-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

Resumen

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

Resumen

Un oxígrafo de alta resolución es un dispositivo para medir el consumo de oxígeno celular en un sistema de cámara cerrada con muy alta resolución y sensibilidad en muestras biológicas (células intactas y permeabilizadas, tejidos o mitocondrias aisladas). El dispositivo de oxigrama de alta resolución está equipado con dos cámaras y utiliza sensores polarográficos de oxígeno para medir la concentración de oxígeno y calcular el consumo de oxígeno dentro de cada cámara. Las tasas de consumo de oxígeno se calculan mediante software y se expresan como picomoles por segundo por número de células. Cada cámara de oxígrafo de alta resolución contiene un tapón con puertos de inyección, lo que la hace ideal para valoraciones de inhibidores de desacoplador de sustrato o protocolos de valoración de detergente para determinar concentraciones efectivas y óptimas para la permeabilización de la membrana plasmática. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en una amplia gama de tipos de células y también proporciona información sobre la calidad e integridad mitocondrial, y la capacidad máxima del sistema de transporte de electrones respiratorio mitocondrial.

Introducción

Las mitocondrias desempeñan funciones importantes en el metabolismo de la energía celular, especialmente mediante el uso de oxígeno para producir el trifosfato de adenosina (ATP). Ellos están implicados en la muerte celular y en varias enfermedades humanas. fosforilación oxidativa mitocondrial (fosforilación oxidativa) combina el transporte de electrones a lo largo de la cadena de transporte de electrones con el consumo de oxígeno y la síntesis de ATP. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos mitocondrial (TCA) está implicada en la conversión de proteínas, carbohidratos y grasas en compuestos ricos en energía como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y dinucleótido de flavina adenina (FADH _2). Los electrones del NADH y FADH ₂ se transfirieron a continuación a los complejos de proteínas de la cadena de transporte de electrones respiratorios (I a IV) localizado en la membrana mitocondrial interna. Además, otros dos vías redox pueden transferir electrones a la cadena de transporte de electrones: i) mitocondrial de electrones de transferencia de flavoproteínas (ETF) que se encuentra en la cara de la matriz interior mitomembrana mitocon-, y materiales de electrones de β-oxidación de ácidos grasos; y ii) mitocondrial glicerofosfato deshidrogenasa que oxida glicerofosfato a dihidroxiacetona fosfato y se alimenta electrones a la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Complejo IV (el último aceptor de electrones) transfiere los electrones a una molécula de oxígeno, la conversión de oxígeno a dos moléculas de agua. En movimiento de los electrones de complejo de la cadena de transporte de electrones respiratoria I a IV está acoplado con el flujo de protones a partir de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana que establece un gradiente electroquímico a través de la membrana interna mitocondrial. Después, mitocondrial complejo V (ATP sintasa) lanzaderas los iones de hidrógeno de nuevo en la matriz mitocondrial y sintetiza moléculas de ATP. Función de la fosforilación oxidativa se puede evaluar in vivo e in vitro usando diversas técnicas y diversos estados respiración mitocondrial se pueden obtener. En las mitocondrias aisladas de la siguiente respiratoestados ry se pueden medir: i) basal respiración mitocondrial (estado 1), ii) el consumo de oxígeno después de la adición de los sustratos específicos de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial (estado 2), iii) el consumo de oxígeno mitocondrial máxima después de la adición de concentraciones saturantes de difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) y, iv) la respiración en reposo después del consumo de ADP (convertida en ATP) (estado 4). En células intactas los siguientes estados respiratorios se pueden medir: i) basal consumo de oxígeno celular en presencia de sustratos endógenos y ADP, ii) el consumo de oxígeno celular basal en presencia de oligomicina (oligomicina insensible a la respiración) y sensible a la oligomicina respiración (ATP volumen de negocios), iii) FCCP respiración desacoplada, y iv) la respiración no mitocondrial después de la adición de antimicina A y la rotenona. En las células permeabilizadas, sustratos específicos de los complejos de la cadena de transporte de electrones y ADP se pueden añadir y complejos dependientes de máximas velocidades de respiración sUCH I- tan complejo, II- y respiratoria IV-dependientes se puede medir.

Las mediciones de la respiración celular proporcionan información importante sobre la capacidad respiratoria mitocondrial específica de los complejos I-IV, la integridad mitocondrial y el metabolismo de ^{1, 2, 3} energéticos. Uno de los dispositivos que permiten mediciones de consumo de oxígeno mitocondrial con gran precisión, resolución y sensibilidad es la alta resolución oxygraph ^4. El dispositivo de alta resolución oxygraph contiene dos cámaras con puertos de inyección y cada cámara está equipada con un sensor de oxígeno polarográfico. suspensiones mitocondriales celulares o aisladas se agitan continuamente en el respirómetro. Para evaluar la función mitocondrial, sustratos e inhibidores de la actividad del complejo mitocondrial puede añadirse siguiendo protocolos estándar. Sustratos e inhibidores se pueden valorar por inyección into las cámaras del oxygraph, y las tasas de consumo de oxígeno se calculó utilizando el software y se expresó como picomoles por segundo por número de células. De alta resolución de respirometría ofrece varias ventajas sobre los dispositivos tradicionales y convencionales electrodo de oxígeno polarográfico incluyendo aumento de la sensibilidad y la capacidad de trabajar con un número pequeño de muestras biológicas tales como células intactas o permeabilizadas. Además, cada dispositivo contiene dos cámaras, y las tasas respiratorias se pueden grabar simultáneamente para la comparación de las concentraciones de oxígeno. La alta resolución de oxygraph también tiene la ventaja de la reducción de la fuga de oxígeno a partir de las cámaras del dispositivo en comparación con los dispositivos tradicionales de electrodos de oxígeno polarográficos. Otro dispositivo desarrollado recientemente para medir el consumo de oxígeno celular es el 96 pocillos analizador de flujo extracelular ^5. El analizador de flujo extracelular está equipado con fluorescencia en lugar de sensores polarográficas. Las ventajas de la extracelularanalizador de flujo en comparación con la de alta resolución oxygraph son i) que es un dispositivo en gran medida automatizado, ii) es posible medir el consumo de oxígeno en 24 y placas de 96 pocillos para cribado de alto rendimiento, por lo tanto requieren menores cantidades de muestras biológicas, y iii) es posible método de medición del flujo glucolítico celular. Las desventajas del analizador de flujo extracelular en comparación con el de alta resolución oxygraph son i) los altos costos del dispositivo y de los consumibles, tales como placas fluorescentes, que son de un solo uso, y ii) sólo cuatro compuestos por ensayo / pocillo son inyectables , por lo tanto, el sistema no es factible para protocolos de titulación sustrato-desacoplador-inhibidor.

En el presente estudio, utilizamos respirometría de alta resolución para determinar la respiración mitocondrial. Para los experimentos de consumo de oxígeno celulares, las células se permeabilizaron para permitir la entrada de ADP exógeno y sustratos oxidables mitocondriales para la alimentación de electrones en Complexes del sistema respiratorio. Este enfoque permite la disección de los complejos mitocondriales individuales capacidades respiratorias, que es una clara ventaja en comparación con las células intactas (muchos sustratos son células impermeant). Sin embargo, célula permeabilización de la membrana perturbará la barrera entre el citosol y en el espacio extracelular y medio (lavado de solutos citosólicas) y la composición del espacio intracelular está equilibrada con el medio extracelular. Uno de los inconvenientes de las células permeabilizadas más células intactas es que la membrana externa mitocondrial puede ser dañado si se emplean cantidades excesivas de detergente durante la permeabilización celular. En células intactas, basal, acoplar y desacoplar la respiración de las células intactas se puede medir. Este método evalúa el consumo de oxígeno de las células intactas sin la adición de sustratos exógenos y ADP, la reproducción de la función respiratoria en la célula integrada y que también proporciona información sobre transpo electrones mitocondrial maximalcapacidad rt ^{6, 7.} Una de las ventajas de las células intactas más de células permeabilizadas es que entorno celular no se interrumpe y las mitocondrias están en contacto con el conjunto de componentes de las células. Con el fin de permeabilizar la membrana plasmática celular, detergentes tales como digitonina se han usado ^8. Sin embargo, la integridad de la membrana externa mitocondrial puede verse comprometida si se emplean cantidades excesivas de digitonina. Para confirmar que la integridad de la membrana externa mitocondrial no se vea comprometida en las células permeabilizadas, la titulación de digitonina se realiza para determinar la concentración óptima para la permeabilización celular. Para estos experimentos, las células se resuspendieron en medio de la respiración y la concentración de digitonina se titula mediante respirometría en presencia de sustratos y ADP mitocondriales, y las tasas de respiración se miden. La respiración de células intactas, no permeabilizadas no se estimula en presencia de mitochondrial sustratos y ADP. Sin embargo, la posterior titulación digitonina por pasos produciría permeabilización gradual de las membranas de plasma, y ​​se obtiene una óptima concentración de digitonina. Esto se demuestra por el aumento de la respiración hasta alcanzar la plena permeabilización. Calidad mitocondrial y la integridad de la membrana externa se pueden verificar mediante la adición exógena citocromo c ^{2, 9.} El citocromo c es una proteína que lleva 12 kDa de electrones de la cadena mitocondrial de transporte de electrones ^{10, 11, 12.} Se localiza en el espacio intermembrana mitocondrial, y está implicado en el consumo de oxígeno, que lleva electrones de complejo III a IV complejo. Una vez que la membrana externa mitocondrial está dañado, el citocromo c se libera, y el consumo de oxígeno mitocondrial se reduce. Tras la adición de citocromo c exógeno, cualquier aumento en la respiración mitocondrial es indicativo de unainterrumpida membrana externa mitocondrial.

En las células permeabilizadas, sustratos e inhibidores de la actividad del complejo mitocondrial se añaden después de varios protocolos ^{3, 9.} Por ejemplo con el fin de investigar la frecuencia respiratoria complejos impulsada mitocondriales, el siguiente protocolo se puede utilizar. Después de la permeabilización de las células, primero complejo I se estimula por el malato de sustratos y glutamato, que generan NADH como sustrato para la cadena respiratoria y provocar la activación del complejo I. Después, se añade ADP para la conversión a ATP (estado 3, activa complejo I-dependiente de la respiración). Después de que se alcanza un valor estable, rotenona (complejo I mitocondrial inhibidor) se administra para inhibir el complejo I. La rotenona es seguido por succinato de FADH ₂ y para activar el complejo II (II dependiente de la respiración complejo el estado 3, activa). Con el fin de medir la respiración IV dependiente de complejo, primero complejo IIIrespiración dependiente es inhibida por la adición de antimicina A (mitocondrial inhibidor del complejo III). Después, complejo respiración IV-dependiente se estimula mediante la administración de ascorbato y tetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD puede auto-oxidar en el tampón de la respiración, por lo tanto la máxima complejo IV dependiente de la tasa de respiración (estado 3) se calcula restando las tasas de respiración antes y después de la adición de azida de sodio, un inhibidor del complejo IV mitocondrial. Los experimentos de respiración pueden llevarse a cabo en dos cámaras de un oxygraph en paralelo-uno que sirve como control (células no estimuladas), los otros que contienen las células estimuladas. Obviamente, las células pueden ser pre-tratadas de varias maneras, por ejemplo, con fármacos que afectan las funciones mitocondriales, antes de su consumo de oxígeno se mide en la cámara de oxygraph. Este protocolo permite el examen funcional de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial individuales. Además, se puede medir ADP estimulada máximarespiración (estado 3) de las células permeabilizadas, utilizando ácido graso exógeno en forma de palmitato. En este protocolo, las acciones concentradas de palmitato de sodio se conjugan con albúmina de ácidos grasos de ultra bovino libre de suero (BSA) (relación 6: 1 molar palmitato: BSA). Posteriormente, las células primero se permeabilizadas con digitonina y la respiración mitocondrial se evalúa mediante la adición de carnitina y palmitato seguido de la adición de ADP (estado 3, la respiración máxima). A continuación, se añade oligomicina para imitar el estado 4 (4o estado) y la relación del control respiratorio (valor RCR) se calcula como el estado 3 / estado 4o. β-oxidación promueve la producción de acetil CoA (que entra en el ciclo TCA) y la generación de FADH ₂ y NADH, los electrones de los cuales se pasan a la cadena de transporte de electrones por flavoproteína de electrones transferencia y β-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa. Las mitocondrias son en el centro del metabolismo de ácidos grasos y se describen protocolo palmitato-BSA puede ser utilizado por los investigadores que examinaron grasaty la oxidación de ácidos. En células intactas, se añaden activadores e inhibidores de la actividad del complejo mitocondrial siguiendo un protocolo diferente ^{6, 9.} Para estos experimentos, primero el consumo de oxígeno de las células no permeabilizadas en ausencia de sustratos exógenos se mide (fosforilación de la tasa de respiración). Entonces, la tasa de respiración no de fosforilación se mide después de la adición de oligomicina, que es un inhibidor de la ATP sintasa mitocondrial. Posteriormente, el protonóforo carbonil cianuro de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) se administra a varias concentraciones y se mide la frecuencia respiratoria mitocondrial desacoplado máxima. Protonóforos como FCCP pueden inducir un aumento de la permeabilidad de protones de la membrana interna, lo que permite el movimiento pasivo de protones para disipar el gradiente de quimiosmótica. Un aumento en la permeabilidad de protones desacopla la respiración oxidativa (sin producción de ATP) y induce un aumento en oxygen consumo. Después, se añaden rotenona y antimicina A para inhibir la respiración mitocondrial y la respiración mitocondrial no se resta de todas las otras frecuencias respiratorias.

Las tasas de consumo de oxígeno se pueden expresar como IO ₂ [pmol x seg ^-1 x 10 ^-6 células] (flujo de oxígeno por millón de células) que se calcula dividiendo el flujo de oxígeno-volumen específico (en la cámara de oxígeno cerrado), JV, O ₂ [pmol x seg ^-1 x ml ^-1] por la concentración de células en la cámara celular (número de células por volumen [10 ⁶ células ∙ ml ^{1]) 15.} Masa de células de flujo de oxígeno específico, JO ₂ [pmol x seg ^-1 x mg ^-1], es el flujo por célula, IO ₂ [pmol x ^seg-1 x 10 ^-6 células], dividido por la masa por célula [10 mg ∙ ⁶ células]; o volumen específico de flujo, JV, _O2 [pmol x seg ^-1 x ml ^-1], dividido por la masa por volumenUME [mg ∙ ml ^1]. JO ₂ es el flujo de oxígeno por la proteína celular, peso seco o volumen celular.

En el presente estudio el uso de alta resolución respirometría, describimos los protocolos para determinar i) la concentración de digitonina óptima para completa permeabilización de la membrana plasmática celular (ensayo de valoración de digitonina), ii) integridad de la membrana externa mitocondrial usando exógena citocromo c, iii) los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial I , las tasas respiratorias máximas II y IV en las células HepG2 digitonina permeabilized en presencia de ADP exógeno y sustratos de la cadena respiratoria mitocondrial, y iv) basal, junto y máximo respiración desacoplada (máxima capacidad de transporte de electrones) de las células intactas sin la adición de sustratos exógenos y ADP, la reproducción de la función respiratoria en la célula integrada.

Protocolo

1. Cultura de la célula

1. Células de cultivo humano hepatoma HepG2 ⁶ en 25 cm ² frascos de cultivo de células en medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) que contiene 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en una incubadora (5% CO _2, 95% de aire) (densidad de siembra: 1 x 10 ⁶ células por 25 cm ² frasco de cultivo celular, tiempo de incubación en la incubadora a 37 ° C: 48 h, la densidad de células en confluencia: 4-5 x 10 ⁶ células por 25 cm matraz de cultivo de ² células).
2. Realizar los experimentos cuando las células son 90% a 95% de confluencia.

2. alta resolución Respirometría calibración de sensores de oxígeno polarográficos

1. Pipetear 2,1 ml de tampón de respiración en una cámara de oxygraph y se agita la memoria intermedia continuamente utilizando una barra de agitación magnética presente en la cámara (700 rpm) a 37 ° C durante 1 h hasta que una señal de flujo de oxígeno estable dese obtiene el sensor de oxígeno polarográfico.
   NOTA: electrodos de oxígeno polarográficos dentro de cada concentración de oxígeno medida cámara de oxygraph y calcular el consumo de oxígeno (flujo) dentro de cada cámara. La concentración de oxígeno y las tasas de consumo de oxígeno (flujo) se visualizan en tiempo real en línea en un ordenador utilizando el software de adquisición y análisis de datos.
2. Realizar una calibración de aire del sensor de oxígeno polarográfico de acuerdo con protocolos ¹⁴ del fabricante.
   NOTA: La calibración de los sensores de oxígeno polarográficas en los medios de comunicación la respiración y la concentración de oxígeno en los medios de comunicación en la saturación del aire de temperatura experimental se realiza sólo una vez al día por la mañana. Después, los medios de comunicación pueden ser removidos de las cámaras y las células se volvieron a suspender en un medio de la respiración fresca se añaden a una cámara oxygraph y se miden las velocidades de respiración. Después de que el primer experimento, la cámara se puede lavar y la serie adicional de experimentos se puede realizar en tél mismo la cámara sin más calibraciones.

3. La tripsinización de células adherentes, células Counting

1. En el día del experimento, aspirar el DMEM a partir de la 25 cm matraz de cultivo de ² células.
2. Enjuagar la monocapa de cultivo celular en el matraz de cultivo con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Pipetear 0,5 ml de 25 mg / ml de solución de tripsina (precalentado a 37 ° C en un baño de agua a 37 ° C) en la monocapa de células en el matraz de cultivo e incubar durante 5 min a 37 ° C en una incubadora (5% de CO ₂ , 95% de aire).
4. Pipeta 5 ml de DMEM que contenía FBS al 10% en las células desprendidas en el frasco de cultivo celular y suspender las células mediante pipeteo.
5. Transferencia de células a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar resuspendió durante 5 min a 350 xg a temperatura ambiente y se decanta el sobrenadante.
6. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de tampón de respiración ¹³ (T capaces 1).
i> Contar las células usando un contador de células y volver a suspender en el tampón de respiración a una densidad final de 1 x 10 ⁶ células / ml. Dado que las tasas de respiración celular se normalizaron al número de células, contar las células con un contador de células exacta y precisa.

4. alta resolución Respirometría

1. Después de la calibración de aire (realizado solamente una vez al día, los pasos 2.1 a 2.2), aspirar el medio de la respiración de una cámara del oxygraph y añadir 2,1 ml de suspensión de células (1 x 10 ⁶ células / ml) de la etapa 3.7 a la cámara.
2. Cierre de la cámara de oxygraph mediante la inserción del tapón.
3. Agitar las células continuamente utilizando una barra de agitación magnética presente en la cámara (700 rpm) a 37 ° C y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable.
   NOTA: La concentración de oxígeno y la señal de flujo de oxígeno se visualizan en tiempo real en línea en un ordenador utilizando el software de adquisición y análisis de datoss = "xref"> 14.
4. Después, inyectar sustratos e inhibidores de la respiración mitocondrial a través de los puertos de inyección de titanio de los tapones usando los siguientes protocolos.

5. La digitonina titulación en células intactas por respirometría

1. Preparar una suspensión de células que contiene la cámara de oxygraph (1 x 10 ⁶ / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 4.1 a 4.3 del protocolo.
2. Inyectar 2 l de rotenona mM 0,2 (0,2 M) 'PRECAUCIÓN' en la cámara de oxygraph que contiene la suspensión celular a través de la abertura de inyección de titanio del tapón cámara usando una jeringa y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable .
   NOTA: Todas las inyecciones en los siguientes pasos se realizan a través de los puertos de inyección de titanio de tapones utilizando jeringas. Además de la rotenona es opcional (se evita el flujo inverso de electrones) y puede ser omitida para experimentos de titulación digitonina, verel paso 6.3.
3. Inyectar 20 l de succinato 1 M (10 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable.
4. Inyectar 10 l de 0,5 M de ADP (2,5 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable.
5. Inyectar 2 l de digitonina 2 mM (2 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular de 2-5 min hasta que se alcanza una señal de oxígeno estable.
6. Una vez más inyectar 2 l de 2 mM de digitonina en la cámara oxygraph y registrar la respiración celular de 2-5 minutos hasta que se logre una señal estable de oxígeno.
   NOTA: adición gradual de digitonina a las células inducirá un aumento del consumo de oxígeno celular y la señal de flujo de oxígeno se incrementará.
7. Continuar inyectando 2-4 l de 2 mM paso a paso digitonina (2-4 mM cada paso) en la cámara. Después de cada paso, grabar la respiración celular de 2-5 mhasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable.
   NOTA: Detener la inyección de digitonina cuando la señal de flujo de oxígeno alcanza un nivel máximo y más inyecciones de digitonina no aumentan la tasa de respiración. Los lectores deben determinar la concentración óptima de digitonina en sus laboratorios utilizando sus propios reactivos y uso obtenido concentración óptima de digitonina en los pasos 6.2 y 7.2 de los siguientes protocolos para sus experimentos.

6. Evaluación de la membrana mitocondrial externa Integridad: citocromo C

1. Preparar una suspensión de células que contiene la cámara de oxygraph (1 x 10 ⁶ / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 4.1 a 4.3 del protocolo.
2. Inyectar 2 l de digitonina 8 mM (8 M) en la cámara de oxygraph que contiene la suspensión de células (1 x 10 ⁶ / ml) y permeabilizar las células durante 5 min.
3. Inyectar 20 l de succinato 1 M (10 mM) en la cámara de oxygraph y registrar respirat celularion durante 5-10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable.
4. Inyectar 10 l de 0,5 M de ADP (2,5 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable.
   NOTA: La adición de ADP a las células estimulará complejo I e inducir un aumento en el consumo de oxígeno, y la señal de flujo de oxígeno se incrementará y estabilizar.
5. Inyectar 5 l de 4 mM citocromo c (10 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular durante 5-10 minutos hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable.
6. Finalmente inyectar 1 l de 4 mg / ml oligomicina (2 mg / ml) y registrar la respiración celular hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable.

7. estimulada por ADP máxima Respiración (estado 3) de células permeabilizadas HepG2

1. Preparar una suspensión de células que contiene la cámara de oxygraph (1 x 10 ⁶ / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 4.1 a 4.3 del protocolo.
2. Inyectar 2 l de digitonina 8 mM (8 M) en la cámara de oxygraph que contiene la suspensión celular y permeabilizar las células durante 5 min.
3. Inyectar 12,5 l de 0,8 M de malato (5 mM) y 10 l de 2 M de glutamato (10 mM) en la cámara de oxygraph. se consigue la respiración celular Record hasta que una señal de flujo de oxígeno estable.
4. Inyectar 10 l de 0,5 M ADP (2,5 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que el oxígeno aumenta la señal de flujo y estabiliza.
   NOTA: La adición de ADP a las células induce un aumento en el consumo de oxígeno y la señal de flujo de oxígeno se incrementará.
5. Inyectar 2 l de rotenona 0,2 mM (0,2 M) "Atención" en la cámara oxygraph y registrar la respiración celular hasta que la señal disminuye el flujo de oxígeno y se estabiliza.
6. Posteriormente, se inyectan 20 l de 1 M de succinato (10 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que se incrementa la señal de flujo de oxígenoy estabiliza.
7. A continuación, se inyectan 2 l de 5 mM antimicina (5 M) "Atención" en la cámara oxygraph y registrar la respiración celular hasta que la señal disminuye el flujo de oxígeno y se estabiliza.
8. Entonces inyectar 2,5 l de ascorbato 0,8 mM (1 mM) e inmediatamente después de inyectar 2,5 l de TMPD 0,2 mM (0,25 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que el oxígeno aumenta la señal de flujo y estabiliza.
9. Finalmente inyectar 10 l de azida de sodio 1 M (5 mM) 'PRECAUCIÓN' en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que la señal disminuye el flujo de oxígeno y se estabiliza.

8. Consumo de oxígeno de las células intactas

1. Preparar una suspensión de células que contiene la cámara de oxygraph (1 x 10 ⁶ / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 4.1 a 4.3 del protocolo.
2. Se inyecta 1 l de 4 mg / ml oligomicina (2 mg / ml) en la cámara de oxygraph que contiene una suspensión de célulasse logra d registro respiración celular hasta que una señal de flujo de oxígeno estable.
3. Posteriormente inyecte 1 l de 0,2 mM de FCCP (0,1 M) "Atención" en la cámara oxygraph y registrar la respiración celular hasta que las señales de flujo de oxígeno aumenta y se estabiliza.
4. Inyectar 3 l de 0,2 mM de FCCP (0,4 M) a la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que se incrementa la señal de flujo de oxígeno más y se estabiliza.
5. Valorar FCCP en 0,1 a 0,3 M pasos mediante la inyección de 1 a 3 l de 0,2 a FCCP 1 mM (0,1 a 2 M de concentración final en la cámara) en la cámara de oxygraph hasta que la señal de flujo de oxígeno alcanza sus niveles máximos y no hay nuevos aumentos y luego comienza a disminuir.
   NOTA: Deje de inyectar FCCP cuando la señal de oxígeno alcanza un nivel máximo y comienza a disminuir.
6. A continuación, inyectar 2 l de rotenona 0,2 mM (0,2 mM) y 2 l de 5 mM antimicina A (5 M) en la cámara. la respiración registro hasta tél de la señal de flujo de oxígeno disminuye y se estabiliza.

Resultados

Determinación de la concentración óptima de digitonina para la permeabilización celular: Titulación Experimento digitonina

Digitonina valoración se realiza para determinar la concentración óptima para la permeabilización de las células HepG2. Para estos experimentos, digitonina se valora en células intactas en presencia de rotenona, succinato (mitocondrial complejo sustrato II) y una cantidad saturante de ADP (para inducir el estado 3 complejo II-dependiente), y respiratorias tasas se midieron en la línea base y después de cada titulación (Figuras 1A y 1B). El resultado de este experimento muestra que en ausencia de digitonina, la respiración celular es muy baja y la respiración de las células intactas, los no permeabilizadas no se estimula en presencia de sustrato mitocondrial y ADP. Sin embargo, después de la adición por etapas de digitonina, la membrana plasmática celular se permeabilizaron y mitochonla respiración drial (estado complejo II-dependiente 3) aumenta hasta alcanzar la plena permeabilización cuando succinato y ADP entrar en las células. Los resultados muestran que la permeabilización a una concentración de digitonina de 8 a 12 mM es óptima para la respiración estimulada por ADP de células HepG2. Sin embargo, la integridad de la membrana externa mitocondrial puede verse comprometida si se emplean cantidades excesivas de digitonina. Como se muestra en la Figura 1, las cantidades excesivas de digitonina indujo una reducción en el complejo II dependiente de estado 3 respiración indicando integridad de la membrana mitocondrial externa comprometida.

En los protocolos actuales y siguientes, todas las tasas de consumo de oxígeno se expresan como IO ₂ [pmol x seg ^-1 x 10 ^-6 células] (flujo de oxígeno por millón de células) que se calcula dividiendo el flujo de oxígeno-volumen específico (en el cerrado cámara de oxígeno), JV, _O2 [pmol x seg ^-1 x ml ^-1] por concentrat celular de iones en la cámara celular (número de células por volumen [10 ⁶ células x ml ^{-1]) 15.}

Figura 1: titulación digitonina para determinar la concentración óptima para la permeabilización de las células HepG2. La línea azul representa la concentración de oxígeno; la línea roja representa el flujo de oxígeno (pendiente de la concentración de oxígeno). La concentración de oxígeno disminuye con el tiempo como las células utilizan el oxígeno disponible. El consumo de oxígeno se expresa como pmol / (seg x número de células). (A) Los trazados de la alta resolución de respirometría utilizando digitonina, ADP y succinato como sustrato para la respiración II dependiente de complejo mitocondrial (1 experimento). (B) las tasas de respiración mitocondrial a partir de 4 experimentos individuales presentan como media ± desviación estándar.cargar / 54985 / 54985fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Evaluación de la membrana externa mitocondrial Integridad El uso de una concentración óptima digitonina

Para evaluar el efecto de la concentración de digitonina óptima (8 M) sobre la integridad de la membrana mitocondrial externa, las células se permeabilizaron con integridad de la membrana externa de digitonina y mitocondrial se prueba mediante la medición de la respiración mitocondrial después de la adición posterior de succinato (complejo mitocondrial II dependiente de estado 2 descansando la respiración en ausencia de ADP), ADP (ADP estimulada complejo II dependiente de estado 3 respiración) y citocromo c (ADP estimulada complejo II dependiente de estado 3 de respiración en presencia de citocromo c), seguido de la adición de oligomicina (un inhibidor de la ATP sintasa) para imitar el estado 4. Como se muestra en la Figura 2

Figura 2: citocromo c no mejora la respiración de las células tratadas con digitonina (8 M). rastros respiratorias representativos para la prueba de citocromo c utilizando respirometría de alta resolución. Las células se permeabilizaron con 8 digitonina mu M y la integridad de la membrana externa mitocondrial se prueba mediante la medición de la frecuencia respiratoria después de la adición posterior de succinato 10 mM (estado 2), ADP mM 2,5 (estado 3) y 10 mM de citocromo c (estado 3 en presencia citocromo c), seguido de la adición de 2 mg / ml oligomicina para imitar el estado 4. la frecuencia respiratoria se expresa como pmol / (seg x million células). CII: complejo II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Evaluación de la membrana mitocondrial externa Integridad El uso de una alta concentración de digitonina

Para demostrar que una concentración muy alta de digitonina puede comprometer la integridad de la membrana externa mitocondrial, se realizó un experimento usando una alta dosis de digitonina. Para este experimento, las células se permeabilizaron con digitonina 40 mM en lugar de 8 M, y la integridad de la membrana externa mitocondrial se prueba mediante la medición de la respiración mitocondrial después de la adición posterior de succinato (complejo mitocondrial II dependiente de estado de reposo 2 respiración en ausencia de ADP) , ADP (ADP estimulada estado complejo II dependiente de 3 respiración) y citocromo c (ADP estimulada complejo II-destado ependent 3 respiración en presencia de citocromo c), seguido de la adición de oligomicina para imitar estado 4 en presencia de oligomicina (Figura 3). El resultado de este experimento muestra que el citocromo c mejora la respiración de las células tratadas con una alta dosis de digitonina, lo que indica una pérdida de citocromo c de la membrana externa mitocondrial indicando integridad de la membrana mitocondrial externa comprometida.

Figura 3: alta dosis de digitonina (40 M) compromete la integridad de la membrana mitocondrial externa. Los trazados de la respirometría de alta resolución utilizando succinato como sustrato. La línea azul representa la concentración de oxígeno; la línea roja representa el flujo de oxígeno (pendiente de la concentración de oxígeno). La concentración de oxígeno disminuye con el tiempo como las células utilizan el oxígeno disponible. El consumo de oxígeno se expresa comopmol / (seg x número de células). La posterior adición de 40 mM de digitonina, succinato (10 mM), ADP (2,5 mM), citocromo c (10 M) y oligomicina (2 mg / ml) se indica. CII: complejo II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ADP máxima estimulada por la respiración (estado 3) de células permeabilizadas HepG2, usando un exceso sustratos exógenos

I- compleja, II-IV y dependiente de la respiración máxima estimulada por ADP (estado 3) de las células HepG2 permeabilizadas (1 x 10 ⁶ células / ml) se mide con éxito utilizando el exceso de sustratos exógenos (Figura 4). Para este experimento, las células se permeabilizaron con las tasas de consumo de oxígeno digitonina y mitocondriales se miden después de la adición posterior de sustratos e inhibidores como se describe en

Figura 4: medición satisfactoria de la respiración máxima estimulada por ADP (estado 3) de las células HepG2 permeabilizadas. La frecuencia respiratoria se expresa como pmol / (seg x millón de células). Las células se permeabilizaron con 8 digitonina mu M y respiratoria mitocondrial se miden después de la adición posterior de glutamato y malato (estado 3, el complejo I), rotenona para inhibir el complejo I, succinato (estado 3, II complejo), antimicina A para inhibir el complejo III y ascorbato / TMPD y azida de sodio para inhibir el complejo IV. Complejo IV respiración (Estado 3)se interpreta restando el consumo de oxígeno antes y después de la adición de azida de sodio. IC: el complejo I, CII: complejo II, CIV: Complejo IV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Medición de la respiración sin éxito estimulada por ADP máxima (estado 3) de células permeabilizadas HepG2

I- Complex, II- y IV dependiente de máxima respiración estimulada por ADP (estado 3) de las células HepG2 permeabilizadas (1 x 10 ⁶ células / ml) no se mide con éxito utilizando el exceso de sustratos exógenos (Figura 5). Para este experimento, las células se permeabilizaron con las tasas de consumo de oxígeno digitonina y mitocondriales se miden después de la adición posterior de sustratos e inhibidores como se describe en la Figura 5. Como se muestra en la Figura 5

Figura 4. Una posible explicación para los niveles reducidos respiratorias es la contaminación de las cámaras oxygraph con inhibidores mitocondriales de los experimentos anteriores. inhibidores mitocondriales tales como la antimicina y rotenona son solubles en etanol y se pueden adherir a las cámaras de oxygraph y tapones. Por lo tanto, las cámaras y los tapones oxygraph se deben lavar ampliamente después de cada experimento.

Figura 5: Medición de la respiración sin éxito de máxima estimulada por ADP (estado 3) de las células HepG2 permeabilizadas. rastros respiratorias representativas de un experimento fracasado del complejo I, II-IV y guiado por la respiración máxima estimulada por ADP (estado 3) de las células HepG2 permeabilizadas utilizando respirometría de alta resolución. La frecuencia respiratoria se expresa comopmol / (seg x millón de células). Las células se permeabilizaron con 8 digitonina mu M y respiratoria mitocondrial se miden después de la adición posterior de glutamato y malato (estado 3, el complejo I), rotenona para inhibir el complejo I, succinato (estado 3, II complejo), antimicina A para inhibir el complejo III y ascorbato / TMPD y azida de sodio para inhibir el complejo IV. Complejo IV respiración (Estado 3) se interpreta restando el consumo de oxígeno antes y después de la adición de azida de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La respiración acoplarse y desacoplarse de células intactas

El consumo de oxígeno basal de células HepG2 se mide en presencia de oligomicina (respiración oligomicina minúsculas) y la adición secuencial de FCCP (Figura 6). Basal tasa de respiración celular representa el consumo de oxígeno de las células HepG2 intactos en presencia de sustratos celulares endógenos y puede alterar en respuesta a la demanda de ATP celular. la tasa de respiración oligomicina insensibles representa fugas respiración celular y la tasa de respiración sensible a la oligomicina que representa el recambio de ATP celular y se calcula restando la tasa de respiración oligomicina insensible a partir de la tasa de respiración endógena basal. El producto químico desacoplador FCCP se añade secuencialmente a diferentes concentraciones y la respiración desacoplada máxima grabados. La tasa de respiración máxima mitocondrial desacoplado (máxima capacidad del sistema de transporte de electrones) para esta condición experimental se obtiene a 0,9-1,2 M FCCP. Los resultados muestran una actividad bifásica de FCCP en células HepG2 intactas. Por lo tanto, para cada condición experimental, FCCP se titula para obtener la tasa de respiración desacoplada máxima. La relación del control respiratorio desacoplado (uRCR) se calcula dividiendo el FCCPtasa de respiración desacoplada por la tasa de respiración en presencia de oligomicina. Oligomicina sensible a la respiración (recambio de ATP) se calcula restando oligomicina insensible a la tasa de respiración de la respiración endógena basal. El acoplamiento de la eficiencia, que representa la proporción de consumo de oxígeno mitocondrial utilizado para sintetizar ATP se calcula dividiendo la velocidad de respiración sensible a la oligomicina por la tasa de respiración basal. Al final del experimento, para obtener la tasa de respiración no mitocondrial, se añaden inhibidores de la cadena de transporte de electrones mitocondrial y la tasa de respiración mitocondrial no se restan de todos los resultados. Para el experimento mostrado en la Figura 6, la tasa de respiración no mitocondrial es 26 pmol / (seg x millones de células), la tasa de respiración basal es 48 pmol / (seg x millón de células), oligomicina insensible a la tasa de respiración 7 pmol / (sec x millones de células), sensible a la oligomicina respiración (el volumen de negocios ATP) 41 pmol / (x seg millones de células) y coupling eficiencia de 0,85.

Figura 6: Acoplado y desacoplado de la respiración de las células intactas. trazas respiratorias representativos de consumo de oxígeno basal células HepG2 'midieron en presencia de oligomicina (respiración oligomicina minúsculas) y la adición secuencial de FCCP usando respirometría de alta resolución. A partir de entonces, una vez que se alcanza una señal estable, la respiración se inhibe con la adición de rotenona y antimicina A y el fondo restante respiración (respiración no mitocondrial) se resta de todos los resultados. El consumo de oxígeno se expresa como pmol / (seg x número de células). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La respiración tampón 13
Químico	Concentración
sacarosa	110 mM
EGTA	0,5 mM
MgCl 2	3.0 mM
KCl	80 mM
K-lactobionato	60 mM
KH 2 PO 4	10 mM
La taurina	20 mM
Hepes	20 mM
BSA	1,0 g / L
pH	7.1

Tabla 1: La composición del tampón de la respiración.

Discusión

El objetivo del presente protocolo fue utilizar respirometría de alta resolución para medir los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima y la integridad de la membrana mitocondrial externa.

Hay algunos pasos críticos dentro del presente protocolo. En primer lugar, las tasas de consumo de oxígeno celular por lo general se normalizaron al número de células (pmol / [seg x número de células]). Por lo tanto, antes de monitorizar el consumo de oxígeno celular, es fundamental para utilizar un dispositivo que permite mediciones precisas y fiables de la cantidad de células. En el presente protocolo de un contador de células automatizado se ha utilizado (paso 3.7 del protocolo y la tabla de materiales). Un segundo paso crítico, especialmente en las células permeabilizadas, es la elección de tampón de respiración en la que se permeabilizan las células se vuelven a suspender (paso 3.6 del protocolo). Desde la permeabilización celular puede inducir la pérdida de intracellulaiones r, es muy importante que el medio utilizado durante la permeabilización es compatible con el medio ambiente intracelular. Por lo tanto, el tampón de respiración debe contener una composición y una osmolaridad que refleja tanto la intracelular y el medio ambiente extracelular (Tabla 1) ^13. Además, para la permeabilización celular óptima y eficaz, es crucial para titular digitonina concentración no sólo para cada tipo de células, sino también para cada densidad celular, para identificar su concentración óptima y la más baja eficaz. Si la concentración de digitonina es demasiado bajo, no se permeabilizaron las células. En contraste, la exposición de las células a grandes cantidades de digitonina puede dañar la membrana mitocondrial externa. Por lo tanto, otro punto importante es investigar integridad de la membrana mitocondrial externa. Con el fin de no subestimar la capacidad respiratoria celular, también es crucial que los experimentos de respirometría se realizan a una temperatura fisiológica (37 ° C). Otro punto importante a considerar es el uso de cantidades saturantes de ADP, debido a la limitación de la difusión de ADP versus oxígeno en las células permeabilizadas y los niveles de sustrato suficientes para obtener flujo respiratorio máximo. En algunos experimentos en células permeabilizadas, puede suceder que la adición de sustratos exógenos y ADP no dar lugar a un aumento considerable de la tasa de respiración. Esto puede ser causado por varios factores. Por ejemplo, el uso de altas concentraciones de digitonina para permeabilizar las células puede dañar la membrana externa mitocondrial. Por lo tanto, se debe valorar digitonina para determinar la concentración óptima para cada tipo de célula y la densidad. Además, la pureza de digitonina también es muy crítica, y están disponibles comercialmente digitonina puede variar de forma significativa en la pureza y nuevos lotes de digitonina comprado debe ser valorada para determinar sus concentraciones óptimas para la permeabilización celular. Además, hay varios tipos de membrana plasmática celular de poros que formanagentes con diferentes propiedades. Por ejemplo, la saponina es un detergente más suave que digitonina, y dependiendo del tipo de célula, un reactivo de permeabilización celular apropiada debe ser seleccionada.

La mayoría de los inhibidores de la función mitocondrial utilizado en ensayos de respirometría, tales como la rotenona antimicina A, son solubles sólo en etanol y se adhieren a las cámaras oxygraph y los tapones, la inhibición de la respiración celular. Para evitar este problema, las cámaras oxygraph y los tapones deben ser lavados extensamente con 95% de etanol después de cada ensayo. Otro punto importante a considerar es que para ambos ensayos de respiración celular intacta y permeabilizadas, la densidad celular, el tipo y la confluencia de cultivo celular pueden afectar la frecuencia respiratoria. Por ejemplo, con células HepG2, que suelen utilizar una densidad celular de 1 a 2 millones de células por cámara. El uso de la densidad celular muy baja durante respirometría puede dar lugar a una señal muy débil. También se observó que la confluencia de cultivo de células puede afectar las tasas respiratorias. Para example, cuando las células HepG2 se cultivan muy confluentes (más de 100%), que consumen mucho menos oxígeno.

Para obtener un flujo de oxígeno estable y reproducible durante los experimentos, otro punto importante a considerar es el mantenimiento de la alta resolución de respirometría instrumento- es decir, el intercambio regular de las membranas del sensor de oxígeno polarográfico y correcciones instrumental de fondo. Para los experimentos con el desacoplador FCCP, puede ser que la adición de FCCP a las células no estimula no se obtiene la respiración celular y el flujo máxima, pero en su lugar se inhibe la respiración celular. La inhibición del consumo de oxígeno celular después de la adición de FCCP puede indicar que la concentración de FCCP no era óptima y era demasiado alto. Para estos experimentos, para cada ensayo, es esencial para valorar cuidadosamente concentración FCCP para obtener flujo máxima.

Una limitación de alta resolución de respirometría es que cribado de alto rendimiento, el establecimiento decurvas de dosis-respuesta y experimentos de tiempo para una cantidad limitada de muestras biológicas no son factibles. Para estos ensayos, se pueden utilizar otros instrumentos, como el analizador de flujo extracelular. Otras limitaciones son: i) el dispositivo no está automatizado y requiere la presencia continua de un operador, ii) es mucho tiempo iii) sólo tiene dos cámaras y sólo dos ensayos se pueden ejecutar a la vez iv) el mantenimiento del instrumento,, , como el cambio de las membranas y calibraciones, requiere mucho tiempo y v) las cámaras no son de un solo uso y pueden contaminarse con inhibidores. Las ventajas de la alta resolución oxygraph sobre los dispositivos tradicionales de electrodos de oxígeno polarográficas son: i) una mayor sensibilidad, ii) un número menor de muestras biológicas requieren, iii) la frecuencia respiratoria se puede medir simultáneamente en dos cámaras y iv) el dispositivo ha reducido fuga de oxígeno. Algunas de las ventajas de la alta resolución oxygraph sobre el analizador de flujo extracelular son i) reducir los costos de ladispositivo y los consumibles y ii) la viabilidad de los protocolos de valoración sustrato-desacoplador-inhibidor.

Las aplicaciones futuras o direcciones después de dominar esta técnica son mediciones simultáneas de la respiración celular, potencial de membrana mitocondrial, H ₂ O _2, ATP y los niveles de calcio utilizando sensores ópticos en la misma cámara.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ADP	Sigma	A 4386	Químico
Antimicina A	Sigma	A 8674	Químico, disolver en etanol
Ascorbato	Merck	1.00127	Químico
BSA	Sigma	A 6003	Químico
FCCP	Sigma	C 2920	Químico, disolver en etanol
Contador de celdas automatizado Countess	Thermo Fisher Scientific	n/a	Contador de células automatizado
Citocromo c	Sigma	C 7752
Químico Digitonina	Sigma	D 5628	Químico, disuelto en DMSO
DMEM	Gibco 31966021		Medio
EGTA	fluka	3779	Químico
FBS	Gibco	26010-074	Componente medio
Glutamato	Sigma	G 1626	Químico
Hepes		Sigma H 7523	Químico
KCl	Merck	1.04936	Químico
KH2PO4	Merck	1.04873	Químico
K-lactobionato	Sigma	L 2398
Químico MgCl2	Sigma	M 9272	Chemical
O2K-Core: Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	Instrumento de respirometría de alta resolución
Oligomicina	Sigma	O 4876	Químico, disuelto en etanol
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122	Químico
Azida sódica	Sigma	S2002	Químico
Rotenona	Sigma	R 8875	Químico, disuelto en etanol
Succinato	Sigma	S 2378	Químico
Taurina		Sigma T 8691	Químico
TMPD	Sigma	T 3134	Químico
Tripsina	Sigma	T 4674	Químico