; MI resulta de la isquemia consecutiva a eventos coronarios tales como oclusión. Cuando la reperfusión no se realiza dentro de las primeras 6 horas, la isquemia induce necrosis miocárdica irreversible. En los pacientes, la caracterización de MI se apoya en diferentes herramientas de diagnóstico, incluidos los signos clínicos, la electrocardiografía, la evaluación de los niveles plasmáticos de biomarcadores, ecocardiografía, resonancia magnética y análisis histológicos ^1. MI aguda y crónica se clasifican como dos fases diferentes de lesión de acuerdo con la temporización de la necrosis del miocardio en relación con el momento de la oclusión coronaria. La fase aguda, que se producen durante los primeros 7 días, se asocia con la pérdida de cardiomiocitos, inflamación extensa, y el reclutamiento de fibroblastos. La fase sub-aguda, caracterizada por la cicatrización del tejido cardiaco y la formación de una cicatriz, se produceentre 1 y 4 - 6 semanas. La expansión del infarto, adelgazamiento de la pared del ventrículo, y dilatación del ventrículo caracterizan la fase crónica. Amplia remodelación del ventrículo izquierdo da lugar progresivamente en la insuficiencia cardíaca grave ^2.

MI permanente inducido por la arteria descendente anterior izquierda ligadura (LAD) representa el modelo estándar de roedores de infarto de miocardio crónico. Los imitadores de ligadura coronaria de la oclusión coronaria. El tamaño del infarto depende del sitio de la ligadura. Caracterización de la lesión isquémica del miocardio en un modelo de roedor se realiza clásicamente utilizando los niveles plasmáticos de biomarcadores, como la troponina I y T ^3, ecocardiografía, resonancia magnética, y la histología ^4,5. los niveles de biomarcadores se correlacionan con el grado de muerte de los cardiomiocitos. La ecocardiografía evalúa el deterioro de la función ventricular izquierda como resultado de alteraciones de la contractilidad regional. Además, las técnicas de imagen no invasivas, como la resonancia magnética o de alta resoluciónecocardiografía, permite la evaluación de la reducción de la motilidad, el volumen de la zona de la cicatriz con una reducción de la perfusión y el miocardio viable y el adelgazamiento de la pared. LV dimensiones permiten la evaluación precisa del tamaño del infarto. Por último, la cuantificación de miocardio viable y muertos se puede realizar usando postmortem manchas específicas de cortes histológicos de corazones cosechadas y permite la verificación del tamaño del infarto (IS). Otra característica importante es la evaluación del índice de expansión del infarto (EI) ^6. La IE está asociada con el infarto transmural y se inicia dentro de los primeros 3 días. La EI se caracteriza por una reducción progresiva del espesor de pared, un aumento en el tamaño de la cavidad LV, y los consiguientes cambios en la forma del LV.

Con el fin de evaluar la eficacia terapéutica de nuevos tratamientos - en particular, las estrategias de regeneración basada en células, matrices, y el gen de evaluación entrega precisa de MI en roedores es de suma importancia.Cuando se mide en una sola sección transversal obtenida a nivel del músculo papilar, el tamaño se puede estar sesgado debido a la gran variabilidad que existe en el desarrollo del infarto después de la ligadura LAD; el infarto ápice puede ser entonces occulted. Es importante destacar que las metodologías más precisa el tamaño MI determinado se han descrito para los ratones o ratas ^{de 7-9 10.} Sin embargo, IS es insuficiente para cuantificar con precisión la remodelación del VI o reducciones terapéuticamente inducidos (o prevenciones) de la remodelación. De hecho, ¿se expresa habitualmente como un porcentaje del volumen total del VI evaluada en secciones transversales del corazón. Aunque este método es válido para IM agudo, el adelgazamiento de la pared del VI se producen durante la remodelación permanece bajo-evaluado ^11,12. Una cuantificación morfométrica completa del tamaño del infarto y los cambios estructurales debe cuantificar varios parámetros, tales como longitudes endocárdicos y epicárdicos y diámetros, así como el infarto y las zonas sanas. Se describe un apr metodológicaoach para evaluar con precisión MI y remodelación en un modelo de rata crónica.

Protocolo

Todos los animales recibieron atención humanitaria de conformidad con la Convención Europea de los Animales. Los procedimientos quirúrgicos se realizaron de conformidad con la Ley de Protección de Animales de Suiza después de obtener el permiso de la Oficina Veterinaria del Estado, Friburgo, aprobado por la Oficina Veterinaria Federal Suizo, Suiza.

1. La recolección del corazón

NOTA: Todas las intervenciones quirúrgicas se realizaron bajo anestesia con isoflurano. Se hicieron esfuerzos para disminuir el sufrimiento de los animales. En particular, todos los animales recibieron una inyección subcutánea de 0,1 mg / kg de buprenorfina pre-anestesia. El protocolo quirúrgico para la inducción de infarto de miocardio se ha descrito previamente en otra parte ^13.

1. Realizar una esternotomía en un animal myocardially infartado bajo anestesia (animal intubado, 2,5% de isoflurano, la anestesia adecuadas confirmados por la pata reflejo pellizco).
   1. Abra el animal por el corte de la piel y luego los músculoscon tijeras quirúrgicas. Cortar las costillas en la izquierda y la derecha, y luego quitar el pecho.
   2. Retire las adherencias que quedan después de la cirugía anterior (LAD ligadura). Cortar la aorta y quitar el corazón. Ponga el tejido en KCl 1 M (en PBS), y luego se lava con PBS.

2. Preparación del tejido

1. Poner el corazón infartado longitudinalmente en una matriz de corazón de rata acrílico. Mantenerlo a -20 ° C durante 1 hora.
2. Cortar el corazón directamente en la matriz usando una hoja de afeitar con una transversal. Asegúrese de que cada porción es de 2 mm de espesor. Cortar aproximadamente 5-7 diapositivas para cada corazón (basado en el nivel de remodelación); esto se denomina muestreo sistemático.
3. En este paso, la realización de la tinción de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) es opcional (mantener la orientación de la base-vértice rebanadas del corazón).
   1. Incubar en 1% TTC en PBS durante 50 min a 37 ° C. Incubar en 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a 1 hr. Ponga las secciones entrn dos placas de vidrio con espaciadores de 2 mm y tomar fotografías con un microscopio estéreo lógico junto con una cámara en 15 aumentos.
      ¡PRECAUCIÓN! Paraformaldehído es tóxico.
4. La congelación de diapositivas (1 opción ^st)
   1. Ponga cada diapositiva en un molde de plástico (10 x 10 x 5 mm) con medio para cryotomy (temperatura de corte óptima, OCT) de montaje, mantener la orientación (coloque el lado orientado al ápice de la sección hacia abajo en el fondo del molde). Congelar los bloques con los vapores de 2-metilbutano en nitrógeno líquido refrigerante durante 10 - 15 min. Por último, almacenar el tejido a -80 ° C.
5. Paraffinization (2 ^ª opción)
   1. Colocar cada diapositiva de la incrustación de cassettes (mantener la orientación colocando el lado orientado ápice de la sección hacia abajo en la parte inferior de la casete) y luego en PFA al 4% durante 24 horas. Póngalo en una máquina durante la noche procesador de tejidos.
      1. Incubar en etanol al 70% durante 2 horas. Incubar en etanol 95% durante 2 horas. Incubar en etanol 100% durante 3 horas. Incubar en xilol durante 4 horas. Incubar en parafina (fundido a 60 ° C en un horno) durante 5 hr. Por último, hacer bloques mediante la incorporación de cada diapositiva corazón en parafina.

3. Masson-Goldner Trichrome tinción

1. Hacer secciones de tejido de los bloques de parafina con un microtomo manual (grosor: 5 m) o de bloques de OCT con un criostato se establece en -18 ° C (espesor: 7 m).
2. Manchar una diapositiva de cada parte del corazón de cada rata (3 - 4 secciones transversales por diapositiva) con Masson-Goldner tricrómico tinción (véase el anexo).
   NOTA: Empezar desde este paso para las secciones de parafina.
   1. Fundir las diapositivas a 60 ° C en un horno. Bajo una campana extractora, ellos Desparafinar en xilol dos veces durante 10 minutos cada uno. Rehidratan en 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol, y agua destilada durante 3 min cada uno.
      NOTA: Empezar desde este paso para la sección criogénicas.
   2. Fijarlos en Bouin solución durante la noche. Entonces, enjuagarlos con agua corriente del grifo durante 10 - 15 min. Enjuague con agua destilada. Incubarlos en hematoxilina de Mayer durante 3 min.
   3. Retire las diapositivas y dejarlas en agua destilada durante 5 minutos. A continuación, se incuba en ácido fucsina-Ponceau para 5 min. Enjuague en ácido acético al 1% durante 1 min.
   4. A continuación, los incuban en ácido fosfomolíbdico Naranja G durante 1 minuto. Enjuagarlos en ácido acético al 1% durante 1 min, incubarlos en tinte de color verde claro durante 10 minutos, y enjuague en ácido acético al 1% durante 1 min.
   5. Deshidratar en 70% de etanol (30 seg), 95% de etanol (30 seg), y 100% de etanol (5 min). Ponga una gota de medio de montaje de resina en las secciones de tejido, los cubren con cubreobjetos, y dejarlos secar.

Análisis de tamaño 4. infarto

1. Adquirir una imagen de cada portaobjetos en un microscopio estereoscópico (ampliación 15X) acoplado con una cámara. Fotografiar una regla con el mismo ajustes.
2. Utilice el software de análisis de imagen para medir el grosor de la cicatriz en el medio del infarto, el espesor del tabique, el área de la cavidad del ventrículo izquierdo (VI), el área de infarto, y la zona de tejido LV usando.
   1. Establecer la escala con la imagen regla (Figura 1A).
      1. Haga clic en mediciones después seleccione Establecer factor de conversión. Dibuje una línea en la barra de calibración. Haga clic derecho sobre la imagen y haga clic en la calibración final. Tenga en cuenta el valor de la barra y, a continuación, haga clic en Aceptar.
   2. Seleccione la LV de la foto del corazón manchado (Figura 1B). Utilice la herramienta de segmento múltiple. Seleccione el punto por punto y LV, haga clic derecho Copiar / pegar en cualquier lugar.
   3. Medir el grosor de la cicatriz y el tabique con la función única medición segmento (Figura 1C ).
   4. Detectará automáticamente el LV cavidad, infarto, y las zonas de baja tensión utilizando la herramienta de medición de área automático en modo RGB (Figura 1D).
      1. Haga clic en la herramienta. Sólo Bordes y activar Contigua en el modo RGB. Por último, haga clic dentro del área de interés para detectarlo. Si es necesario, utilizar herramientas de precisión.
3. Calcular el tamaño del infarto como la relación entre el área de infarto al área LV.
4. Calcular el índice de expansión de la siguiente manera: [área de la cavidad LV / toda la zona LV] / [grosor del infarto / grosor del septo], con toda la zona LV incluyendo tanto la cavidad del VI y zonas de tejido LV.
5. Por último, el cálculo de un "promedio" de cada corazón de la siguiente manera: [promedio de índice de expansión de las diapositivas infartados] * [Número de diapositivas infartados / Número total de diapositivas].

Resultados

Seis semanas después de la ligadura de LAD, los corazones se recogieron de ratas Lewis. secciones de tejido de 2 mm se obtuvieron de vértice a la base. Un procedimiento de tinción de TTC se realizó para visualizar el área de infarto, que aparece en blanco, y el miocardio sano, que aparece en rojo (Figura 2). Dependiendo del sitio de la ligadura de la LAD, el tamaño del infarto varía. Para grandes MI, se observaron infartos transmurales desde el vértice a la base ...

Discusión

Los pasos críticos dentro del Protocolo

tejido fibrótico puede evaluarse con precisión en un modelo de rata MI crónica utilizando muestreo sistemático del corazón y de la imagen cosechada análisis de secciones histológicas-tricromáticas manchado obtenidos a partir de la base al ápice. Dos pasos son especialmente importantes para el éxito de la implementación del protocolo. En primer lugar, el uso de KCl para la recolección del corazón permite que el músculo cardíaco se mante...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matriz acrílica de corazón de rata 2 mm	72-5015	Harvard Appartus
Inspira ventilador avanzado controlado por volumen	Harvard Apparatus 557058
Catéter Insyte 14 G	BD	381267
O.C.T	BDHA361603E	VWR
TTC	T8877-10G	Sigma Aldrich
Mayer hematoxilina	MHS32-1L	Sigma Aldrich
Ácido Fucsina CI 42685	F8129-50G	Sigma Aldrich
Ponceau Xilidina CI 16150	P2395-25G	Sigma Aldrich
Naranja G CI 16230	O3756-100G	Sigma Aldrich
Verde claro CI 42095	L5382-25G	Sigma Aldrich
KCl	P9333-500G	Sigma Aldrich
Xylol	10315083	HoneyWell
Etanol absoluto	10303990	HoneyWell
2-metilbutano	M32631-1L	Sigma Aldrich
Microscopio estereoscópico	SM2800	Nikon
Formaldehído	99340	Reactolab
Casete de inclusión	K113.1	Carl Roth
Bersoft Software		Bersoft.com	Software con licencia

de medición de imágenes