Method Article

Desarrollo de un Modelo de recubrimiento pulpar directo para la Evaluación de la Pulpa Curación de Heridas y formación de dentina reparadora en ratones

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

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1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un método paso a paso de realizar el recubrimiento pulpar directo en ratones dientes para la evaluación de la cicatrización de la herida pulpar y la formación de dentina de reparación in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La pulpa dental es un órgano vital de un diente totalmente protegido por el esmalte y la dentina. Cuando la pulpa está expuesta debido a lesiones cariogénicas o iatrogénicas, a menudo se cubre con materiales biocompatibles para acelerar la cicatrización de la herida pulpar. El objetivo final es regenerar la dentina reparadora, una barrera física que funciona como un "sello biológico" y protege el tejido pulpar subyacente. Aunque este procedimiento de recubrimiento pulpar directo se ha utilizado durante mucho tiempo en odontología, el mecanismo molecular subyacente de la cicatrización de heridas pulpares y la formación reparadora de dentina aún no se conoce bien. Para inducir la dentina reparadora, el recubrimiento pulpar se ha realizado experimentalmente en animales grandes, pero menos en ratones, presumiblemente debido a sus pequeños tamaños y a las dificultades técnicas resultantes. Aquí, presentamos un método detallado, paso a paso, para realizar un procedimiento de recubrimiento de pulpa en ratones, incluida la preparación de una cavidad similar a la Clase I, la colocación de materiales de recubrimiento de pulpa y el procedimiento de restauración con compuesto dental. Nuestro modelo de ratón con recubrimiento pulpar será fundamental para investigar los mecanismos moleculares fundamentales de la cicatrización de heridas pulpares en el contexto de la dentina reparadora in vivo, al permitir el uso de ratones transgénicos o knockout que están ampliamente disponibles en la comunidad investigadora.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las caries dentales son una de las enfermedades bucales más prevalentes y la principal causa de intervenciones quirúrgicas en dentición en casi todos los individuos1,2. El pronóstico de las intervenciones quirúrgicas y las restauraciones de un diente depende en gran medida de la respuesta pulpar adecuada y de la cicatrización exitosa de la herida. De hecho, las caries dentales que penetran profundamente a través del esmalte y la dentina con frecuencia conducen a la exposición del tejido pulpar subyacente que a menudo está "cubierto" con materiales dentales, como hidróxido de calcio (Ca(OH)2) o cementos hidráulicos de silicato de calcio (HCSC), incluidos los agregados de trióxido mineral (MTA). El objetivo final de este procedimiento de taponamiento pulpar es acelerar la cicatrización de las heridas pulpares mediante la regeneración de la dentina reparadora, una barrera física que funciona como un "sello biológico" para proteger el tejido pulpar subyacente y aumentar la esperanza de vida del diente y la salud bucal en general. Sin embargo, el mecanismo subyacente de la cicatrización de las heridas pulpares y la formación de dentina reparadora no se comprende completamente.

Para comprender mejor los mecanismos de cicatrización de heridas pulpares y la formación de dentina reparadora in vivo, se utilizaron previamente varios animales, incluidos monos, perros y cerdos3-5. Entre ellos, las ratas se utilizan con frecuencia porque son relativamente más pequeñas en tamaño en comparación con los otros animales, pero sus dientes son lo suficientemente grandes como para realizar el taponado pulpar directo sin ninguna dificultad técnica6-10. Estos modelos animales son alternativas ideales a los estudios en humanos para examinar las respuestas pulpares y la formación reparativa de dentina. Sin embargo, su utilización se limita a estudios observacionales a nivel celular, y apenas proporcionan información mecanicista durante la formación de dentina reparadora a nivel molecular.

Los recientes avances técnicos en ingeniería genética proporcionaron herramientas de investigación invaluables e indispensables -ratones que albergan un gen que se sobreexpresa o se elimina- que son fundamentales para estudiar los mecanismos moleculares de las enfermedades humanas in vivo. El número de diferentes cepas de ratones transgénicos o knockout que son estratégicamente inducibles de una manera específica para cada célula está creciendo continuamente en la comunidad científica. Por lo tanto, examinar la cicatrización de heridas pulpares y la regeneración reparadora de la dentina en estos ratones ayudaría en gran medida a acelerar nuestra comprensión de estos procesos a nivel molecular. Sin embargo, el uso de ratones se amortigua significativamente, ya que realizar un procedimiento de recubrimiento de pulpa en un diente de ratón es técnicamente desafiante debido a su tamaño en miniatura. Aquí, presentamos nuestro método reproducible de realizar el recubrimiento pulpar directo en ratones para la evaluación de la cicatrización de heridas pulpares y la formación de dentina reparadora in vivo.

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Protocol

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Los ratones fueron adquiridos de Jackson Laboratory y se mantienen en un vivero libre de patógenos en la División de UCLA de Medicina de Laboratorio Animal (DLAM). Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales aprobados desde el Comité de Investigación Animal del Canciller (ARC # 2016-037).

1. Ratón anestesia

  1. Utilizar ratones hembra C57 / BL6 de ocho semanas de edad (n = 3).
  2. Anestesiar los ratones utilizando ketamina (80 a 120 mg / kg de peso de ratón) / xilazina soluciones (5 mg / kg de peso de ratón) y administrar por vía intraperitoneal (ip) a una dosis de 10 ml / kg.
  3. Preparar ketamina (80 - 120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluciones y administrarlos por vía intraperitoneal (ip) a una dosis de 10 ml / kg.
  4. Confirman que los ratones están completamente anestesiados mediante la realización de una pizca dedo del pie.

2. Procedimiento de recubrimiento pulpar

  1. Coloque el soporte de boca en la boca del ratón.
  2. Fije el soporte boca sobre la mesa de manera que la quead quede hacia arriba.
  3. Coloque el microscopio (10X) en la parte superior de la boca de manera que el primer molar superior es totalmente visible.
  4. El uso de la fresa de ¼ de vuelta en una pieza de mano de alta velocidad a 200.000 rpm, quitar la parte de esmalte del diente en el medio hasta que la pulpa es visible a través de la dentina transparente. No exponer la pulpa con la fresa.
  5. El uso de un K-lima de endodoncia # 15 (diámetro de 150 micras), perforar a través de la dentina y exponer la pulpa.
    NOTA: Se debe tener especial cuidado para que los restos de dentina no consigue empujado en la pulpa. Esto se puede evitar mediante la rotación del archivo-K trimestral y luego tirando de la K-archivo fuera.
  6. Mezclar MTA con H2O estéril de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Entregar y colocar el MTA en la pulpa expuesta con la punta del explorador. Utilice el lado posterior de la punta de papel (fino) para empacar el MTA en la pulpa expuesta con unos golpecitos suaves. La parte gruesa de la punta de papel es plano y por lo tanto permitepara la condensación adecuado de la MTA en la pulpa expuesta.
  7. Grabar el diente durante 15 s, colocando el grabador de ácido fosfórico al 35% cuando sólo cubre el diente. Tenga especial cuidado para limitar la colocación del reactivo de ataque, ya que puede irritar los tejidos gingivales.
    NOTA: El reactivo de ataque viene en una jeringa y se utiliza para hacer rugosa la superficie de los dientes de modo que los adhesivos dentales pueden fluir en mediar la unión micromecánica sobre el diente. Debido a que son viscoso, puede ser en sí misma mediante la aplicación de pequeñas cantidades directamente en el diente.
  8. Utilice negativa de succión-presión para eliminar el reactivo de ataque. Utilice una bolita de algodón que se empapa ligeramente con H 2 O para eliminar los residuos de la solución de ataque. Repita este paso hasta que el grabador se elimina por completo del diente.
  9. El uso de un limpiador de aire comprimido, secar suavemente el diente.
  10. Aplicar los adhesivos dentales utilizando el lado posterior de la punta de papel.
  11. Hacer que la capa adhesiva delgada con aire comprimido durante 3 s.
  12. doUre los adhesivos dentales durante 20 s usando la unidad de curado por luz.
  13. Coloque el composite fluido en pequeñas cantidades sobre el diente que fue internacional con MTA. Use la punta del explorador a fluir el material compuesto en las ranuras de los dientes.
  14. Curar el material compuesto durante 30 s usando una unidad de fotocurado para polimerizar la misma. Confirmar que el compuesto está completamente curado y duro usando el explorador.

3. Post-op Cuidado

  1. Administrar carprofeno (5 mg / kg) por vía subcutánea (sc) inmediatamente después del procedimiento de recubrimiento pulpar.
  2. Coloque los ratones en una almohadilla térmica a baja potencia para mantener a los animales tibia antes de que despierten.
  3. Devolver los ratones para el vivero de la vivienda.

Contratación 4. Tejido

  1. Después de 5 - 6 semanas, la eutanasia a los ratones por dislocación cervical bajo una condición de anestesia completa con isoflurano.
  2. Retirar con cuidado el maxilar superior fuera de la base del cráneo y lo puso en un tubo de 50 ml. Fijar la entire maxilar que contiene tanto el diente pulpa-tapado y destapado el diente contralateral en 4% de paraformaldehído en PBS, pH 7,4, a 4 ° C durante la noche, y luego la almacena en una solución de etanol al 70%.
    NOTA: El paraformaldehído es tóxico y cancerígeno. El uso adecuado de paraformaldehído debe controlarse como se indica en los procedimientos operativos estándar (SOP).
  3. Analiza los maxilares ratón usando el escaneo μCT. Para asegurar el maxilar durante la exploración, envolver las muestras con una gasa empapada con 70% de etanol y colocarlos en el tubo de cultivo de células de 15 ml.

5. Escaneo μCT

  1. Preparar las muestras para μCT de exploración. Brevemente, las muestras envolver con una gasa empapada con 70% de etanol y fijarlos en un tubo cónico de cultivo de células de 15 ml genérico. Montar el tubo en la etapa de exploración μCT, como se indica en las instrucciones del fabricante.
  2. Ajuste la fuente de rayos X a una corriente de 145 mu, una tensión de 55 kVp, y un tiempo de exposición de 200 ms.
  3. Realizar la adquisición de imágenes con el escáner μCT a una resolución de 20 micras y con un filtro de 0,5 mm de Al.
  4. Reconstruir la imagen y visualizarlo 11.
  5. Una vez que la exploración μCT, inicie descalcificación con EDTA al 5% y 4% de sacarosa en PBS (pH 7,4) durante 2 semanas.

6. procesamiento de tejido y tinción

  1. Incrustar los tejidos descalcificadas en parafina. Antes de ser colocado, recortar el maxilar haciendo un corte sagital de inmediato anterior al del primer molar. Si bien la incrustación, la posición de esta superficie hacia abajo, de manera que la sección longitudinal de la primera molar es la superficie de corte.
  2. Usando el microtomo, preparar las diapositivas 5 micras de grosor. Las áreas de recubrimiento pulpar generalmente coinciden con la raíz distopalatina (DP), que puede ser utilizado como un punto de referencia. Determinar el área exacta de interés mediante el examen de la histología en el microscopio óptico y la comparación de las imágenes μCT.
  3. Para tinción H & E, deparaffinize y rehidratar los portaobjetos con xileno (2 x) y etanol diluido en serie (100% EtOH 2x, 95% de EtOH 2x, y 70% de EtOH 1x).
  4. Enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo.
  5. Teñir con una solución de hematoxilina durante 2,5 minutos y enjuagar con agua del grifo.
  6. Sumergir los portaobjetos en 95% de etanol durante 1 min.
  7. Teñir con una solución de eosina durante 1 min y enjuague con agua del grifo.
  8. Deshidratar con etanol diluido en serie (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x, y 100% EtOH 3x) y xileno (3x).
  9. Montar los portaobjetos con solución de montaje.

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Results

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A continuación, mostramos los procedimientos paso a paso para llevar a cabo el recubrimiento pulpar de los dientes ratones. Uno de los aspectos clave de recubrimiento pulpar en ratones es tener el aparato apropiado. En este sentido, teniendo el microscopio con un aumento de potencia de 10X es esencial (Figura 1A). Para crear una preparación de Clase-I-al igual que en el diente, se utilizó una fresa de ¼ de vuelta en una pieza de mano de alta velocidad eléctrica a 200.000...

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Discussion

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Actualmente, hay varios modelos experimentales disponibles para validar los efectos in vivo de los materiales dentales, andamios, o factores de crecimiento sobre la diferenciación odontogénico de células madre de la pulpa dental (DPSCs) 13. Estos modelos incluyen el trasplante autólogo de ectópico DPSCs en un órgano, tales como la cápsula renal, o trasplante subcutáneo de DPSCs en ratones inmunocomprometidos con andamios 14,15. Sin embargo, estos métodos están limitados en que su efecto od...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por R01DE023348 (RHK) del NIDCR / NIH y la Beca de Investigación de la Facultad (RHK) del Consejo de Investigación del Senado Académico de la División de la Universidad de California en Los Ángeles.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopio estereoscópico BM-LEDMEIJI TechnoMicroscope 
Optima MCX-LED Bien Air Dental1700588-001Motor eléctrico
isofluranoHenry Schein salud animalNDC 11695-0500-2
1/4 fresa redondaBrasseler001092T0
Endodoncia K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Punto de papelHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent producto Inc.Grabador de ácido fosfórico
OptiBond SoloPlusKerr29669Adhesivos
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Unidad de luz de polimerización
Tinte de caracterizaciónBiscoT-14012Compuesto fluido
SkyscanBreuker1275uCT
MicromThermoHM355SMicrotomo
Hematoxilina-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16 Solución demontaje
escáner

References

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