Se describe un método para el marcaje estable de xenoinjertos derivados del paciente (PDXs) con partículas lentivirales que expresan la proteína y luciferasa indicadores verdes fluorescentes. Este método permite el seguimiento del crecimiento de PDXs en el sitio principal, así como la detección de metástasis espontáneas y experimentales utilizando en sistemas de imágenes in vivo.
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Artículo de método
Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios
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Resumen
Resumen
El uso de modelos preclínicos para estudiar la biología tumoral y la respuesta al tratamiento es fundamental para la investigación del cáncer. Las líneas celulares humanas establecidas desde hace mucho tiempo, y muchos modelos de ratones transgénicos, a menudo no logran recapitular los aspectos clave de las neoplasias malignas humanas. Así, se están desarrollando modelos alternativos que representan mejor la heterogeneidad de los tumores de los pacientes y sus metástasis. Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente (PDX) en los que las muestras tumorales resecadas quirúrgicamente se injertan en ratones inmunocomprometidos se han convertido en una alternativa atractiva, ya que pueden trasplantarse a través de múltiples generaciones y reflejan de manera más eficiente la heterogeneidad tumoral que los xenoinjertos derivados de líneas celulares de cáncer humano. Una limitación para el uso de PDX es que son difíciles de transfectar o transducir para introducir reporteros rastreables o para manipular la expresión génica. El protocolo actual describe métodos para transducir células tumorales disociadas de PDX con alta eficiencia de transducción, y el uso de PDX marcadas para modelos experimentales de metástasis de cáncer de mama. El protocolo también demuestra el uso de PDX marcadas en modelos experimentales de metástasis para estudiar el proceso de colonización de órganos de la cascada metastásica. Las metástasis en diferentes órganos pueden visualizarse y cuantificarse fácilmente mediante imágenes bioluminiscentes en animales vivos, o la expresión de GFP durante la disección y en órganos extirpados. Estos métodos proporcionan una herramienta poderosa para extender el uso de múltiples tipos de PDX a la investigación de la metástasis.
Introducción
El desarrollo de xenoinjertos derivados de pacientes tumorales (PDXs), donde las muestras de tumor resecado quirúrgicamente injertados directamente en ratones inmunocomprometidos, ofrece varias ventajas sobre los modelos estándar de xenoinjertos de la línea celular y representa un avance importante en la investigación del cáncer 1,2. PDXs pueden ser mantenidos y expandido en pasajes sucesivos con una mínima alteración de las características genéticas y biológicas del tumor crecido en el primer paso; y reflejar con mayor precisión la heterogeneidad del tumor de xenoinjertos derivados de las líneas celulares de cáncer humano 3-8. Estos modelos se ....
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Protocolo
Todos los pasos que requieren el uso de animales en este protocolo sigue las directrices de la Universidad de Colorado Comité Ético de Investigación Animal (IACUC).
1. Preparación de los instrumentos, medios de cultivo y otros reactivos
- Preparar 100 ml mammosphere medios que contienen medio Eagle modificado y de Han medio de Dulbecco F-12 (DMEM / F12) (1: 1), básica factor de crecimiento fibroblástico (bFGF, 20 ng / ml), factor de crecimiento epidérmico (EGF, 10 ng / ml ), heparina (4 g / ml), 1x B27, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml). Hacer los medios de comunicación en condiciones estériles y se almacena a 4 ° C durante un máx....
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Resultados
Este método describe la transducción de las células del cáncer de mama disociadas-PDX utilizando vectores lentivirales de alto título pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro y el fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W. Estos vectores expresan un marcador fluorescente que permite la estimación de la eficacia de la transducción in vitro, tan pronto como 24 horas después de la infección (Figura 1a). Para la mayoría de PDXs, la expresión de GFP se retrasará hasta 72 hr después de la infe.......
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Discusión
Los pasos críticos en el protocolo:
El uso de partículas de lentivirus de título alto (> 10 8 TU / ml) es un paso crítico en el éxito de este protocolo, ya que permite un control cuidadoso de la composición de los medios de comunicación durante la transducción in vitro. Si bien varios métodos para la producción de partículas virales de alto título han sido bien descritos 18,19; Este protocolo utiliza partículas lentivirales producidos como s.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Darrel Kotton la Universidad de Boston para proporcionar el fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W de vectores y protocolos para la producción de lentivirus de alto título usado en estos estudios. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), el NCI K22CA181250 (DMC) y R01 CA140985 (CAS) subvención .NCI P30CA046934 Centro apoyado en imágenes in vivo y el cultivo de tejidos núcleos a Universidad de Colorado AMC.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparina | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-hongos-antibióticos | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Tampón de digestión |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ libre | de Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 Extracto de | matriz de basamento (BME) |
| 30 ° Agitador C | NewBrunswick Scientific CO. INC | Serie 25 Incubadora Shaker | |
| 70 μ m filtros | Falcon | 7352350 | |
| bisturíes | Fisher 22079690 | ||
| Clorhexidina desinfectante | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Sangre roja reactivo de lisis celular | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidasa | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microperlas* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Kit de depleción de células de linaje, ratón* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separador | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Soporte magnético | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| Columnas MS Se | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS o LS, ajustar al número de celdas. |
| Illumatool Sistema de luz sintonizable | Investigación de Lightools | Varios | Para imágenes de fluorescencia in vivo |
| Dispositivo de imagen de IVIS200 Xenogen | Varios | Para imágenes de luminiscencia in vivo | |
| Clon de citoqueratina humana MNF116 Anticuerpo monoclonal | DAKO | M0821 | Pan-citoqueratina |
| Anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidérmico | Señalización celular | 4267S | EGFR |
Referencias
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clin....
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Reimpresiones y permisos
