Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.
Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.
Röntgenkristallografi har varit, och kommer att fortsätta att vara en extremt kraftfull teknik för att förstå vilken typ av ligand-receptorinteraktioner. Genom att visualisera dessa interaktioner i atom detalj, är det inte bara möjligt att avslöja de molekylära mekanismer som styr många biologiska processer, men det är också möjligt att direkt ändra kontaktytor för terapeutisk fördel. Tillsammans med tekniker såsom ytplasmonresonans och isotermisk titrering kalorimetri (för att bara nämna ett par), kan sådana ändringar sedan analyseras biofysiskt att bedöma de direkta effekterna på bindningsaffinitet, interaktions kinetik och termodynamik. Slutligen, genom att utföra funktionella experiment på relevanta celltyper, en detaljerad bild av den molekylära och funktionella effekterna av ändringar receptor-ligandinteraktioner kan härledas, ger mycket specifik mekanistisk information. Sammantaget dessa typer av metoder ger en atomär upplösning bild som gör det möjligt avskräcka ställandet av hur biologiska system fungerar, med åtföljande konsekvenser för diagnostiska och terapeutiska framsteg.
Vårt laboratorium rutinmässigt använder dessa tekniker för att studera de receptorer som medierar human T-cell immunitet mot patogener och cancer, i autoimmunitet, och under transplantation. Här fokuserar vi på den mänskliga CD8 + T-cellssvar mot cancer, medierad av en interaktion mellan T-cellreceptorn (TCR) och HLA-antigen (HLA) -restricted tumör härledda peptider (pHLA). Detta är viktigt eftersom, även CD8 + T-celler kan rikta cancerceller, har vi och andra tidigare visat att anti-cancer TCR suboptimalt binda till deras besläktade pHLA 1, 2. Sålunda har många laboratorier försökt att förändra antingen TCR 3, 4, 5 eller peptidliganden 6,class = "xref"> 7, 8 för att öka immunogenicitet och bättre mål cancerceller. Men dessa metoder är inte alltid effektiva och kan ha allvarliga biverkningar, inklusive off-target toxicitet 4, 9, 10. Ytterligare forskning undersöker de molekylära mekanismer som styr T-celligenkänning av cancerantigener kommer att vara avgörande för att övervinna dessa brister.
I den aktuella studien har vi fokuserat på svaren mot autologa melanomceller av CD8 + T-celler specifika för ett fragment av differentiering melanocytantalet antigen glykoprotein 100 (gp100), gp100 280-288, presenteras av HLA-A * 0201 (den vanligaste -expressed humant pHLA klass I). Detta antigen har varit en allmänt studerade mål för melanom immunoterapi och har utvecklats som ett så kallat "heteroclitic" peptid i vilken en valin ersätter alaninankar position 9 för att förbättra pHLA stabilitet 11. Detta tillvägagångssätt användes för att öka induktionen av melanom-reaktiva CTL in vitro och har med framgång använts i kliniska prövningar 12. Däremot kan ändringar av peptidrester har oförutsägbara effekter på T-cellspecificitet, framgår av den dåliga effekten av de flesta heterolitic peptider på kliniken 6, 13. I själva verket, en annan heteroclitic form av gp100 280-288, i vilken peptidrest Glu3 ersattes Ala upphävde erkännande av en polyklonal population av gp100 280-288-specifika T-celler 14, 15. Vi har tidigare visat att även små förändringar i peptidförankringsrester väsentligt kan ändra T-celligenkänning på oförutsägbara sätt 6, 16. Således fokuserade studien på building en mer detaljerad bild av hur CD8 + T-celler känner igen gp100 och hur ändringar av samspelet mellan TCR och pHLA kan påverka den här funktionen.
Här, vi genererat mycket rena, lösliga former av två TCR specifika för gp100 280-288 presenteras av HLA-A * 0201 (A2-YLE), samt naturliga och förändrade former av pHLA. Dessa reagens användes för att generera proteinkristaller för att lösa den ternära atomära strukturen av en human TCR i komplex med heteroclitic form av A2-YLE, liksom två av de mutanta pHLAs i oligerat form. Vi använde sedan en peptid scanning metod för att påvisa effekten av peptid substitutioner på TCR genom att utföra en fördjupad biofysiska experiment. Slutligen, vi genererade en genetiskt modifierad CD8 + T-cellinje, omprogrammerad för att uttrycka en av de A2-YLE specifika TCR, för att utföra funktionella experiment för att testa den biologiska effekten av de olika peptidmodifieringar. Dessa data visar att även moditioner att peptidrester som ligger utanför den TCR-bindande motivet kan ha oförutsägbara följdeffekter på intilliggande peptidrester som upphäver TCR-bindning och T-celligenkänning. Våra resultat representerar det första exemplet på de strukturella mekanismer som ligger bakom T-celligenkänning av detta viktiga terapeutiska mål för melanom.
Protokollen som beskrivs här ger en ram för molekylära och cellulära dissektion av T-cellsvar i samband med någon mänsklig sjukdom. Även cancer var i fokus för denna studie har vi använt mycket likartade metoder för att undersöka T-cellsvar mot virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 och under autoimmunitet 38, 39, 40. Dessutom har vi använt dessa tekniker mer allmänt att förstå de molekylära principer som styr T-cellsantigenigenkänning 2, 19, 41, 42. Faktum är att det oförutsägbara ändringar peptidrester, även deutanför av TCR kontaktrester, har effekter T-celligenkänning viktiga implikationer för utformningen av heteroclitic peptider. Dessa upptäckter har direkt bidragit till utvecklingen av nya T-cellterapi, inklusive peptidvacciner 6, 43 och artificiella hög affinitet TCR 3, 4, 5, 20, 44, samt förbättrade diagnostik 45, 46, 47.
Kritiska steg i protokollet
Genereringen av en i hög grad ren, funktionellt protein är väsentlig för alla de metoder som beskrivs i detta dokument.
Ändringar och felsökning
Svårigheter att generera mycket rent protein ofta avser uttryck för starkt-Pure, olösligt IB från E. coli-expressionssystem. Vanligtvis modifiering av uttrycket protokoll (t.ex. inducera vid olika optiska tätheter, med olika E. coli-stammar, eller med hjälp av olika medier formationer) löser dessa frågor.
Begränsningar av tekniken
Dessa tekniker använder lösliga proteinmolekyler (TCR och pHLA) som normalt uttrycks på cellytan. Därför är det viktigt att se till att de strukturella / biofysiska resultat överensstämmer med cellulära metoder för att bekräfta biologisk betydelse.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Genom att använda röntgenkristallografi och biofysik underbyggda genom funktionell analys, har vi och andra har visat att TCR specifik för cancer epitoper i allmänhet kännetecknas av låga bindningsaffiniteter 48. Denna låga TCR affinitet kan hjälpa till att förklara varför T-celler are inte naturligt effektiv på att rensa cancer. Högupplösta atom strukturer av komplex mellan anti-cancer TCR och besläktade tumörantigener börjar att avslöja den molekylära grunden för denna svaga affinitet. Dessutom är dessa studier är användbara för att bestämma de mekanismer som ligger bakom de terapeutiska ingripanden som utformats för att lösa detta problem, sådd framtida förbättringar 16. I denna studie undersökte vi den första strukturen av en naturligt förekommande αβTCR i komplex med en gp100 HLA-A * 0201-begränsade melanom epitop. Strukturen i kombination med en fördjupad biofysikalisk undersökning visade den totala bindningsläget för interaktion. Vi avslöjade också en oväntad molekylbrytare, som inträffade i en muterad form av peptiden, som upphävde TCR bindning (bedömas med hjälp av ytplasmonresonans) och CD8 + T-celligenkänning (funktionella experiment). Det var endast möjligt att demonstrera den nya mekanismen för HLA-antigen presentatipå att använda de högupplösta beskrivna metoderna.
Framtida tillämpningar eller riktningar efter att behärska denna teknik
Sammantaget våra resultat visar kraften i röntgenkristallografi och biofysikaliska metoder i kombination med robusta funktionella analyser. Med användning av dessa metoder är det möjligt att dissekera ut exakta molekylära mekanismer som reglerar T-cellantigenigenkänning. I själva verket är det också möjligt att använda denna metod för att lösa strukturen av oligerat TCR, visar hur konformationsförändringar kan spela en roll under antigen diskriminering 49, 50, 51. En bättre förståelse av den mycket komplicerade och dynamiska karaktär som ligger till grund TCR-pHLA interaktioner har också uppenbara konsekvenser för terapi design. Att kunna direkt "se" de molekyler som håller på att terapeutiskt riktade, liksom effekten att modifikationer har på antigen recognition, helt klart kommer att förbättra utvecklingen av dessa läkemedel framöver. I denna studie visar vi att till och med förändringar i ett enda peptidrest som inte är kraftigt anlitas av en TCR oförutsägbart kan överföra strukturella ändringar av andra rester i HLA-bunden peptid, vilket i sin tur förändrar dramatiskt T-celligenkänning. En mer fullständig förståelse av de molekylära mekanismer som under T-cellsantigenigenkänning blir enormt fördelaktigt när man utformar framtida terapier för ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
BM stöds av en cancerforskning UK doktorand. AG stöds av ett Life Science Research Network Wales doktorand. VB stöds av en Cancer Research Wales doktorand. DKC är en Wellcome Trust Research karriärutvecklings Fellow (WT095767). AKS är en Wellcome Trust Investigator. GHM finansieras av en gemensam Life Science Research Network Wales och Tenovus Cancer Care doktorand. Vi tackar personalen på Diamond Light Source för tillhandahållande av anläggningar och stöd.
S.O.C. media | Invitrogen |
Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo |
carbenicillin | Sigma |
IPTG | Fisher |
Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon |
Legend RT centrifuge | Sorvall |
Tris | Fisher |
magnesium chloride | Arcos |
NaCl | Fisher |
glycerol | Sigma-Aldrich |
Sonopuls HD 2070 | Bandelin |
DNAse | Fisher |
Triton | Sigma-Aldrich |
EDTA | Fisher |
guanidine | Fisher |
NanoDrop ND1000 | Thermo |
Peptides | Peptide Protein Research |
dithiothreitol | Sigma-Aldrich |
L-arginine | SAFC |
cysteamine | Fisher |
cystamine | Fisher |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich |
urea | Sigma-Aldrich |
Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall |
POROS 10/100 HQ | Applied biosystems |
ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences |
10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius |
10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences |
Phosphate Buffer Saline | Oxoid |
BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences |
Biotinylation kit | Avidity |
BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences |
CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences |
streptavidin | Sigma-Aldrich |
Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences |
Hepes | Sigma-Aldrich |
Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments |
Intelli-plate | Art Robbins Instruments |
Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions |
75 cm2 flask | Greiner Bio-One |
0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore |
Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter |
Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter |
CD8 microbeads | Miltenyi Biotec |
anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen |
anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec |
CK medium, PHA | Alere Ltd |
anti-TCRVβ mAb | BD |
dasatinib | Axon |
MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems |
51Cr | PerkinElmer |
1450 Microbeta counter | PerkinElmer |