Utilisation de cristallographie aux rayons X, biophysique, et des tests fonctionnels pour déterminer les mécanismes d'administration des lymphocytes T Reconnaissance des récepteurs du cancer Antigènes

Résumé

Ici, nous décrivons les méthodes que nous employons couramment en laboratoire pour déterminer comment la nature de l’interaction entre le récepteur des lymphocytes T et les antigènes tumoraux, présentée par les antigènes leucocytaires humains, régit la fonctionnalité des lymphocytes T ; ces méthodes comprennent la production de protéines, la cristallographie aux rayons X, la biophysique et les expériences fonctionnelles sur les lymphocytes T.

Résumé

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) CD8+ humains sont connus pour jouer un rôle important dans le contrôle des tumeurs. Afin de remplir cette fonction, le récepteur des lymphocytes T (TCR) exprimé à la surface cellulaire doit reconnaître fonctionnellement les peptides dérivés tumoraux restreints à l’antigène leucocytaire humain (HLA). Cependant, nous et d’autres avons montré que la plupart des TCR se lient de manière sous-optimale aux antigènes tumoraux. La découverte des mécanismes moléculaires qui définissent cette faible reconnaissance pourrait aider au développement de nouvelles thérapies ciblées qui contourneront ces lacunes. En effet, les thérapies actuelles qui n’ont pas cette compréhension moléculaire n’ont pas été universellement efficaces. Ici, nous décrivons les méthodes que nous employons couramment en laboratoire pour déterminer comment la nature de l’interaction entre les TCR et le pHLA régit la fonctionnalité des lymphocytes T. Ces méthodes comprennent la génération de TCR solubles et de pHLA et l’utilisation de ces réactifs pour la cristallographie aux rayons X, l’analyse biophysique et la coloration des lymphocytes T spécifiques de l’antigène avec des multimères pHLA. En utilisant ces approches et guidé par l’analyse structurale, il est possible de modifier l’interaction entre les TCR et pHLA, puis de tester comment ces modifications affectent la reconnaissance de l’antigène des lymphocytes T. Ces résultats ont déjà permis de clarifier le mécanisme de reconnaissance d’un certain nombre d’antigènes cancéreux par les lymphocytes T et pourraient orienter le développement de peptides modifiés et de TCR modifiés pour de nouvelles thérapies anticancéreuses.

Introduction

cristallographie aux rayons X a été et continuera d'être, une technique extrêmement puissante pour comprendre la nature des interactions ligand-récepteur. En visualisant ces interactions en détail atomique, non seulement il est possible de divulguer les mécanismes moléculaires qui régissent de nombreux processus biologiques, mais il est également possible de modifier directement les interfaces de contact pour un bénéfice thérapeutique. Couplé avec des techniques telles que la résonance plasmonique de surface et titration isotherme calorimétrique (pour ne citer que quelques), de telles modifications peuvent ensuite être analysées biophysique pour évaluer l'impact direct sur l'affinité de liaison, la cinétique d'interaction, et de la thermodynamique. Enfin, en effectuant des expériences fonctionnelles sur les types de cellules pertinentes, une image détaillée de l'impact moléculaire et fonctionnelle des modifications aux interactions récepteur-ligand peut être glanée, fournissant des informations mécaniste très spécifique. Dans l'ensemble, ces types de méthodes fournissent une image de résolution atomique permettant à la dissuader mination de la façon dont les systèmes biologiques travailler, avec des conséquences qui en découlent pour les progrès diagnostiques et thérapeutiques.

Notre laboratoire utilise habituellement ces techniques pour étudier les récepteurs qui assurent la médiation de l'immunité des cellules T humaines à des agents pathogènes et le cancer, dans l'auto-immunité et au cours de la transplantation. Ici, nous nous intéressons à la réponse des lymphocytes T humains CD8 ⁺ à un cancer, médiée par une interaction entre le récepteur des cellules T (TCR) et d' antigène de leucocyte humain (HLA) , des peptides dérivés de tumeur -restricted (pHLA). Ceci est important parce que, bien que les cellules T CD8 ⁺ sont capables de cibler les cellules cancéreuses, et d' autres que nous avons précédemment montré que les TCR anti-cancéreux se lient à leur sous - optimale pHLA cognât ^{1, 2.} Ainsi, de nombreux laboratoires ont tenté de modifier soit le TCR ^{3, 4, 5} ou ⁶ du peptide ^ligand,class = "xref"> ^{7, 8} afin d'augmenter l' immunogénicité et de mieux les cellules cancéreuses cibles. Cependant, ces approches ne sont pas toujours efficaces et peuvent avoir des effets secondaires graves, y compris les toxicités hors-cible ^{4, 9, 10.} D'autres recherches explorant les mécanismes moléculaires qui régissent la reconnaissance des lymphocytes T des antigènes du cancer sera essentiel de surmonter ces lacunes.

Dans la présente étude, nous nous sommes concentrés sur les réponses contre les cellules de mélanome autologues par des cellules T CD8 ⁺ spécifiques pour un fragment de l'antigène de différenciation des mélanocytes glycoprotéine 100 (gp100), gp100 _280-288, présentés par HLA-A * 0201 (le plus couramment Nous avons exprimé pHLA humain de classe I). Cet antigène a été une cible largement étudiée pour le mélanome et immunothérapie a été développé comme un peptide soi-disant "hétéroclite" dans lequel une valine remplace alanineà la position d'ancrage 9 pour améliorer la stabilité pHLA ^11. Cette approche a été utilisée pour améliorer l'induction de CTL mélanome réactif in vitro et a été utilisé avec succès dans des essais cliniques ^12. Cependant, les modifications des résidus peptidiques peuvent avoir des effets imprévisibles sur la spécificité des lymphocytes T, démontré par la faible efficacité de la plupart des peptides heterolitic dans la clinique ^{6, 13.} En effet, une autre forme hétéroclite de gp100 _280-288, dans lequel le peptide résidu Glu3 a été remplacé par Ala, abrogée par la reconnaissance d' une population polyclonale de gp100 _280-288 cellules T spécifique de ^{14, 15.} Nous avons précédemment démontré que même des changements mineurs dans les résidus d'ancrage du peptide peuvent modifier substantiellement la reconnaissance des cellules T de manière imprévisible ^{6, 16.} Ainsi, l'étude a porté sur la constructionment une image plus détaillée de la façon dont les cellules CD8 ⁺ T reconnaissent gp100 et comment les modifications de l'interaction entre TCR et pHLA pourrait avoir un impact de cette fonction.

Ici, nous avons généré des formes solubles, très pures de deux TCR spécifiques de la gp100 _280-288 présenté par HLA-A * 0201 (A2-YLE), ainsi que les formes naturelles ou modifiées de pHLA. Ces réactifs ont été utilisés pour générer des cristaux de protéines pour résoudre la structure atomique ternaire d'un TCR humain dans un complexe avec la forme hétéroclite de A2-YLE, ainsi que deux des pHLAs mutants sous forme non ligaturé. Nous avons ensuite utilisé une approche de balayage de peptide pour démontrer l'impact des substitutions de peptides sur TCR en effectuant en profondeur des expériences biophysiques. Enfin, nous avons généré une ligne de cellules T CD8 + génétiquement modifié, re-programmés pour exprimer des TCR A2-YLE spécifique, afin de réaliser des expériences fonctionnelles pour tester l'impact biologique des diverses modifications peptidiques. Ces données démontrent que, même modifications peptidiques des résidus qui sont en dehors du motif de liaison TCR peuvent avoir imprévisibles effets induits sur les résidus de peptides adjacents qui abrogent liaison TCR et la reconnaissance des cellules T. Nos résultats représentent le premier exemple des mécanismes structurels sous-jacents de reconnaissance des cellules T de cette cible thérapeutique importante pour le mélanome.

Protocole

1. Protein Expression

1. Faire des constructions de gènes pour la production de TCR et pHLAs solubles, comme décrit en détail précédemment ^{17, 18.} Concevoir chaque construction par une BamH1 et une extrémité 3 '5 le site EcoR1 de restriction pour l'insertion dans le vecteur pGMT7.
2. Transformer E. coli Rosetta (DE3) pLysS avec un vecteur plasmidique pGMT7 dérivé contenant la séquence codant pour la protéine d'intérêt par incubation de 1 pi de 50 à 200 ng / ul plasmide avec 5 pi de E. coli pendant 5 min à 4 ° C , 2 min à 42 ° C et 5 min à 4 ° C, et de la plaque pendant une nuit à 37 ° C sur une plaque de gélose LB supplémenté avec 50 mg / l de carbénicilline.
3. Prélever des colonies individuelles et de croître à 37 ° C et à 220 tours par minute dans 30 ml de milieu TYP (16 g / L de tryptone, 16 g / L d' extrait de levure et 5 g / L HK ₂ O ₄₎ additionné de 100 uM de carbénicilline jusqu'à ce que la suspension atteint une optique density _(DO600) comprise entre 0,4 et 0,6.
4. Induire la production de protéines dans une aliquote de 5 ml, en introduisant 0,5 mM de β-D-thiogalactopyranoside d'isopropyle 1-(IPTG) pendant 3 h. Conserver 20 ul d'une suspension avec ou sans induction par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) d'analyse et de souiller le gel.
5. Ajouter des cultures starter à 1 L de TYP supplémenté avec 100 pM de carbénicilline et faire croître les cellules comme décrit ci - dessus à l' étape 1.3 jusqu'à ce que la suspension atteigne une _DO600 comprise entre 0,4 et 0,6.
6. Induire l'expression de la protéine pendant 3 h avec 0,5 mM d'IPTG. Centrifuger les cellules pendant 20 min à 3000 xg et verser le surnageant avec précaution.
7. On dissout le culot dans 40 ml de tampon de lyse (Tris 10 mM, pH 8,1, mM de chlorure 10 de magnésium, _MgCl2, 150 mM de NaCl et 10% de glycerol), traitement par ultrasons sur de la glace pour une puissance 30 min à 60% en utilisant l'intervalle de 2 et incuber à température ambiante (TA) pendant 30 min avec 0,1 g / l DNase.
8. Traiter le suspension contenant les protéines sous la forme de corps d'inclusion (IB) avec 100 ml de tampon de lavage (0,5% de Triton X-100; 50 mM de Tris, pH 8,1, NaCl 100 mM et EDTA 10 mM).
9. Centrifuger l'échantillon pendant 20 min à 4 ° C et 8000 xg et verser le surnageant avec précaution. Remettre en suspension le culot dans 100 ml de tampon de remise en suspension (Tris 50 mM, pH 8,1, 100 mM de NaCl et 10 mM d'EDTA, pH 8,1), centrifuger de nouveau à 8000 x g, et éliminer le surnageant avec précaution.
10. Enfin, on dissout le culot dans 10 ml de tampon guanidine (6 M de guanidine, 50 mM de Tris, pH 8,1; 2 mM d'EDTA, pH 8,1, et NaCl 100 mM) et de mesurer la concentration en protéines à 280 nm en utilisant un spectrophotomètre.

2. pHLA et TCR Repliement

1. Pour les replie Phla, mélanger 30 mg de HLA-A2 (ou HLA-A2 avec une étiquette de biotine) remisiers, 30 mg de ß2m remisiers et 4 mg de peptide pendant 30 min à 37 ° C dans un bain d'eau dans un volume final de 6 ml de tampon guanidine additionné de 10 mM de dithiothréitol(DTT).
2. Initier repliement des protéines en diluant le mélange précédent dans 1 litre d'un tampon HLA repliage pré-refroidie (Tris 50 mM, pH 8,1, 400 mM de L-arginine, 2 mM d'EDTA, pH 8,1; 6 mM de cystéamine et mM cystamine 4).
3. Laissez le HLA repliez agitation à 4 ° C pendant 3 h, puis le transférer dans un 12,4 kDa MWCO (poids moléculaire de coupure) tube de dialyse et dialysé deux fois pendant 24 h contre 20 L de Tris 10 mM, pH 8,1.
4. Les replie TCR, mélanger 30 mg de chaîne α de TCR IB et 30 mg de chaîne β de TCR IBs pendant 30 min à 37 ° C dans un bain d'eau dans 6 ml de tampon guanidine supplémenté avec 10 mM de DTT.
5. Initier repliement des protéines en diluant le mélange TCR dénaturé dans 1 litre d'un tampon RLT repliage prérefroidi (Tris 50 mM, pH 8,1, 2,5 M d'urée, 2 mM d'EDTA, pH 8,1; mM de cystéamine 6; mM cystamine 4) pour 3 h.
6. Transférer le repliement dans un tube de dialyse MWCO de 12,4 kDa et on dialyse deux fois pendant 24 heures contre 20 litres de Tris 10 mM, pH 8,1.
7. Filtrer à la fois le ou pHLA TCR refâgés en utilisant un filtre à membrane de 0,45 um pour les étapes de purification.

3. Purification par Fast Protein chromatographie liquide (FPLC)

1. Charger la préparation de repliage filtré (que ce soit ou pHLA TCR) sur un 7,9 ml, 50 um anion colonne de résine échangeuse de pré-équilibrée avec 20 ml de Tris 10 mM, pH 8,1 sur un système de chromatographie en phase souple et intuitive.
2. Éluer la protéine à 5 ml / min avec un gradient de sel (NaCl 0-500 mM dans du Tris 10 mM, pH 8,1, sur 8 volumes de colonne) et recueillir des fractions de 1 ml.
3. Analyser les fractions correspondant à la protéine d'intérêt par SDS-PAGE, en commun les fractions contenant la protéine d'intérêt ensemble, et les concentrer jusqu'à 500 ul avec 10 kDa MWCO 20 ou 10 kDa MWCO 4 par centrifugation pendant 20 min à 4000 g , en rejetant l'écoulement.
4. Charger les préparations de protéine concentrée dans une boucle de 2 ml par injection sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique 24 ml prééquilibrée avec l'applicationropriate tampon d'élution: tampon phosphate salin (PBS), du HBS (10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 et 0,005% d'agent tensioactif) ou un tampon de cristal (Tris 10 mM, pH 8,1, et 10 mM de NaCl ).
5. Éluer les protéines à un débit de 0,5 mL / min pendant 1 volume de colonne; recueillir des fractions de 1 ml contenant la protéine d'intérêt vérifiée par SDS-PAGE.
   NOTE: Ces méthodes ont été utilisées pour générer PMEL17 TCR et gp100 TCR solubles, ainsi que tous les pHLAs utilisés dans cette étude: HLA-A * 0201 avec YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), ou YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

4. résonance plasmonique de surface (SPR) Analyse

1. Effectuer une analyse d'équilibre de liaison ou de l' analyse thermodynamique utilisant un système d'analyse d'interaction moléculaire équipé d'une puce de capteur CM5 ^19.
2. Activer la puce CM5 par fsui- un mélange 1: 1 mM de N-hydroxysuccinimide 100 (NHS) et 400 mM de 1-éthyl-3- (3-diméthylpropyl) -carboiimide (EDC) pendant 10 min à un débit de 10 ul / min et à 25 ° C C.
3. Charge d'environ 5000 unités de réponse (RU) de streptavidine (110 pi de 200 pg / ml dans de l'acétate 10 mM, pH 4,5) par une liaison covalente à la surface de la puce dans les quatre cellules d'écoulement et d'utilisation de 100 ul de 1 M de chlorhydrate d'éthanolamine pour désactiver tous les groupes réactifs restants.
4. Couple environ 500-600 RU de pHLA, à ~ 1 uM dans un tampon commercial (fourni par le fabricant), la puce de capteur CM5 à un débit lent de 10 ul / min pour assurer une distribution uniforme sur la surface de la puce.
5. Saturer la surface de la puce avec 1 biotine mM dans un tampon commercial (fourni par le fabricant) pendant 60 s.
6. Injecter dix dilutions en série de TCR solubles sur les cellules de flux pertinents à un débit élevé de 30 ul / min à 25 ° C.
7. Calculer la constante d'équilibre de liaison(K _D (E)) à l' aide des valeurs d'ajustement de courbe non linéaire (y = (P1x) / (P2 + x)) ^20.
   NOTE: Les unités y = réponse, x = concentration de l' analyste, P1 = r _max, P2 = K _D.
8. Effectuer une analyse de la cinétique en supposant un 1: 1 liaison Langmuir et ajuster les données en utilisant un algorithme global d'ajustement dans le package de logiciels ^2.
9. Effectuer des expériences thermodynamique en répétant ce procédé aux températures suivantes: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C et 30 ° C , ^19.
10. Utilisez les valeurs K _D déterminées par SPR à des températures différentes pour calculer Ag ° en utilisant l'équation thermodynamique classique (AG ° = -RTlnK _D) ^19.
    NOTE: R = constante des gaz, T = température en K, ln = logarithme naturel.
11. Calculer les paramètres thermodynamiques selon l'équation de Gibbs-Helmholtz (AG ° = AH - TΔS °) ^19.
12. Tracer les énergies de liaison libres, Ag ° (AG ° = -RTlnK _D), contre la température (K) en utilisant une régression non linéaire pour adapter l'équation à trois paramètres (y = AH + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) ^19.
    NOTE: y = température en K, x = Ag °.

5. Calorimétrie titration isotherme (ITC)

1. Effectuer des expériences de l'ITC en utilisant une titration calorimétrique isotherme. Injecter 30 uM pHLA dans la cellule calorimétrique et la charge 210 uM soluble TCR dans la seringue. Utiliser les conditions suivantes: tampon HEPES 20 mM (pH 7,4) contenant du NaCl 150 mM.
2. Effectuer 20 injections TCR, chacune d'un volume de 2 pl. Calculer AH et K _D en utilisant un logiciel d' analyse.

6. Cristallisation, Collecte de données Diffraction, et modèle Raffinement

1. Effectuer des essais de cristallisation en utilisant un robot de cristallisation.
2. Cultivez cristaux par vapou la diffusion à 18 ° C par la technique de goutte assis dans une plaque de 96 puits avec un réservoir contenant 60 ul de tampon de cristallisation (liqueur mère) ^21.
3. On concentre le pHLA soluble à environ 10 mg / ml (0,2 mM) dans un tampon de cristaux par centrifugation à 3000 x g dans un concentrateur centrifuge de coupure de poids moléculaire de 10 kDa.
4. Pour les structures co-complexes, mélanger le TCR et pHLA à un rapport 1: 1 molaire pour obtenir une solution de protéine à environ 10 mg / ml (0,1 mM).
5. Ajouter 200 nL de pHLA seul, ou le complexe 1: 1 molaire mélange de TCR et pHLA, à 200 nL de chaque solution de réservoir à partir de l'écran de cristallisation à l'aide d'un robot de cristallisation et de marquer des cristaux au microscope après 24 h, 48 h, 72 h, puis une fois par semaine.
6. Récolte des monocristaux par les monter manuellement dans des cryo-boucles sous un microscope et cryo-les refroidir en immergeant et en les stockant dans de l'azote liquide (100 K).
   REMARQUE: cristaux de chargement prend un peu de pratice, et de décider lequel des cristaux sont assez bons pour la collecte de données vient avec l'expérience. En règle générale, la plus grande et plus régulière du cristal, le meilleur.
7. Recueillir des données dans un courant d'azote gazeux à 100 K.
   NOTE: Ces données ont été acquises à la source lumineuse Diamond (DLS) facilité de la science synchrotron nationale au Royaume-Uni.
8. Analyser les données en estimant les intensités de réflexion avec xia2 utilisant à la fois MOSFLM ²² et emballe XDS ^23, puis à l' échelle les données avec SCALA ou Aimless ²⁴ et le paquet CCP4 ^25.
9. Résolvez les structures avec remplacement moléculaire en utilisant PHASER ^26.
10. Réglez le modèle avec COOT ²⁷ et affiner le modèle avec REFMAC5 ^28.
11. Préparer des représentations graphiques avec PyMol ^29.
12. Calculer les contacts en utilisant le "contact"programme dans le package CCP4. Utilisez un 4 Å coupure pour van der Waals contacts et 3,4 Å coupure pour des liaisons hydrogène et des ponts de sel.
13. Calculer la complémentarité de surface à l'aide du programme "SC" dans le package CCP4.
14. Calculer l'angle de croisement du complexe TCR pHLA, tel que décrit ^30.
    NOTE: Pour cette étude, les données de réflexion et coordonnées finales du modèle ont été déposés auprès de la base de données PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 et A2 -YLE-5A PDB: 5EU5).

Résultats

En utilisant les méthodes décrites ci - dessus, nous avons généré TCR soluble (tableau 1) et les molécules Phla à mener en profondeur des analyses moléculaires de gp100 _280-288 reconnaissance par les cellules T CD8 ^+. Un système d'expression modifiée E. coli a été utilisé pour générer insoluble IBs pour chaque chaîne séparé à la fois du RLT (chaînes a et ß) et pHLAs (chaîne α et ß2m). Cette méthode a l'avantage d'être relativement pas cher et facile à mettre en place et génère des rendements importants de protéines (100-500 mg / L de la culture). En outre, les protéines insolubles sont très stables si elles sont conservées à -80 ° C. Nous avons ensuite utilisé une technique de repliement et de purification bien établie pour générer des protéines fonctionnelles, homogènes, solubles. Cette méthode est utile pour générer des protéines pour les expériences biophysiques, structurelles et cellulaires, ainsi que des réactifs qui peuvent être utilisés pour le diagnostic ou la thérapeutique.

(tableau 2) TCR. Cet essai montre que les résidus dans le peptide ont été les plus importants pour la liaison du TCR. Les analyses à haute résolution des affinités de liaison à l'aide de cette technique sont extrêmement utiles pour déterminer les mécanismes biologiques qui contrôlent les interactions protéine-protéine, ainsi que pour l'analyse de l'affinité de liaison des molécules thérapeutiques.

Nous avons ensuite cristallisés un soluble TCR spécifiques de mélanome (PMEL17 TCR) dans un complexe avec une pHLA modifiée dérivées de tumeurs (A2-YLE-9V) pour étudier le mode de liaison à résolution atomique (figures 1 et 2 et le tableau 3). Ces expériences permettent une visualisation directe de l'interface de liaison entre les deux molécules, providing des informations clés sur les principes sous-jacents qui régissent l'interaction. Nous avons également effectué une analyse thermodynamique de l'interaction utilisant à la fois SPR et le CCI, révélant les contributions énergétiques qui ont permis (figures 3) de liaison. Ces analyses ont été étayées par une description à haute résolution de l'empreinte de contact entre les deux protéines (figure 4 et tableau 4).

Nous avons ensuite résolu les structures des molécules d'Phla non ligaturées, présentant des formes mutées du peptide, révélant qu'un interrupteur moléculaire pourrait expliquer pourquoi certaines mutations abrogées liaison TCR (figures 5).

Dans l'ensemble, ces techniques fournies de nouvelles données démontrant le mécanisme expliquant comment les cellules T reconnaissent un antigène de mélanome dérivé qui est une cible importante pour la thérapeutique anti-cancéreux. Plus largement, ces techniquespeut être utilisé pour étudier pratiquement toute interaction récepteur-ligand, la découverte de nouveaux mécanismes biologiques qui pourraient être ciblées pour de nouveaux progrès thérapeutiques.

Figure 1: Densité Analyse de la parcelle. Les spectacles de la colonne de gauche omettent des cartes dont le modèle a été affiné en l'absence du peptide. densité de différence est profilée à 3,0 sigma, contours positifs sont indiquées en vert, et les contours négatifs sont rouges. La colonne de droite montre la carte observée à 1,0 sigma (présentée comme un maillage gris autour des représentations de bâton des chaînes de protéines) après affinement ultérieure à l'aide des restrictions de symétrie non-cristallographiques automatiques appliquées par REFMAC5. (A) Le modèle PMEL17 TCR-A2-YLE-9V avec le TCR CDR3 boucles de couleur bleue (chaîne α) et orange (chaîne β) et le peptide en vert. (B) Le modèle A2-YLE avecle peptide de couleur vert foncé. (C) Le modèle A2-YLE-3A avec le peptide de couleur orange (pour A2-YLE-3A, il y avait 2 molécules dans l'unité asymétrique, mais ceux - ci étaient pratiquement identiques en termes de cartes omettre et de densité, de sorte que la copie 1 est montré ici). (D) Le modèle A2-YLE-5A avec le peptide de couleur rose. Reproduit avec la permission de la référence ^31. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Vue d'ensemble du PMEL17 TCR dans le complexe avec A2-YLE-9V. Représentation (A) de bande dessinée du complexe PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. Le TCR est de couleur noire; boucles TCR CDR sont représentées (rouge, CDR1α; vert foncé, CDR2α, bleu, CDR3α; jaune, CDR1β; aqua, CDR2 ^6 ;; orange, CDR3β); et HLA-A * 0201 est représentée en gris. Le peptide YLE-9V est représenté par des bâtons verts. (B) de surface et coller des représentations de résidus de la PMEL17 TCR boucles CDR (code couleur comme en A) qui sont en contact de la surface A2-YLE (A2, gris, YLE-9V, bâtonnets verts). La ligne diagonale noire indique l'angle de croisement du TCR par rapport à l'axe longitudinal du peptide YLEPGPVTV (46.15 °). (C) Contacter empreinte du PMEL17 TCR à la surface A2-YLE-9V (A2, gris); violet et vert (surface et bâtons) indiquent le HLA-A * 0201 et les résidus YLE, respectivement, contactés par le TCR de gp100. Cut-off de 3,4 Å pour des liaisons hydrogène et 4 Å pour van der Waals contacts. Reproduit avec la permission de Référence 31. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Thermodynamique Analyse de l'interaction TCR-A2-YLE PMEL17. (A) PMEL17 TCR équilibre liant les réponses à A2-YLE à 5, 12, 18, 25, et 37 ° C à travers neuf à dix TCR des dilutions en série. SPR données brutes et ajustées ( en supposant que 1: 1 liaison Langmuir) sont présentés dans l'encart de chaque courbe et ont été utilisées pour calculer K _sur K et _hors valeurs à l' aide d' un algorithme global d'ajustement (BIAevaluation 3.1). Le tableau montre l' équilibre de liaison (K _D (E)) et les constantes cinétiques de liaison (K _D (K) = K _off / K _sur) à chaque température. La liaison constante d' équilibre (K _D, uM) ont été calculées en utilisant un ajustement non linéaire (y = (P1x) / (P2 + x)). (B) Les paramètres thermodynamiques ont été calculées selon l'équation de Gibbs-Helmholtz (AG ° = ° AH - TΔS °). Les énergies libres de liaison, Ag ° (Ag ° = -RTlnK _D), ont été fonction de la température (K) en utilisant une régression non linéaire pour adapter l'équation à trois paramètres (y = AH ° + ΔCp ° * (x-298) -x * ΔS ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). Enthalpie (AH °) et de l'entropie (TΔS °) à 298 K (25 ° C) sont indiqués en kcal / mol et ont été calculées par une régression non-linéaire de la température (K) complotèrent contre l'énergie libre (AG °). (C) titration isotherme calorimétrique (ITC) des mesures pour l'interaction TCR-A2-YLE PMEL17. Enthalpie (AH °) et de l'entropie (TΔS °) à 298 K (25 ° C) sont indiqués en kcal / mol. Reproduit avec la permission de la référence ^31. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ong> Figure 4: Le PMEL17 CDR Loops Focus on Peptide Résidus Pro4, Val7 et Thr8. (A) Représentation schématique des contacts entre le peptide YLE-9V et les résidus de boucle PMEL17 CDR (code couleur comme sur la figure 2A). Les numéros au bas du panneau indiquent les contacts totaux entre le TCR et le peptide. (B) Les contacts entre la PMEL17 TCR et le peptide YLE-9V (bâtonnets verts) montrant le van der contacts Waals (noir lignes pointillées) et des liaisons hydrogène (lignes pointillées rouges) faites par le TCR CDR3α (bleu), CDR1β (jaune) , CDR2β (Aqua), et CDR3β (orange) boucles. Dans le panneau inférieur est une vue rapprochée des contacts entre YLE Pro4, Val7 et Thr8, respectivement, et les résidus de boucle TCR CDR (bâtons de couleur codé comme dans la figure 1A). Cut-off de 3,4 Å pour des liaisons hydrogène et 4 Å pour van der Waals contacts. Reproduit avec la permission de la référence ^31.rge.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Comparaison conformationnelle de YLE, YLE-3A, et A2-YLE-5A Peptides Présenté par HLA-A * 0201. (A) YLE (Bâtons vert foncé) et YLE-3A (bâtons d' orange) d'alignement de peptide par la superposition de HLA-A * 0201 α1 hélice (dessin animé gris). résidus encadrés indiquent la mutation de Glu3 dans une alanine. Les empiècements montrent comment la substitution Glu3Ala provoque un changement de position (flèche noire) du résidu voisin Pro4 dans la structure A2-YLE-3A par rapport à la structure A2-YLE. (B) YLE (bâtons vert foncé) et YLE-5A (bâtons roses) d'alignement de peptide par la superposition de HLA-A * 0201 α1 hélice (dessin animé gris). Les résidus encadrés indiquent la mutation de la glycine 5 dans une alanine. Reproduit avec la permission de la référence ^{S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.}

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR1β	CDR1β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
gp100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

Tableau 1: Alignement des TCR CDR3 Régions de PMEL17, gp100, MPD, et 296 TCR spécifiques gp100. Reproduit avec la permission de la référence ^31.

Séquence peptidique	Peptide	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D	gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affinité K D
YLEPGPVTA	YLE	7,6 ± 2 pm	26,5 ± 2,3 pM
YLEPGPVT V	YLE-9V	6,3 ± 1,2 pM	21.9 ± 2,4 pM
A LEPGPVTA	YLE-1A	15,9 ± 4,1 uM	60,6 ± 5,4 pM
YL A PGPVTA	YLE-3A	Aucune liaison	Aucune liaison
YLE A GPVTA	YLE-4A	19,7 ± 1,3 pM	144,1 ± 7,8 uM
YLEP A PVTA	YLE-5A	> 1 mM	> 1mM
YLEPG A VTA	YLE-6A	11,4 ± 2,7 pM	954,9 ± 97,8 uM
YLEPGP A TA	YLE-7A	31,1 ± 4 pM	102,0 ± 9,2 uM
YLEPGPV A A	YLE-8A	38,1 ± 7,4 pM	121,0 ± 7,5 pM

Tableau 2: Analyse d' affinité (K _D) de PMEL17 TCR et gp100 gp100 _280-288 TCR variants peptidiques. Reproduit avec la permission de la référence ^31.

Paramètres	PMEL17 TCR-A2-YLE-9V	A2-YLE	A2-YLE-3A	A2-YLE-5A
Code PDB </ Strong>	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
statistiques dataset
groupe spatial	P1	P1 21 1	P1	P1 21 1
paramètres de cellule unitaire (A)	a = 45,52, b = 54,41, c = 112.12, a = 85,0 °, b = 81,6 °, g = 72,6 °	a = 52,81, b = 80,37, c = 56,06, b = 112,8 °	a = 56,08, b = 57,63, c = 79,93, a = 90,0 °, b = 89,8 °, g = 63,8 °	a = 56,33, b = 79,64, c = 57,74, b = 116,2 °
Source de rayonnement	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
Longueur d'onde (nm)	0,9763	0,9999	0,9763	0,9763
Measurésolution rouge plage (Å)	51,87 à 2,02	45,25 à 1,97	43,39 à 2,12	43,42 à 1,54
Résolution Shell Outer (Å)	2,07 à 2,02	2,02 à 1,97	2,18 à 2,12	1,58 à 154
réflexion observée	128191 (8955)	99442 (7056)	99386 (7463)	244577 (17745)
réflexions uniques	64983 (4785)	30103 (2249)	49667 (3636)	67308 (4962)
Exhaustivité (%)	97,7 (96,7)	98,5 (99,3)	97,4 (96,7)	99,6 (99,9)
Multiplicité	2,0 (1,9)	3,3 (3,1)	2.0 (2.1)	3,6 (3,6)
I / Sigma (I)	5,5 (1,9)	7,2 (1,9)	6,7 (2.3)	13 (2.3)
Rpim (%)	5,7 (39,8)	8,8 (44,7)	8,7 (41,6)	4,5 (35,4)
R fusion (%)	7,8 (39,6)	9,8 (50,2)	8,7 (41,6)	5,0 (53,2)
Statistiques Raffinement
Résolution (Å)	2.02	1,97	2.12	1,54
Pas de réflexions utilisées	61688	28557	47153	63875
Pas de réflexion dans rfree ensemble	3294	1526	2514	3406
R crist (pas de coupure) (%)	18.1	19,7	17.2	17,0
R libre	22.2	25,5	21.1	20.1
Écart quadratique moyen de la géométrie idéale
longueurs de Bond (A)	0,018 (0,019) *	0,019 (0,019) *	0,021 (0,019) *	0,018 (0,019) *
angles de Bond (°)	1.964 (1.939) *	1.961 (1.926) *	2.067 (1.927) *	1.914 (1.936) *
Dans l'ensemble de coordonnées erreur (Å)	0,122	0,153	0,147	.055
Statistiques Ramachandran
plus favorisée	791 (96%)	371 (98%)	749 (99%)	384 (98%)
Permis	32 (4%)	6 (2%)	10 (1%)	5 (1%)
Outliers	2 (0%)	3 (1%)	dix%)	2 (0%)

Tableau 3: Réduction des données et Raffinement Statistiques (remplacement moléculaire). Reproduit avec la permission de la référence ^31. Les valeurs entre parenthèses sont pour la coquille de la plus haute résolution.

^OH

HLA / résidu peptidique	résidu TCR	No. vdW (≤4Å)	No. liaisons H (≤3.4Å)
Gly62	αGly98	3
	αSer99	1
Arg65	αSer99	2
Arg65 O	αAsn100 Nδ2	2	1
Arg65 RN1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	2
	βAla56	2
Gln72 Nε2	βGln51 O	3	1
	βGly54	7
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
val76	βGln51	3
	βGly52	2
Lys146	βPhe97	3
	βIle98	3
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	3
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
Gln155 N	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	βThr101 N	dix	1
αGly97 O	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
Pro4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
Pro4 O	αTyr101 N	14	1
Gly5	αTyr101	3
	βGly100	2
Val7	βIle98	7
	βGly99	2
	βGly100	2
Thr8	βThr31	5
	βGln51	1
	βPhe97	1
Thr8 N	βIle98 O	6	1

Tyr1

Tableau 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V Contactez Table. Reproduit avec la permission de la référence ^31.

Discussion

Les protocoles décrits ici fournissent un cadre pour la dissection moléculaire et cellulaire des réponses des lymphocytes T dans le contexte d'une maladie humaine. Bien que le cancer était l'objectif principal de cette étude, nous avons utilisé des approches très similaires pour étudier les réponses des lymphocytes T aux virus ^{32, 33, 34, 35, 36, 37} et pendant l' auto - immunité ^{38, 39, 40.} En outre, nous avons utilisé ces techniques plus largement de comprendre les principes moléculaires qui régissent les cellules T reconnaissance de l' antigène ^{2, 19, 41, 42.} En effet, la nature imprévisible des modifications au peptide résidus, même ceuxà l'extérieur du des résidus de contact de TCR, la reconnaissance des effets des cellules T a des implications importantes pour la conception de peptides hétéroclites. Ces résultats ont contribué directement au développement de thérapies nouvelles cellules T, y compris les vaccins peptidiques ^{6, 43} et artificiels TCR à affinité élevée ^{3, 4, 5, 20, 44,} ainsi que des diagnostics améliorés ^{45, 46, 47.}

Les étapes critiques au sein du protocole
La génération d'une protéine très pure, fonctionnelle est essentielle pour toutes les méthodes décrites dans le présent document.

Modifications et dépannage
Les difficultés à générer des protéines de haute pureté sont souvent liés à l'expression de très-Pure insoluble IB à partir du système d'expression E. coli. En général, la modification du protocole d'expression (par exemple, en induisant à des densités optiques différentes, en utilisant différentes souches de E. coli, ou à l' aide de différentes formations de médias) résout ces problèmes.

Limites de la technique
Ces techniques utilisent des molécules de protéines solubles (TCR) et Phla qui sont normalement exprimés à la surface cellulaire. Par conséquent, il est important de veiller à ce que les résultats structurels / biophysiques sont conformes aux approches cellulaires afin de confirmer la signification biologique.

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
Grâce à l'utilisation de la cristallographie aux rayons X et de biophysique corroborés par l' analyse fonctionnelle, nous et d' autres ont démontré que des TCR spécifiques d'épitopes de cancer sont généralement caractérisés par de faibles affinités de liaison ^48. Cette faible affinité TCR peut aider à expliquer pourquoi les cellules T are pas naturellement efficace pour dégager le cancer. structures atomiques à haute résolution de complexes entre TCR anti-cancer et des antigènes tumoraux apparentés commencent à révéler la base moléculaire de cette faible affinité. En outre, ces études sont utiles pour déterminer les mécanismes qui sous - tendent les interventions thérapeutiques visant à remédier à ce problème, l' ensemencement des améliorations futures ^16. Dans cette étude, nous avons examiné la première structure d'un αβTCR naturelle dans un complexe avec un gp100 HLA-A * épitope de mélanome 0201 restreint. La structure, combinée à un examen biophysique en profondeur, a révélé le mode de liaison globale de l'interaction. Nous avons également découvert un commutateur moléculaire inattendu, qui a eu lieu sous une forme mutée du peptide, qui a abrogé la liaison TCR (évaluée en utilisant la résonance plasmonique de surface) et CD8 ⁺ reconnaissance des lymphocytes T (expériences fonctionnelles). Il n'a été possible de démontrer ce nouveau mécanisme de HLA PRESENTATI d'antigènesur l'utilisation des méthodes à haute résolution décrites.

Les applications futures ou directions après la maîtrise de cette technique
Dans l'ensemble, nos résultats démontrent la puissance de cristallographie aux rayons X et des méthodes biophysiques lorsqu'il est combiné avec des analyses fonctionnelles robustes. En utilisant ces approches, il est possible de disséquer les mécanismes moléculaires précis qui régissent la reconnaissance des antigènes des lymphocytes T. En effet, il est également possible d'utiliser cette approche pour résoudre la structure du TCR non ligaturé, ce qui démontre comment les changements conformationnels peuvent jouer un rôle lors de la discrimination à l'antigène ^{49, 50, 51.} Une meilleure compréhension de la nature très complexe et dynamique qui sous-tend les interactions TCR-Phla a également des implications évidentes pour la conception de la thérapie. Être capable de directement «voir» les molécules qui sont thérapeutiquement ciblées, ainsi que l'effet que des modifications ont sur l'antigène recognition, permettra d'améliorer nettement le développement de ces médicaments à l'avenir. Dans cette étude, nous montrons que même des changements dans un résidu de peptide unique qui ne sont pas fortement engagés par un TCR peuvent imprévisiblement transmettre des changements structurels à d'autres résidus dans le peptide HLA-lié, ce qui, à son tour, modifie considérablement la reconnaissance des cellules T. Une compréhension plus complète des mécanismes moléculaires utilisés lors de la reconnaissance de l'antigène des cellules T sera extrêmement bénéfique lors de la conception de futures thérapies pour un large éventail de maladies humaines.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
S.O.C. MEDIA	Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubateur	Sanyo
carbenicilline  ;	Sigma
IPTG  ;
Quick Coomassie sans tacheTache  ;	Centrifugeuse Generon
Legend RT  ;	Sorvall
Tris  ;			Chlorure
magnésium Fisher  ;	Arcos
NaCl  ;			Glycérol de Fisher
;	Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070  ;	Bandelin
DNAse  ;
Triton	Sigma-Aldrich
EDTA  ;			Guanidine de pêcheur
;
Fisher NanoDrop ND1000²	Thermo
Peptides Peptide	Protein Research
dithiothreitol  ;	Sigma-Aldrich
L-arginine  ;	SAFC
cystéamine  ;			Cystamine de Fisher
nbsp ;
Tubulure de dialyse	Urée Sigma-Aldrich
;	Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 &mu ; m filtre à membrane	Pall
POROS 10/100 HQ  ;	Biosystèmes appliqués
Ä ; Système FPLC pur KTA  ;	GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20  ;	Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4  ;	Sartorius
Superdex 200 10/300 GL colonne  ;	GE Healthcare Life Sciences
Tampon salin pour phosphates  ;	Tampon Oxoid
BIAcore HBS  ;	GE Healthcare Life Sciences
Kit de biotinylation	Avidity
BIAcore T200	GE Healthcare Life Sciences
Kit de couplage de puces CM5	Healthcare Life Sciences
streptavidin  ;	Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC  ;	GE Healthcare Sciences de
Hepes  ;	Sigma-Aldrich
Gryphon	Art Robbins Instruments
Intelli-plate  ;	Art Robbins Instruments
Écrans et réactifs de cristallisation	Dimensions
75 cm2 flacon  ;	Greiner Bio-One
0.22 &mu ; filtres m	Miller-GP,
Ultra-Clear  ;	Beckman Coulter
Optima L-100 XP avec rotor SW28	Beckman Coulter
CD8  ;	Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads  ;	Invitrogen
	Miltenyi Biotec
CK medium, PHA	Alere Ltd
anti-TCRV&beta ; mAb  ;
dasatinib  ;	Axon
MIP-1&beta ; et TNF&alpha ; ELISA  ;	R& D Systems
; 51Cr  ;	PerkinElmer
1450 Compteur microbêta	PerkinElmer