Summary
이 프로토콜은 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 허혈 - 재관류 (IR) 모델의 유도를 설명합니다. 맞춤 제작 된 생체 내에 이미징 모델을 사용하여, 우리는 생체 내 염증 반응 후 재관류에서 공부합니다. 이러한 기술의 발달 배후의 이론적 근거는 백혈구 IR 피부 손상에 반응하는 방법에 대한 이해를 확장하는 것이다.
Introduction
과도 저산소증 인해 조직 (재관류)의 후속 재 - 산소화이어서 혈류 (허혈)의 폐색에있을 때의 허혈 - 재관류 손상 (IRI)가 발생한다. 피부, 허혈 재관류 (IR)의 연장 상 나머지 부상 장기 입원 환자 걸리기 욕창의 병태 생리에 기여 요인 중 하나라고 생각된다. 이러한 환자에서 피부와 기본 근육 모두 지속적으로 치료 왼쪽 경우, 괴사 하나가 될 수 지역화 부상의 결과로, 뼈 굴지의 영역에 걸쳐 작용 무게 압력에 노출되어있다.
IRI에 관련된 손해 배상은 두 가지입니다. 허혈, 혈관 폐색 조직 산소 전달의 급격한 저하로 연결. 이것은 세포 대사에 관여 -ATPase를 불 활성화 ATP 및 산도의 감소를 초래한다. 차례로, 세포의 칼슘 농도는 스파이크, 그리고 스트레스 또는 c를 손상ELL 학생은 세포 사멸 또는 괴사 (2)를받을. 세포 내 내용이나 손상 관련 분자 패턴 (DAMP)의 출시, HMGB1 같은 염증 반응 3에 기여한다. 두 번째 모욕은 재관류시에 발생합니다. 산소와의 pH 수치가 재관류 기간 동안 복원되지만,이 세포 내 지질, DNA 및 단백질의 산화를 유도 활성 산소 종의 발생 (ROS)을 초래한다. 따라서, 염증성 매개 물질은 염증 사이트 2 면역 세포의 채용을 포함하는 이차 염증 반응을 설정하는 활성화됩니다. 염증 반응에 이르기까지의 생화학 적 사건의 케스케이드 잘 설명 하였지만, 면역 세포 활동의 시공간적 조절은 잘 이해되지 않는다.
여기서 우리는 간단한 자석 클램프를 사용하여 마우스 귀 피부에 강력한 IR 모델에 대해 설명합니다. 광자 생체 내에 영상 (MP-IVM)와 결합하여, 우리재관류가 발생 후 발생하는 생체 내 염증 반응을 연구하는 모델을 설립했다. 이 기술의 개발과 사용의 뒤에 이론적 근거는 간질 및 침투 세포가 모두 실시간으로 IR에 어떻게 반응하는지 이해하려고 노력하는 것입니다.
그들은 면역 연구 4 이하보다 유용하게 활용할 피부 측면에서 강판의 외과 적 이식을 필요로 피부 측면에 클램핑 기술을 사용하여 IR 기존의 모델은 매우 침습적이다. 유사한 비 침습적 클램핑 기술은 마우스 피부 플랭크 5,6- 설명되었다. 이 호흡에 의한 움직임을 회피하고 -7,8- 촬상시 안정성을 제공하지만,이 때문에 방법에서 생체 내에 이미징 성분의 혼입, 우리는 대신, 표적 IR 사이트와 귀의 피부를 선택 하였다. 또한, 간질 걸쳐 백혈구의 서브 세트는 있지만, 귀 피부와 피부 사이의 동일 측면숫자와 비율은 약간 9 다를 수 있습니다. 따라서, 귀 피부 이상적인 촬상 부위를 나타낸다.
또한, 이러한 IRI 모델에서 검색 대부분의 데이터는 거시적 평가 (궤양의 등급) 및 엔드 포인트 염증 지표 (10)의 현미경 분석에 제한됩니다. 이 모델을 사용하여, 형광 리포터 마우스 피부 재관류 후 호중구의 세포 반응의 실시간 시각화를 사용할 수있다. 이전에 출판 생체 내에 귀 이미징 모델은 추가 수정 (도 1, 2)와 (8) 사용된다.
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Protocol
살아있는 동물을 다루는 모든 실험은 모든 관련 동물 사용 및 관리 지침 및 규정에 따라 실시 하였다.
형광 리포터 생쥐 1. 선택
- 6 ~ 12 주 된 LysM-eGFP는 11 마우스 (남성 또는 여성 중 하나에 대한 더 선호)를 사용합니다.
주 : 다양한 세포 관련 형광 리포터 생쥐의 사용은 생체 내에서 서로 다른 면역 세포의 가시화를 가능하게한다. 이 균주에 가시화 될 수있다 단핵 세포 (GFP 싸다 세포), 및 피부 식세포 (GFP 싸다 세포)를 순환, 호중구 (GFP 안녕 세포)를 순환. 촬상 파라미터 사용으로, GFP 양성 호중구에서만 밝은 신호를 검출한다.
주 : 피부 촬상 연구의 이러한 유형에 적합한 면역 세포 특이 형광 리포터 생쥐 균주의 목록은 참고 8에서 찾을 수있다.
참고 :이 매우 pigmen로, 흰둥이 마우스 이미징에 사용하는 것이 좋습니다테드 마우스는 광 손상에 더 경향이 있습니다. 색소 귀 피부 (조직 연소 나타내는) 레이저 유발 반점에 더 민감하기 때문이다. 그 결과, 호중구 채용 축적에도 정상 상태 8,12 동안 관찰 될 수있다. - 12 시간 명암주기와 특정 병원균이없는 (SPF) 상태에서 마우스를 유지합니다.
2. 마우스 마취
- 멸균 물에 녹여 15 mg의 용액의 혼합물 -1 케타민 1 mg의 용액 -1 자일 라진 구성 케타민 - 자일 라진 (8 μL의 g -1 체중)의 복강 내 주사로 마우스를 마취.
- 제조 과정에 걸쳐 37 ℃의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 마우스를 놓는다. 발가락 핀치 반사의 부재를 관찰하여 충분한 마취를 확인합니다.
참고 : 첫 번째 시간 후 마취의 다음 분기 투여는 피하 관리되는해야합니다D는 약 0.5 시간마다 지속됩니다. 수염 또는 꼬리 경련은 마취 오프 입고 있고 상부 업이 필요하다고 표시 할 수있다. - 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 윤활제를 사용합니다.
3. 탈모
- 조심스럽게면 팁 어플리케이터를 사용하여 지느러미 마우스 귀 상부 3 분의 2에 제모 크림을 적용합니다.
- 철저한하지만 부드러운 방식으로 젖은 솜 팁 어플리케이터를 사용하여 크림을 제거하기 전에 3 분 - 2 기다립니다.
참고 : 염증 (13, 14)을 유도 할 수 있으므로 제모 크림, 너무 오래 마우스 귀에서 체류하는 것을 허용하지 않습니다.
허혈 및 재관류 손상 4. 유도
- 마우스 귀 피부에 허혈을 유도하기 위해 12 mm 직경 × 2 mm 두께의 금 도금, N42 등급의 네오디뮴 자석을 사용하여 약 3,000 가우스 등급.
주의 : 이러한 경우에, 자석의 딤플 얼굴 denoTES는 북극. - 개별 플라스틱 가이드로 자석 슬롯.
주 : 플라스틱 가이드 고강도 자석의 배치 및 분리를 용이하게하는 역할을한다. 때문에 강한 자력 파손 아직 낮은 저항에 서로 다른 금속에 근접 개별 자석을 배치하지 않습니다. 그들은 서로를 향해 당기면 파손과 분열이 발생할 수 있습니다. - 에지 부분 만이 상기 제 (복부) 자석 (도 3a)에 접촉되도록 상기 제 (등쪽) 자석을 배치
참고 :이 그들이 제대로 배치되기 전에 함께 스냅에서 자석을 방지 할 수 있습니다. - 복부 자석 귀 (그림 3a)에 평평하게되도록 모두 자석을 배치합니다.
주 : 허혈 유도 전에, 마우스를 37 ℃로 유지하고, 충분한 마취 (단계 2.2 참조) 유지되는 것을 보장한다. - 준비가되면, 조심스럽게 (그림 3a 자석 함께 오게 주 : 촬상 목적 들어, IR 및 비 IR 영역이 관찰 될 수 있도록 귀 절반 클램프.
- 허혈 1.5 시간 후 재관류가 일어날 수 있도록 자석 서로 떨어져 왜곡 플라스틱 가이드를 사용하여 자석을 제거한다.
주 :주의가 자석이 배치 될 때 주름로부터 귀를 방지하기 위해주의해야한다. 자석을 제거한 후, 육안으로 보이는 주요 혈관 (즉, 혈액 즉시 용기를 채우고) - 관류 즉시 다시 경우 불완전 허혈은 명백하다. 재관류 자석의 제거 직후에 발생하지 않지만, 혈관 폐색는 과도하다. 이와 같이,은 신속 가능한 이미징 마우스 귀를 제조하는 것이 필수적이다.
혈관 라벨 에이전트 5. 주입
- 즉시 자석을 제거한 후, 에반스 블루 (10 mg의 용액 (레트로 궤도 또는 꼬리 정맥 주사를 통해) 정맥 투여 -1PBS 또는 식염수에; 1 μL의 g -1 체중) 또는 선택의 다른 혈관 라벨 에이전트.
참고 : 주입하기 전에 충분한 마취가 여전히 완만 한 발가락 끼를 수행하여 유지되어 있는지 확인합니다.
이미징 플랫폼에 귀 6. 배치
- 테이프를 길이 1.5 cm, 폭 1.8 cm 마스킹의 두 조각을 잘라.
- 접착면은 그 폭에 따라 접착제의 약 1mm를 떠나 동안 함께 스틱 할 수 있습니다.
- 귀 플랫폼에 슬릿 내 배치를 수용하기 위해, 길이, 두 마스킹 테이프를 잘라.
- 접착면이 위를 향하도록, 슬릿을 통해 중간에 대해이 마스킹 테이프를 삽입합니다.
- 가열 패드에 마우스를 놓고 이미지화 할 수있는 귀는 마스킹 테이프 스트립 옆 등이다.
- 이 PBS-적신 솜 팁 어플리케이터를 사용하여 부드럽게 접착 스트립에 대해 귀를 누릅니다.
- 가이드로서 상기 스트립을 사용하여, 마우스의 귀에 가져슬릿을 통해 동시에 가까운 무대를 향해 마우스를 조정하면서.
- 끈적 끈적한 테이프를 제거하려면, 먼저 테이프의 접착을 줄이기 위해 PBS 한 방울을 추가합니다.
- 미세 페인트 브러시를 사용하는 것과 부드럽게 가능한 마스킹 테이프에서 마우스 귀를 분리합니다.
- 부드럽게 귀를 통해 촉촉한면 팁 어플리케이터를 압연하여 귀 플랫폼에 대해 귀를 평평하게.
- (그리스을 사용하여 커버 슬립 홀더 위치에 유지도 2) 커버 슬립 아래 PBS 한 방울을 넣고 부드럽게 귀 위에 놓습니다. 필요한 경우 더 PBS와 최고.
주 : 커버 슬립 홀더 이미징 동안 안정성을 증가시킨다. - 직장 온도 프로브를 삽입하고 제조업체의 지침에 따라 가열 시스템에 와이어를 연결합니다.
참고 : 37 ° C에 대한 신체 가열 패드의 온도와 35 ° C에 귀 단계 플랫폼을 설정합니다.
7. 다중 광자 현미경 세트위 영상 매개 변수
참고 :이 프로토콜은 가변으로, 광자 현미경을 하나의 빔을 사용하여 (680 - 1080 ㎚)의 Ti : 사 레이저 (3.3 W nm의 800에서 140 FS의 펄스 길이 80 MHz의 반복 속도)는 20 배 물 목적으로 수 (NA = 1.0) 생체 내에 이미징 연구.
- 이미징 소프트웨어를 엽니 다.
- 제조업체의 지침에 따라 레이저를 맞 춥니 다.
- 950 nm의 여기 파장을 조정한다.
참고 : GFP와 에반스 블루는 950 nm에서 동시에 흥분이 될 수 있습니다. - 500 μm의 2 scanfield, 505 X 505 픽셀 해상도, 단일 라인 스캔 800 Hz의 스캔 주파수 : 미리보기 위해, 다음과 같은 설정을 사용합니다. "미리보기"를 클릭하십시오.
- 감쇠기 (레이저) 전원을 전환합니다. 모든 필수 신호가 열 손상을 유도 할 수 레이저 파워의 과도한 양에 이미징 필드를 노출하지 않고 포착되어 있는지 확인합니다.
참고 : 낮은 감쇠기 전력에서 시작하고 시그나 경우 증가난 희미한이다. 초기 시점에서 간질 포스트 - 재관류 포인트에서 호중구가 존재하는 바와 같이 전자가 호중구보다 어둡게 한, 대 식세포, 필요한 최소한의 전력을 결정 게이지로 사용될 수있다.
주 :이 단계는 처음 수행 할 경우, 본래의 혈관 완전성이 예상되는 비 - 허혈 영역의 설정을 조정하고 전력 감쇠기의 설정을 용이하게한다. 레이저 파워가 불안정 않는 후속 실험에서, 이러한 설정은 많은 변경을 요구하지 않는다. - PMT를 설정을 조정합니다.
참고 : PMT의 최대 최적의 이득 전압의 제조업체에 문의하십시오. 권장 임계 값을 넘어 PMT 전압을 설정하면, 높은 신호 대 잡음비가 발생할 것이다. 일반적인 권장은 권장 임계 값과 PMT 이득 전압을 설정하고, 신호는 너무 어둡되어야 필요한 감쇠기 전력을 증가시키는 것이다. - 가까이에 촬상 영역을 선택대규모 에반스 블루 누설 특징 허혈의 가장자리.
- GFP 각각 50분의 525 대역 통과 (BP) 및 655/40 BP 필터를 사용 에반스 푸른 신호를 수집합니다. 진피 구획 내의 콜라겐 섬유의 차 고조파 발생 (SHG) 신호 들어 42분의 475 BP 필터를 사용한다.
- 사용 가능한 이미지 분석 소프트웨어 호환되는 형식으로 이미지를 저장하는 폴더를 만듭니다.
- 500 μm의 2 scanfield, 505 X 505 픽셀 해상도, 그리고 하나의 라인 스캔에서 스캔 주파수 400 Hz에서 : 취득하려면 다음 설정을 사용합니다.
- 4 ㎛의 스텝 크기 100 ㎛의 z를 스택은 호중구 침윤을 모니터링하는, 1 분 간격으로, 시간의 경과를 반복해서 취득 할 수있다.
주 : 특히 높은 이동성 속도, 세포 추적 분석시 어려움이 발생할 수 있습니다 이상 1 분입니다 간격으로 백혈구 (예를 들면, 호중구)합니다. 이 경우, 사용자가 어느 교류의 두께를 감소시킬 수있다quisition는 스택 또는 스캔 주파수를 증가.
주 : 허혈 영역의 획득 요구 스택 (또는 높은 SHG 세기 특징) 압축의 결과로서 작게 나타날 수 있지만, 이후의 재관류 귀 팽윤시킨다 대규모 염증이 발생할 것이다. Z 방향 현저한 감도가 기대된다. 이와 같이, 큰 Z 스택 인수 드리프트를 수용 할 필요가있다. - 이미징 동안 촉촉한 물에 침지 대물 렌즈 귀를 유지하기 위해 정기적으로 PBS와 물을 위로.
참고 : 전형적인 실험은 일반적으로 2 지속 - 4 시간. 실험 디자인에 따라, 그리고 영상의 지속 시간을 연장하는 것이 가능하고, 잘 제어 된 마취 정권과 결합된다.
8. 실험을 종료
- 홍보 기관의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 이산화탄소 질식하여 마우스를 안락사ocedures.
주 : 기관의 규칙, 규정 및 지침의 결정에 따라 항상 승인 된 방법으로 마우스를 안락사. 반복 화상이 필요한 경우 마취가 닳아까지 가열 패드에 마우스를 유지한다. 마우스가 충분한 의식을 회복 모바일입니다되면, 그 케이지에 마우스를 반환합니다.
9. 이미지 분석
주 : 촬상 실험에서 생성 된 데이터가 다른 소프트웨어 패키지에 의해 시각화 될 수있다.
- 상기 영상 분석 소프트웨어를 연다.
- 아래의 파일을 가져 모드를 능가 (→ 열기는 "열기"를 클릭하여 원하는 폴더 →에서 모든 파일을 선택합니다).
- 편집 의사 색상을 기본 색상이 적용되지 않는 경우 (채널 탭에서 편집 → 디스플레이 조정 →, 색상 팔레트에서 원하는 색상을 선택).
- 밝기, 대비 및 배경 (토글 최대 및 최소 값 → 편집 → 디스플레이 조정)을 조정합니다. 파일 크기가 올바른지 확인합니다 (편집 → 이미지 속성 → 형상 탭에서, 복셀의 크기를 확인합니다.이 프로토콜에서, X = 0.99, Y = 0.99, 및 Z = 4).
참고 : 픽셀 해상도에 의해 scanfield 치수를 분할하여 X와 Y를 유도. Z는 각각의 슬라이스의 두께이다.
주 : 이들 데이터 세트의 출력은 최대 투영 동영상으로 표시 될 수있다.
주 : 추적 분석 완전히 생체 내에서의 기능을 이해하기 위해 셀룰러 활동 및 상호 작용을 특성화하기 위해 요구된다. 소프트웨어에서 이용 가능한 스폿 기능을 사용하여 셀 추적의 상세한 설명은 참조 번호 (15) 내의 프로토콜에서 찾을 수있다.
참고 : 참조 (16)의 리뷰 기사에서 발견 될 수있는 많은 정량화 백혈구 마이그레이션하는 방법, 세부 사항이 있습니다.
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Representative Results
그림 1과 같이이 프로토콜은 맞춤형 귀 피부 이미징 플랫폼을 사용합니다. 이 플랫폼의 몇 가지 기능은 특히 생리 설정을 유지하면서 영상을 용이하게하기 위해 설계되었습니다. 가열 황동 플랫폼에 귀를 배치하는 것은 35 ° C의 온도에서 생리 귀에 유지뿐만 아니라 호흡으로 인해 불가피 움직임로부터 귀를 분리. 황동 플랫폼에 금속 클립을 첨가하여 중단 혈류를 유지 귀에 중량을 발휘으로부터 홀더 커버 슬립을 방지하기위한 간격을 만든다. 스테이지 플랫폼은 또한 이미징 과정에 걸쳐 37 ℃에서 마우스를 유지 가열 패드를 수용하도록 설계된다.
커버 슬립 홀더 (도 2)은 커버 슬립 진공 GREA의 도움으로, 상기 금속 홀더에 부착 될 수 있도록 설계그 자체. 커버 슬립 홀더 어댑터의 도움으로 수직 및 수평 축에 유연한 조정을 허용하는 대기에 접속된다. 이러한 방식으로, 사용자는 제 정확하게 귀 위에 커버 슬립의 위치를 조정 한 이후에, 어댑터의 나사 조임에 의해 그 위치를 고정 할 수있다.
이러한 프로토콜에서는, 허혈 및 재관류를 시뮬레이션하도록 자석의 사용을 설명했다. 도 3b 표시 담당자 전에 귀 전망 즉시 허혈 후. 생리적 조건에서 중요한 혈관 거시적으로 가시화 될 수있다. 자석 핀칭 효과가 일시적 자석 제거 과도 창백 효과 (흑색 화살표)에 의해 관측 될 수있는 혈류 줄기.
특정 데모에서, 촬상은 허혈 영역 (도 3c의 에지에 집중 (도 3d). 이 생체 내에 이미징 연구를위한 중요한 랜드 마크를 만들고 독립적 인 실험 사이의 일관성을 유지하는 데 도움이됩니다.
데이터는 보여주고, 그 적외선 모욕에 응답하여, 허혈 영역의 가장자리를 안감과 부상 사이트 (그림 3d 및 영화 1)으로 마이그레이션 그대로 혈관에서 간질로 호중구 출구로 침투한다. 때문에 이전 시점 후 재관류에서 가능한 관류 혈관의 부족으로 다른 염증 모델에 비해 우리는 간질로 마이그레이션 호중구의 지연 응답을 기대합니다. 완전히 이러한 셀을 특성화울라 활동은 셀 추적 분석은 생체 내에서의 기능을 이해하기 위해 사용될 수있다. 속도, 변위를 의미하고, 화성 인덱스는 셀 추적 분석으로부터 얻어 질 수있는 잠재적 리드 아웃의 일부이다.
생체 내에 다중 광자 이미징을위한 주문 제작 귀 피부 단계의 도식도를 그림. (가)의 크기와 귀 이미징 단계의 상위 뷰입니다. (b)는 정면보기 및 치수. 황동 판 귀는 슬릿의 모서리에 접 중단 혈류를 보장 피부와의 접촉 면적을 최소화하기 위해 중간에 플랫폼에 안정성을 제공하기 위하여, 측면에 두꺼운 및 얇은 것을 참고 플랫폼에 휴식. 피드백 프로브를 핀 곡선 홀더 (C) 측면보기. 가열 패드가 될 수 있습니다마스킹 테이프를 사용하여 플랫폼에 고정 된 (도시되지 않음). 리 외., 냇 Protoc 2012 년 8에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 디자인 커버 슬립 홀더의; 측면 및 상위 뷰. 커버 슬립 홀더는 고정 된 위치에 커버 슬립을 보유하고 있으며, 따라서 Z-드리프트를 감소시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. IR 모델입니다. (A) 개략도 자석의 위치를 나타내는. (비) (C) 도식. (D)는 LysM-eGFP는 마우스에서 호중구의 침윤 후 재관류를 나타내는 시간 경과 시퀀스에서 최대 강도 Z 투영 스냅 샷. 경과 시간은 HH에 도시 : mm 형식을. 스케일 바 : 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1. IR 부상에서 호중구 모집. 허혈 1.5 시간 후 LysM-eGFP는 흰둥이 마우스 귀 피부 재관류에 대한 응답으로 호중구 (녹색) 침투를 보여주는 최대 투사의 시간 경과 순서. 이전 시점에서의 부족에반스 블루 신호 (적색) 허혈 후 일시적으로 혈관 폐색을 나타냅니다. 콜라겐 (파란색, 두 번째 고조파 세대). 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)
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Discussion
의미
IR 피부 욕창의 주요 원인 중 하나이다. (배후 피하 조직 및 근육에 비해) 욕창의 초기 단계 (I 및 II)은 인간의 피부의 상태를 설명한다. 그러나, 면역 학적 원인에 대한 이해는 여전히 부족하다. 여기서,이 간극을 해결하기 위하여 마우스 귀 피부에 간단하고 강력한 IR 모델을 제시한다. 우리는 자석 제거 (재관류) 후 하류 면역 반응을 연구 두 개의 자석과 이후의 마우스 귀를 클램핑하여 허혈을 시뮬레이션 할 수 있습니다. 허혈을 유도, 일정 시간마다 귀에 일정한 압력을 생성하기 위해 자석을 이용함으로써, 실험 사이의 재현성 및 일관성을 보장 할 수있다.
이 비 침습적 IR 모델의 강도는 또한 생체 내에 imagin의 잘 확립 된 모델을 이용하여 생체 내 면역 반응에 실시간으로 입증 할 수있는 능력에 달려피부 플랭크 절차에 비해 촬상시 안정감을 제공 귀 피부의 g. 현재 피부 플랭크 모델의 일부는 피부 (4)의 면역 프리 변경할 수 수술을 포함한다. 호흡 운동 5,6- 촬상 동안 모션 - 관련 이슈에 기여할 수 있으므로 또한 피부 자체 측면을 묘화하는 것은 기술적 인 도전을 제시한다. 우리의 현재 모델은 이러한 문제를 우회.
IR 면역 세포의 생리적 반응을 연구에 더하여,이 모델은 또한 당뇨병 증가 산화 스트레스를 통해 IR 손상을 악화시킬 수 당뇨병과 같은 병리학 설정을 적용 할 수있다. 면역 반응을 이해하는 것은 상처 치유의 이해에 기여할 것입니다.
중요한 단계
마우스를 마취되면 체온이 손상과 심체 온도가 급격히 떨어진다. hypot을 방지하기 위해hermia은 외부 가열은 37 ° C에서 심체 온도를 유지하는 것이 필수적이다. 몸 코어에 말단에 위치 귀는, (1)에 의한 생리 학적으로 시원하다 - 2 ° C와 35 ° C로 유지해야합니다. 가열에 이러한 일관성은 세포 역학의 재현 읽기 아웃을 보장합니다. 동시에, 상기 가열 시스템은 마우스를 마취의 전체 길이에 걸쳐 과도하게 가열되지 않도록 선택되어야한다.
모든 피부 이미징 연구를위한 흰둥이 마우스 (BALB / C와 C57BL / 6-C 2J)의 사용은 매우 안료에 의한 반점 부상을 방지하는 것이 좋습니다. 알비노 마우스를 사용할 수없는 경우, 화상 취득시의 레이저 파워의 감소는 색소 마우스에 대한 문제를 완화 할 수있다. 조직 침투의 감소 깊이가 가난한 수집 결과가 발생할 수 있습니다 그러나, 더 최적화가 필요할 수 있습니다.
이어 피부는 매우 섬세; 따라서, 치료는 어떤 상황을 피하기 위해주의해야염증의 원인이 될 수 있습니다. 부적절한 기술의 예로는, 이에 한정되지 않는다 다음 1) 추천 위에 어떤 시간의 과도한 양에 제모 크림을 이탈; 귀 이미징 플랫폼의 슬릿을 통해 귀를 가져 오는 경우 또는 마스킹 테이프의 귀를 분리 할 때 2) 귀에서 과도한 마찰을 적용하는 단계; 3)에 의한 결함 난방 시스템 또는 주변 온도 대신 마우스 핵심 온도를 기록 할 수있는 잘못된 온도 피드백 프로브에 하나, 귀를 과열.
수정 및 문제 해결
귀 준비 절차에 관한 문제 해결의 대부분은 이전에 8 나열되어있다. 귀는 나중 시점 후 재관류에 결상하면, 귀 귀 (도 1)의 두께를 수용하기 위해 금속 클립에 의해 생성 된 0.5 mm 갭을 넘어 팽창있다. 귀를 통해 커버 슬립이 시나리오에서는 배치거시적으로 볼 혈관이보기에서 사라질 때 분명 혈액의 흐름을 방해 할 수 있습니다. 이것은 커버 슬립 홀더와 황동 플랫폼 사이의 큰 격차를 만들어 피해야한다. 이는 수동으로 커버 슬립 홀더 (도 2)의 높이를 조정함으로써, 혹은 두꺼운 금속 클립을 사용하거나, 두 가지 방법으로 수행 될 수있다.
기술의 한계
간질에 에반스 블루 누설 이른 시점 이후에 허혈 허혈 영역의 경계를 표시 이후이 프로토콜에서는, 허혈 영역의 위치를 결정 에반스 블루를 사용했다. 에반스 블루는 통상 혈관 표지 제로서 사용된다. 그러나, 염증성 조건, 혈관 무결성이 심각하게 손상됩니다. 이것은 간질에 에반스 블루의 누설을 초래한다. 이 모델에서, 우리는 곧 재관류 후 혈관과 간질 사이의 대조의 급격한 손실을 관찰합니다. 이와 같이, 세인트백혈구 - 내피 상호 작용이 포함되는 경우 udies, 우리는 서로 다른 크기의 다른 혈관 라벨 에이전트와 실험을하는 것이 좋습니다 (예를 들어, 덱스 트란, 등.).
미래의 응용 프로그램
호중구 피부 IR에 응답하는 방법을 보여주기 위해 LysM-eGFP는 마우스를 사용하는 외에,이 모델은 (단핵구를) 침투 및 주민 간질 (대 식세포) 백혈구 모두 다른 백혈구 반응을 연구에 사용할 수 있습니다. 이 모델은 또한 IR 손상 후 혈액 및 림프의 무결성뿐만 아니라, 백혈구 - 내피 세포 상호 작용을 검사하는 다른 연구들로 확장 될 수있다. MP-IVM 통해 SHG 신호로서 콜라겐을 시각화 할 수있는 능력과 함께, 또한 IR 후, 또는 상처 치유시 콜라겐의 무결성을 모니터링하는 흥미로운 것이다. 요약하면, 우리는 마우스 귀 피부의 면역 반응을 연구하기 위해 생체 내에 이미징을위한 IR의 비 침습, 강력한 모델을 설정했습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
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