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Artículo de método

Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios

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DOI:

10.3791/54944

⸱

30 de noviembre de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

Se describe un método para el marcaje estable de xenoinjertos derivados del paciente (PDXs) con partículas lentivirales que expresan la proteína y luciferasa indicadores verdes fluorescentes. Este método permite el seguimiento del crecimiento de PDXs en el sitio principal, así como la detección de metástasis espontáneas y experimentales utilizando en sistemas de imágenes in vivo.

Resumen

El uso de modelos preclínicos para estudiar la biología tumoral y la respuesta al tratamiento es fundamental para la investigación del cáncer. Las líneas celulares humanas establecidas desde hace mucho tiempo, y muchos modelos de ratones transgénicos, a menudo no logran recapitular los aspectos clave de las neoplasias malignas humanas. Así, se están desarrollando modelos alternativos que representan mejor la heterogeneidad de los tumores de los pacientes y sus metástasis. Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente (PDX) en los que las muestras tumorales resecadas quirúrgicamente se injertan en ratones inmunocomprometidos se han convertido en una alternativa atractiva, ya que pueden trasplantarse a través de múltiples generaciones y reflejan de manera más eficiente la heterogeneidad tumoral que los xenoinjertos derivados de líneas celulares de cáncer humano. Una limitación para el uso de PDX es que son difíciles de transfectar o transducir para introducir reporteros rastreables o para manipular la expresión génica. El protocolo actual describe métodos para transducir células tumorales disociadas de PDX con alta eficiencia de transducción, y el uso de PDX marcadas para modelos experimentales de metástasis de cáncer de mama. El protocolo también demuestra el uso de PDX marcadas en modelos experimentales de metástasis para estudiar el proceso de colonización de órganos de la cascada metastásica. Las metástasis en diferentes órganos pueden visualizarse y cuantificarse fácilmente mediante imágenes bioluminiscentes en animales vivos, o la expresión de GFP durante la disección y en órganos extirpados. Estos métodos proporcionan una herramienta poderosa para extender el uso de múltiples tipos de PDX a la investigación de la metástasis.

Introducción

El desarrollo de xenoinjertos derivados de pacientes tumorales (PDXs), donde las muestras de tumor resecado quirúrgicamente injertados directamente en ratones inmunocomprometidos, ofrece varias ventajas sobre los modelos estándar de xenoinjertos de la línea celular y representa un avance importante en la investigación del cáncer 1,2. PDXs pueden ser mantenidos y expandido en pasajes sucesivos con una mínima alteración de las características genéticas y biológicas del tumor crecido en el primer paso; y reflejar con mayor precisión la heterogeneidad del tumor de xenoinjertos derivados de las líneas celulares de cáncer humano 3-8. Estos modelos se utilizan ahora ampliamente como una plataforma para la personalización de la terapéutica del cáncer 9,10, como una plataforma preclínica en el desarrollo de fármacos y 6,11 como una herramienta experimental para el estudio de la biología del cáncer 4,12.

La mayoría de PDXs se implantan y se propagan por vía subcutánea, que permite que sea viable la medición del crecimiento del tumor con el tiempo usando calibradores. sin embargo, La enfermedad metastásica ha sido más difícil de modelar utilizando PDXs. Específicamente para el cáncer de mama, xenoinjertos con capacidad metastásica a los diferentes órganos se han descrito 3,5,13, pero la frecuencia de difusión espontánea a los sitios de metástasis es extremadamente baja. Cuando se informó, la identificación y cuantificación de la carga metastásico se basa en el examen histológico de los órganos diana laboriosa post-mortem. líneas celulares de cáncer que expresan bioluminiscente (luciferasa, Luc) o fluorescente (proteína verde fluorescente, GFP) reporteros de genes se utilizan comúnmente en modelos experimentales de metástasis de cáncer de mama a cerebro, pulmón, hueso e hígado después de intracardíaca, cola-vena, intrafemoral y la inyección esplénica 14-16. Aunque estos modelos evitan la difusión de los tumores primarios, que son valiosos para estudiar los mecanismos de tropismo de órganos y la colonización metastásica. Sin embargo, las células derivadas de tumores de pacientes primarios y PDXs pueden tener baja las tasas de transfección o transducción using procedimientos estándar. Una alternativa es establecer líneas celulares derivadas de PDX in vitro 17, que puede ser etiquetado a continuación, utilizando protocolos de cultivo de tejidos convencionales. Esta estrategia, sin embargo, no es adecuado para la mayoría de etiquetado PDXs, para lo cual la línea de células derivación es difícil y puede cambiar el fenotipo de las células. Aquí se presenta un protocolo para la transducción de las células tumorales disociadas-PDX con lentiviral vectores adecuados para la formación de imágenes in vivo. Además, se describe la metástasis experimental usando inyección intracardíaca de células PDX luc-GFP etiquetados disociadas en ratones inmunocomprometidos.

Un protocolo básico para la transducción de organoides disociadas-PDX con el gen reportero que expresa lentivirus se ha descrito previamente 18. En el protocolo actual se describen métodos adicionales para enriquecer en células tumorales humanas y obtener cerca de la eficiencia de transducción de 100%, así como el uso de PDXs marcados para la detección de cáncer de mama experimentalmetástasis. Este protocolo se puede adaptar para el etiquetado de múltiples tipos de cáncer de PDXs con diversos marcadores luminiscentes y fluorescentes, así como la modulación de la expresión génica (es decir, desmontables shRNA de genes de interés).

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Protocolo

Todos los pasos que requieren el uso de animales en este protocolo sigue las directrices de la Universidad de Colorado Comité Ético de Investigación Animal (IACUC).

1. Preparación de los instrumentos, medios de cultivo y otros reactivos

  1. Preparar 100 ml mammosphere medios que contienen medio Eagle modificado y de Han medio de Dulbecco F-12 (DMEM / F12) (1: 1), básica factor de crecimiento fibroblástico (bFGF, 20 ng / ml), factor de crecimiento epidérmico (EGF, 10 ng / ml ), heparina (4 g / ml), 1x B27, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml). Hacer los medios de comunicación en condiciones estériles y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 3 meses.
  2. Preparar tampón de enriquecimiento epitelial (EEB) que contiene PBS pH 7,2, 0,5% albúmina de suero bovino (BSA), 2 mM EDTA. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 6 meses.
  3. Hacer alícuotas de 5 ml de tampón de digestión en estériles de 15 ml tubos cónicos y se almacena a -20 ° C durante meses. La noche antes de la digestión del tumor, tampón de digestión de deshielo (5 ml por 500 mgtumor) en el hielo, a 4 ° C. Añadir la mezcla de 1x antibiótico-antimicótico antes de su uso.
  4. Autoclave (121 ° C durante 30 min) al menos dos pinzas, escalpelo y tijeras para la disección de PDXs.
  5. Hacer 500 ml de tampón de lavado que contiene DMEM: F12 y 5% de suero bovino fetal (FBS). Almacenar a 4 ° C durante meses. Alícuota de 10 ml por tumor el día de la disección del tumor.
  6. Preparar una polibreno acciones a 4 g / l con agua estéril. Se filtra y se alícuota de 1,5 ml que contienen tubos de microcentrífuga de 100 l cada uno, almacenar a -20 ° C.

2. Generación de alto título de Lentiviral partículas que llevan marcadores Trazables

  1. Adquirir o generar partículas de lentivirus de alto título que llevan un gen indicador (es decir., GFP y Luc para el seguimiento in vivo de crecimiento del tumor) 18,19.
    NOTA: Un título lentiviral de> 10 8 TU / ml (se recomienda unidades de transducción por mililitro) para la transducción exitosa de PDXs. El lentiviral partículos deben ser pseudotyped con un sobre glicoproteína G de virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), lo que permite la transducción de una amplia variedad de células de mamífero.
    NOTA: El protocolo utilizado aquí para la generación y la titulación de las partículas lentivirales de alto título está disponible en www.kottonlab.com . Vectores utilizados en este protocolo son pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro y la doble promotor del fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W. Este vector se generó mediante la sustitución de dsRed con el gen de la luciferasa aguas abajo del promotor EF1aL en el vector de fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W, una especie de regalo de Darrell Kotton, la Universidad de Boston.

3. Generación de xenoinjertos derivados de los pacientes

  1. Generar xenoinjertos de pacientes derivada (PDX) por cáncer de mama mediante la implantación de los tumores de mama primarios o metastásicos en la almohadilla de grasa mamaria de ratones inmunodeprimidos 3,4. Generar tumores con un tamaño máximo recomendado de 1 cm de diámetro como tumores más grandes son likely para contener núcleos necróticos.
    NOTA: Detallado métodos para fijar y trasplante de xenoinjertos se describen en DeRose et al 18.. Crecimiento de PDXs establecida trasplantables en tumores cm de diámetro> 1 tarda entre 4 y 24 semanas después de la implantación en NOD inmunodeficiente / SCID / ILIIrg - / - (NSG), dependiendo de las tasas de crecimiento del tumor intrínsecas. Si bien este protocolo describe la transducción de PDXs de cáncer de mama, que puede ser utilizado para la transducción viral de cualquier tumor adecuado para corto plazo en el pasaje vitro. La sensibilidad de PDXs a corto plazo (24 a 96 hr) en la supervivencia vitro es intrínseca a cada tumor y se debe determinar experimentalmente.

Disección 4. Tumor y la disociación de las células tumorales derivadas de PDX

  1. La eutanasia a los ratones que llevan PDX mediante inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical (siguen las directrices institucionales de la investigación del comité de ética animal). Sumergir los ratones en un 0,2% Chlorhexidine solución durante 1 minuto. Ajuste del ratón en una posición supina en la parte superior de una placa de disección, y el uso de alfileres para fijar las extremidades superiores e inferiores extendidas a la junta.
  2. Utilizando una técnica aséptica, utilizar un bisturí para cortar la piel alrededor del tumor. Tire de la piel con un conjunto de pinzas y separarlo del tumor usando un escalpelo limpio hasta que el tumor está completamente expuesto. El uso de un juego limpio de pinzas y bisturí, extirpar el tumor y colocarlo en 5 ml lavar los medios de comunicación en el hielo.
  3. Tome tumor diseccionado en un gabinete BLS2 para su posterior procesamiento. Retire el medio y enjuague tumor con 10 ml de salina equilibrada de Hank sodio modificado con Hepes 10 mM (HBSS / Hepes), dos veces.
  4. Caída del tumor en un 60 cm placa de cultivo de tejidos pesados ​​previamente estéril. Pese la placa que contiene el tumor para estimar la masa tumoral.
  5. El uso de un bisturí, cortar el tumor por la mitad, luego se corta un disco de 3 mm desde la mitad y colocarlo en un recipiente con formalina al 10% durante 24 horas. Usar este tejido para verificar la heterogeneidad de lamuestra de tumor (parental PDX). Añadir 200 l de HBSS / Hepes (suficiente para evitar que el tejido se seque) y picar el tumor que queda en las más pequeñas piezas posibles utilizando fórceps y un bisturí limpio.
  6. Transferir el tumor picada en un tubo cónico de 50 ml estéril. Añadir al menos 1 ml de tampón de digestión que contienen 1x antimicótico-antibiótico por cada 100 mg de tumor.
    NOTA: La adición de antibióticos / antimicótico evita la contaminación de las células tumorales in vitro.
  7. Digerir tumor durante 3 horas a 30 ° C, agitando a 125 - 200 rpm.
    NOTA: El aumento de la temperatura hasta 37 ° C aumenta la eficiencia de la digestión (células más simples con el tiempo) pero por lo general es acompañado por un aumento de la muerte celular. Para la mayoría de los tumores, la digestión a 30 ° C durante 3 hr resultados en un número suficiente de células disociadas viables para pasar a la etapa de marcaje.
  8. Detener la digestión de la adición de 35 ml se lavan los medios (DMEM / F12 con FBS al 5%). Filtrar a través de un nailon 70 micras de malla en un lugar limpio de 50 ml conical tubo para retirar el tejido no digerido. Centrifugar los medios filtrados contienen células digeridas a 400 xg durante 5 min.
  9. Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
  10. Añadir 10 ml de tampón de lavado (DMEM: F12, FBS al 5%) para detener la lisis. Las células pasan a través de un nailon 40 mM de malla para eliminar los grumos. Centrifugar a 400 xg durante 5 minutos y retirar el sobrenadante, el lugar en el hielo.
  11. Resuspender las células digiere en 5 ml tampón de lavado y contar las células viables y no viables mediante exclusión con azul de tripano. En pocas palabras, mezclar 50 l de células y 50 l de azul de tripano y contar las células con exclusión de azul de tripano-usando un hemocitómetro.
    NOTA: Este producto crudo digestión contendrá células tumorales humanas derivadas de la PDX, así como las células del estroma de ratón (fibroblastos, células de la sangre, etc.). células digeridas ahora se pueden procesar para el etiquetado (paso 6), o células de cáncer humano pueden enriquecerse usando uno de los procedimientos descritosEn la referencia 5.

5. El enriquecimiento de las células del cáncer epitelial humano

  1. Agotar las células estromales de ratón utilizando un linaje kit de reducción de células (Lin +) 20.
    NOTA: Se recomienda para tumores altamente vascularizados y / o tumores del estroma con alto contenido en el que la expresión de EpCAM se desconoce o se pierde).
    1. Tomar hasta 10 7 células viables en un tubo de polipropileno de 5 ml limpio, añadir EEB 2 ml y centrifugar a 300 g durante 5 min. Pipetear el sobrenadante por completo.
    2. Sedimento celular se vuelve a suspender en 40 l de EEB enfriado en hielo por 10 7 células.
    3. Añadir 10 l de cóctel de biotina-anticuerpo por 10 7 células, mezclar pipeteando suavemente y se incuba a 4 ° C durante 10 min (cóctel contiene anticuerpos frente a células de ratón Lin +).
    4. Añadir 30 l de EEB en frío por 10 7 células, mezclar pipeteando suavemente.
    5. Añadir 20 l de microperlas anti-biotina por 10 7 células mezcle con la pipeta suavemente y se incuba a 4 y #176; C durante 15 min.
    6. Lavar las células con 3 ml EEB frío, centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Con cuidado, aspirar el sobrenadante. sedimento se vuelve a suspender en 500 l de EEB y el lugar en el hielo.
    7. Colocar la columna en el campo magnético de un separador magnético. Enjuagar la columna con 0,5 ml de tampón de enriquecimiento epitelial y dejarlo escurrir a través. No permita que la columna se seque.
    8. Colocar un nuevo tubo de recogida de polipropileno en la columna. Lentamente, añadir los 500 l que contienen células marcadas sobre la columna (Lin + etiquetados células serán retenidos en la columna magnética). Recoger el efluente como una fracción de células no marcadas, lo que representa la fracción celular enriquecida negativo linaje (tumor).
    9. Lavar la columna 3 veces con 500 l de EBB y recoger el efluente en el mismo tubo como efluente de la etapa 5.1.8. Mantenga efluentes en hielo y proceder a la etapa de marcaje (6).
    10. Opcional: Tomar la columna fuera del campo magnético. Coloque un nuevo tubo de polipropileno debajoy eluir la fracción LIN + mediante la adición de 500 l de EEB, tres veces y con el émbolo proporcionado.
  2. El enriquecimiento de las células de cáncer epitelial EpCAM + humanos (recomendado para los tumores se sabe que expresan CD326 + y contienen un alto contenido del estroma del ratón).
    1. Tomar hasta 10 7 células viables en un tubo de polipropileno de 5 ml limpio, añadir 2 ml de EEB en frío y centrifugar a 300 g durante 5 min. Pipetear el sobrenadante por completo.
    2. Sedimento celular se vuelve a suspender en 60 l de EBB enfriado en hielo por 10 7 células.
    3. Añadir 20 l de microperlas EpCAM por 10 7 células, mezclar pipeteando suavemente y se incuba a 4 ° C durante 30 min.
    4. Lavar las células con 3 ml EEB frío, centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Con cuidado, aspirar el sobrenadante. sedimento se vuelve a suspender en 500 l de EEB y se puso en hielo.
    5. Colocar la columna en el campo magnético de un mini separador. Enjuague columna con EEB 0,5 ml y dejar que se escurra a través. No permita que la columna se sequefuera.
    6. Colocar un nuevo tubo de recogida de polipropileno en la columna. Poco a poco, añadir los 500 l que contenía células marcadas sobre la columna (células marcadas EpCAM + serán retenidos en la columna magnética). Recoger el efluente como una fracción de células no marcadas, que representan las células estromales de ratón.
    7. Lavar la columna 4 veces con 500 l de ME Buffer y recoger el efluente en el mismo tubo como efluente de la etapa 5.1.8.
    8. Tomar la columna fuera del campo magnético. Coloque un nuevo tubo de polipropileno debajo y eluir la fracción EpCAM + mediante la adición de 500 l de tampón ME, tres veces. Eliminar las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna. Recoger efluente que contiene la fracción EpCAM + células tumorales enriquecido y mantener en hielo. Continúe con el paso 6.

6. La transducción de las células tumorales derivadas de PDX

  1. Centrifugadora disoció las células tumorales en 300 gx 5 min y se vuelve a suspender en 2 ml mammosphere media. Contar las células viables mediante exclusión con azul tripán como en 4.11.
  2. Preparar 10 ml de medio mammosphere que contienen 8 g / ml de polibreno (2 l de Stock polibreno por ml de medios de comunicación).
  3. Determinar el volumen necesario para 2 x 10 5 células tumorales viables. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min, y pellet se resuspende en 2 ml de polibreno medios que contienen. Placa 2 x 10 5 células tumorales viables por pocillo en una placa de cultivo de 6 pocillos ultra-bajo de tejido de adherencia.
    NOTA: Este es un número óptimo de células necesarias para la transducción con un vector lentiviral.
    PRECAUCIÓN! Partículas lentivirales y todos los consumibles utilizados con partículas de lentivirus deben ser manejados siguiendo los procedimientos institucionales para riesgos biológicos de ADN recombinante.
    NOTA: la transducción de Lentiviral de células de mama primarios favorece fuertemente las células mioepiteliales que puede resultar en pobres etiquetado de células luminales y selección de subpoblaciones de células tumorales durante el etiquetado 21.
  4. incubar los virus con 200 mU / ml de neuraminidasa a 37 ° C durante 1 h antes de la transducción para aumentar la unión de partículas virales a diferentes subpoblaciones de células primarias y correcta para que este potencial de polarización 21.
  5. Añadir partículas lentivirales a 10 MOI (2 x 10 6 TU para 2 x 10 5 células viables) si las células disociadas-PDX se agotan de células de ratón Lin + o enriquecidos en células EpCAM +. Añadir partículas lentivirales a 30 MOI (6 x 10 6 TU para 2 x 10 5 células viables) si se utilizan células disociadas-PDX no enriquecidos.
    NOTA: El aumento de la MOI permite la transducción eficaz incluso en presencia de grandes cantidades de desechos y células muertas en los extractos crudos. Mantenga un pocillo con células no marcadas para servir como control para la eficiencia de la viabilidad y la transducción.
  6. Agitar para mezclar con el virus de las células. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante un máximo de 96 hr. Añadir 500 l de los medios de comunicación mammosphere frescas 24 horas después de la transfección. Las células no ATTACh a las placas, no aspirar medios de comunicación.

7. Evaluación de la eficacia de transducción y la reimplantación de células marcadas en ratones inmunodeficientes

  1. Monitorear la expresión del marcador rastreable (GFP) cada 24 horas usando un microscopio fluorescente a un aumento de 10X.
    NOTA: La expresión de GFP se puede observar tan pronto como 24 horas después de la infección, pero en la mayoría de PDXs expresión de la GFP es claramente visible después de 72 horas (Figura 1).
  2. Estimar la eficiencia de la transducción mediante la evaluación del porcentaje de células GFP + en el bien total.
    NOTA: Como cultivos contienen células tumorales, células estromales residuales, y las células muertas en diversos grados, pozos con tan bajo como 10% GFP + células pueden ser implantadas en un ratón huésped.
  3. Transferencia de células transducidas de placas de 6 pocillos en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 1 ml de medio mammosphere al pozo para recoger todas las células que quedan atrás. Colocar sobre hielo.
  4. Añadir 10 ml de HBSS / Hepes a las células transducidas y centrifuge a 300 xg durante 5 min, 4 ° C. Con cuidado aspirar el sobrenadante y resuspender en 50 l extracto de la matriz basal (BME) en hielo.
    NOTA: alícuotas de BME deben ser descongelados en hielo, 1 - 2 hr antes de su uso. BME se solidificará a temperatura ambiente; mantener en hielo en todo momento.
  5. Cargar células embebidas-BME en una jeringa de 0,5 ml de insulina, mantener en hielo, y llevar a las instalaciones de animales para la reimplantación en ratones GSN.
  6. Anestesie hembra 4 - ratones GSN 8 semanas de edad, usando 5% / 95% de oxígeno isoflurano durante 5 min, seguido de 2% de isoflurano / 98% de oxígeno o de acuerdo con la ética de investigación animal aprobados protocolo aprobado.
  7. Cuando los animales no responde a estímulos dolorosos (toe-pellizco), limpiar la zona de la inyección con betadine seguido de toallitas de etanol, e inyectar los 50 l de células en la almohadilla de grasa mamaria 4º. Proporcionar ratones con analgesia para aliviar las molestias de la inyección tal como se indica en el protocolo aprobado.
  8. Permiten a las células para formar tumores (2 - 12 semanas) y monitorear las buenas prácticas agrarias y / ola actividad luciferasa utilizando un sistema sintonizables luz y / o sistema de imagen luciferasa in vivo (Figura 2).
    NOTA: Siga las pautas para la anestesia, analgesia, puede medirse la carga tumoral y criterios de eutanasia aprobadas por animales institucionales comité de ética de la investigación.

8. Control de Calidad de PDXs Etiquetada

  1. Determinar la eficiencia de etiquetado mediante la evaluación de la luciferasa y la expresión de GFP en los tumores marcados.
    NOTA: Siga animales institucionales comité de ética de investigación aprobado procedimientos para imágenes de bioluminiscencia in vivo (Figuras 2, 3).
    1. Diseccionar los tumores de los ratones sacrificados cuando el tamaño del tumor ha alcanzado 1,0 a 1,5 cm de diámetro (o antes de acuerdo con los protocolos aprobados, como se describe en 4). La disección debe realizarse bajo un sistema de luz ajustable (o un sistema equivalente que permita la evaluación de la fluorescencia de GFP).
    2. A partir de cada tumor, cualitativamente estimar el percentaje de GFP + tumor usando microscopía. Si es menos de 100%, diseccionar única porción + GFP. Diseccionar un disco de 3 mm y fijar en formol al 10% para la inclusión en parafina y análisis histológico, salvo un pequeño trozo de ARN u otros análisis deseados y ahorrar tanto del tumor como sea posible en cada 1,5 ml criotubos que contienen 90% de SFB / 10% DMSO para la crioconservación.
  2. Piezas re-implante del tumor marcado en ratones nuevo destinatario NSG 18 se expandan y se utilizan en los estudios experimentales de metástasis.
  3. Realizar la tinción inmunohistoquímica estándar de tejido embebidos en parafina obtenidos de tumores antes de la transducción y en cada generación a partir de entonces para verificar que PDXs marcados permanecen histológicamente similares a los PDXs originales.
    NOTA: Los marcadores utilizados para el control de la calidad varían con cada PDXs. Para PDXs de cáncer de mama, la expresión de receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2), factor de crecimiento epidérmico receptor 1 (HER1 o EGFR), pan-citoqueratina se recomiendan (pan-CK) para el cribado inicial.

9. Modelos de metástasis experimentales con PDXs Etiquetada

  1. Siguiendo los pasos descritos en la sección 4, se disocian las células tumorales de un PDX marcado. Si el tumor es altamente vascularizado o ricos en estroma del ratón, lleve a cabo el enriquecimiento de las células cancerosas como se describe en 4.5 o 4.6.
  2. Contar las células viables mediante exclusión con azul de tripano, y diluir 250.000 células en 100 l de PBS (Ca2 +, Mg2 + libre) por los ratones. Mantener las células en hielo. Para la inyección de varios ratones, ajustar los números en consecuencia (y preparar un exceso de al menos una inyección adicional para tener en cuenta errores de pipeteo).
  3. Llevar células en hielo a la sala de procedimiento animal apropiado y proceder a la inyección intracardiaca acuerdo con el protocolo aprobado IACUC.
    NOTA: Detallado protocolos para la inyección intracardiaca de las células cancerosas se han descrito en otra parte 22,23.
  4. Realizar un seguimiento y cuantificar metastásicoescalonada en el tiempo utilizando imágenes bioluminiscentes. Visualizar metástasis macroscópicas en los diferentes órganos utilizando bioluminiscencia y / o imágenes de GFP de órganos aislados en la necropsia 24 (Figura 6).

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Resultados

Este método describe la transducción de las células del cáncer de mama disociadas-PDX utilizando vectores lentivirales de alto título pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro y el fago-EF1aL-luciferasa-UBC-GFP-W. Estos vectores expresan un marcador fluorescente que permite la estimación de la eficacia de la transducción in vitro, tan pronto como 24 horas después de la infección (Figura 1a). Para la mayoría de PDXs, la expresión de GFP se retrasará hasta 72 hr después de la infe...

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Discusión

Los pasos críticos en el protocolo:

El uso de partículas de lentivirus de título alto (> 10 8 TU / ml) es un paso crítico en el éxito de este protocolo, ya que permite un control cuidadoso de la composición de los medios de comunicación durante la transducción in vitro. Si bien varios métodos para la producción de partículas virales de alto título han sido bien descritos 18,19; Este protocolo utiliza partículas lentivirales producidos como s...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Darrel Kotton la Universidad de Boston para proporcionar el fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W de vectores y protocolos para la producción de lentivirus de alto título usado en estos estudios. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), el NCI K22CA181250 (DMC) y R01 CA140985 (CAS) subvención .NCI P30CA046934 Centro apoyado en imágenes in vivo y el cultivo de tejidos núcleos a Universidad de Colorado AMC.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM/F12 (1:1)HycloneSH30023.01
bFGFBD Biosciences354060
EGFBD Biosciences354001
HeparinaSigmaH4784
B27Gibco/Thermo Fisher17504-44
Anti-hongos-antibióticosHycloneSV30010
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105-500Tampón de digestión
FBSAtlanta BiologicalsS11550
HBSS Red Ca2+/Mg2+ librede HycloneSH30031.02
Hepes
10x PBSHycloneSH30258.01
CultrexCultrex3433-005-01 Extracto dematriz de basamento (BME)
30 ° Agitador CNewBrunswick Scientific CO. INCSerie 25 Incubadora Shaker
70 μ m filtrosFalcon7352350
bisturíesFisher 22079690
Clorhexidina desinfectanteDurvet NDC# 30798-624-35
Sangre roja  reactivo de lisis celularSigmaR7757
NeuraminidasaSigmaN7885-1UN
EpCAM (CD326+) microperlas*Miltenyil Biotec130-061-101
Kit de depleción de células de linaje, ratón*Miltenyil Biotec130-090-858
MiniMACS Separador Miltenyil Biotec130-042-102
Mini MACS Soporte magnéticoMiltenyil Biotec130-042-303
Columnas MS SeMiltenyil Biotec130-042-201MS o LS, ajustar al número de celdas.
Illumatool Sistema de luz sintonizableInvestigación de LightoolsVariosPara imágenes de fluorescencia in vivo
Dispositivo de imagen de IVIS200 XenogenVariosPara imágenes de luminiscencia in vivo
Clon de citoqueratina humana MNF116 Anticuerpo monoclonalDAKOM0821Pan-citoqueratina 
Anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidérmicoSeñalización celular4267SEGFR
pueden utilizar columnas

Referencias

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