Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

Summary

Se describen procedimientos optimizados para el aislamiento de folículos individuales, microinyecciones de ARN citoplasmático, la eliminación de capas celulares circundantes y la expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Además, se presenta un método simple para cambios rápidos de solución en experimentos electrofisiológicos con canales iónicos activados por ligandos.

Abstract

El ovocito Xenopus como un sistema de expresión heteróloga para las proteínas, fue descrito por primera vez por Gurdon et al. ¹ y ha sido ampliamente utilizado desde su descubrimiento (Referencias 2 - 3, y sus referencias). Una característica que hace que el ovocito atractivo para la expresión del canal exterior es el pobre abundancia de canales iónicos endógenos ^4. Este sistema de expresión ha demostrado ser útil para la caracterización de muchas proteínas, entre ellas los canales iónicos activados por ligando.

La expresión de los receptores GABA _A en oocitos de Xenopus y su caracterización funcional se describe aquí, incluyendo el aislamiento de ovocitos, microinyecciones con cRNA, la eliminación de capas de células foliculares, y cambios rápidos en solución experimentos electrofisiológicos. Los procedimientos fueron optimizados en este laboratorio ^5,6 y se desvían de las que se usan rutinariamente ^7-9. Tradicionalmente, desprovistas de ovocitos se preparancon un tratamiento prolongado de la colagenasa de los lóbulos de ovario a TA, y estas desprovistas de ovocitos se microinyectan con mRNA. Utilizando los métodos optimizados, diversas proteínas de membrana se han expresado y estudiado con este sistema, tales como los receptores recombinantes GABA _A, ^10-12 humanos recombinantes canales de cloruro, canales de potasio ¹³ tripanosoma ^14, y un transportador de myo -inositol ^{15, 16.}

Los métodos detallados aquí pueden ser aplicados a la expresión de cualquier proteína de elección en oocitos de Xenopus, y el cambio de solución rápida se pueden utilizar para estudiar otros canales iónicos activados por ligando.

Introduction

Oocitos de Xenopus se usan ampliamente como un sistema de expresión (Referencias 2 - 3, y las referencias en él). Ellos son capaces de montar y de incorporar proteínas de múltiples subunidades funcionalmente activas en sus membranas plasmáticas correctamente. El uso de este sistema, es posible investigar funcionalmente proteínas de membrana solos o en combinación con otras proteínas, con el fin de estudiar las propiedades de, o proteínas quiméricas concatenados mutados, y a la pantalla de fármacos potenciales.

Ventajas del uso de oocitos sobre otros sistemas de expresión heterólogos incluyen el manejo sencillo de las células gigantes, la alta proporción de células que expresan la información genética extranjera, el simple control del entorno de los ovocitos mediante perfusión del baño, y el control del potencial de membrana .

El inconveniente de este sistema de expresión es la variación estacional observada en muchos laboratorios ^17-20. La razón de esta variaciónestá lejos de ser clara. Además, la calidad de los ovocitos se observa a menudo para variar fuertemente. Los métodos tradicionales ^7-9 han incluido el aislamiento de lóbulos de ovario, la exposición de los lóbulos de ovario a la colagenasa para algunos h, la selección de desprovistas de ovocitos, y la microinyección de ovocitos. A continuación, se presentan una serie de procedimientos alternativos y rápidos que han permitido trabajar con este sistema de expresión durante más de 30 años sin variación estacional y la poca variación en la calidad de los ovocitos.

Los métodos modificados y mejorados descritos aquí para el aislamiento de ovocitos, microinyección con cRNA, y la eliminación de las capas de células foliculares se pueden utilizar para la expresión de cualquier proteína de elección en el oocito de Xenopus. El método muy simple para cambios rápidos de solución del medio alrededor del ovocito puede aplicarse al estudio de cualquier canal iónicos activados por ligando y de portadores.

Protocol

Los experimentos con animales han sido aprobados por el comité local del cantón de Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berna (BE85 / 15).

1. Preparación de Xenopus Los ovocitos

1. Mantener ranas (Xenopus laevis) en un 12 h / 12 h luz / oscuridad ciclo en el agua que está estrictamente mantuvo a 20 ° C.
2. Retire los lóbulos de los ovarios de las ranas hembra ^9.
   NOTA: La eliminación de los lóbulos es un estímulo para la regeneración, y con frecuencia la calidad de los ovocitos mejora con la cirugía. El ovocito está cubierta por una capa vitelina, una capa de células del folículo, y el tejido conectivo que contiene los vasos sanguíneos ^21. Toda la estructura se denomina "folículo."
3. Coloque los lóbulos de los ovarios que están muy cargado de los folículos que contienen los ovocitos en estériles de Barth Saline ⁷ (MBS) suplementado con penicilina y estreptomicina (NaCl 88 mM, KCl 1, 2,4 mM_{De NaHCO3,} 0,82 mM MgSO _4, 0,41 mM CaCl ₂ mM, Ca 0,33 (NO _{3) 2,} 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 mg / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina).
4. Single-a cabo la etapa V-VI ²¹ folículos. Mantenga el lóbulo ovario con fórceps. Bajar el asa de platino (Figura 1) a través de los folículos y retirar suavemente el bucle de perturbar el tejido conectivo que contiene el folículo del tejido de ovario.
   NOTA: Etapa V-VI ²¹ folículos se caracterizan por su tamaño (1,0 a 1,2 mm de diámetro) y por el buen contraste entre el hemisferio animales pigmentada oscura y el hemisferio vegetal amarillento.
5. Transferencia sólo folículos de aspecto saludable (es decir perfectamente esféricas y con pigmentación intacto) a un diámetro del plato Petri 35 mm por medio de una pipeta de plástico Pasteur (cortar la parte posterior a un diámetro de abertura de 1,5 mm).

2. La microinyección de ARNm en el citoplasma

Nota: El sistema de microinyección se describe aquí se deriva de la reportada por Kressmann y Birnstiel ^22.

1. Preparar ARNc de los respectivos ADNc que codifican las subunidades de la α ₄ β ₂ δ receptor GABA _A por transcripción in vitro, la adición de un poli (A ⁺⁾ de la cola, y la cuantificación del ARN por electroforesis en gel de ^23.
2. Preparar pipetas de microinyección de los capilares de borosilicato de vidrio (1,0 mm de diámetro exterior (OD), 0,58 mm de diámetro interior (ID), 100 mm de longitud), utilizando un extractor de micropipeta. Romper las puntas de los capilares de vidrio con un microscopio utilizando un micromanipulador y microfilamentos para crear un diámetro de punta de 12 - 15 micras con una punta biselada.
3. Rellene las pipetas de microinyección con aceite de parafina utilizando una jeringa de 10 ml, y luego montar la pipeta de microinyección en un micr de construcción caseraoinjection aparato (Figura 2).
   NOTA: El aparato de inyección de aceite hidráulico de construcción casera consiste en un motor parrilla controlado por un interruptor de pedal. Un interruptor adicional cambia el modo de giro del motor. Este motor acciona un tornillo micrométrico (0,5 mm / vuelta) que avanza o se retrae el émbolo de una jeringa de vidrio de 10 mL. La inyección es a una velocidad de alrededor de 3 rpm y un giro de 0,5 corresponde a una inyección de 50 nL en un folículo. La punta de la jeringa está conectado a un tubo de paredes gruesas de politetrafluoroetileno que está a su vez conectado a la aguja de inyección por una pieza muy corto de tubo Tygon. El capilar de inyección se lleva a cabo por un portabrocas que está controlada por un micromanipulador. Todo el sistema se llena con aceite de parafina. Cualquier burbuja de aire debe evitarse, ya que poner en peligro el sistema de inyección. La configuración se ilumina con una fuente de luz fría. Se requiere un microscopio estereoscópico para el control óptico. Los folículos se visualizaron bajo luz fría con un stereomicroscope (40 aumentos). El rendimiento de la configuración de la inyección se prueba por la inyección de un trazador radioactivo en oocitos de Xenopus. Un volumen de 45 - 55 nL debe ser entregado por inyección.
4. Con una pipeta con una punta de plástico estéril, probar la configuración mediante la colocación de una gota de agua estéril en el interior limpio de un termoplástico resistente a la humedad (2 x 2 cm). Sumergir la punta de la pipeta de inyección en esta gotita, y luego girar el motor para retraer el émbolo (presión negativa dentro de la pipeta de inyección).
   NOTA: El agua debe entrar en la pipeta y formar una interfaz visible con el aceite.
5. Retraer la punta de la pipeta de la gotita y aplicar presión positiva en el interior de la pipeta de inyección. Una gota de agua debe formar en la punta de la pipeta de inyección.
6. Prepararse para la inyección de los folículos por alineándolos con los polos vegetales apuntando hacia arriba en los intersticios de una malla de nylon (G: 0,8 mm) pegados a la parte inferior de un Peplato de tri (60 mm) cubierta con MBS.
7. Prescindir de 2 l de ARNm utilizando una pipeta con una punta de plástico estéril en el interior limpio de un termoplástico. Tome el mRNA arriba en la pipeta de inyección mediante la aplicación de presión negativa en el interior de la pipeta de inyección.
8. Coloque la pipeta de inyección más de un folículo individual utilizando el micromanipulador.
9. Insertar la aguja de inyección en el centro de la polo vegetal e inyectar 50 nL de mRNA a un caudal de 0,6 l / min mediante la aplicación de presión positiva en el interior de la pipeta. Esperar 5 - 10 s antes de retirar la punta de la pipeta de inyección del folículo para evitar ARNm de escape.
   NOTA: El ARNm se debe inyectar en el polo vegetal (amarillenta) para evitar la inyección en el núcleo, que se encuentra en el hemisferio animal.
10. La transferencia de los folículos inyectados a una nueva placa de Petri (35 mm) llena con 2 ml de MBS. Coloque el plato en un enfriador de vino establecido a 18 ° C. Incubar los folículos inyectados por 1 -7 d antes de la grabación, dependiendo de la identidad de la nueva proteína expresada.

3. Decapado de los folículos (Figura 3)

NOTA: Como se mencionó anteriormente, el ovocito cubierta por una capa vitelina, las células del folículo, y el tejido conectivo, que contiene los vasos sanguíneos ^24, que se conoce como un "folículo." Todas las capas excepto para la capa vitelina, que proporciona estabilidad mecánica sin impedir el acceso de las soluciones a la superficie celular, se deben quitar antes de los experimentos electrofisiológicos. El folículo sin las capas de células que rodean previamente se ha denominado un ovocito "denudada" ^25. Este paso se realiza generalmente en el mismo día de los experimentos electrofisiológicos.

1. Transferencia diez inyecta folículos a un tubo de vidrio de borosilicato que contiene 0,5 ml de MBS, 1 mg / ml de colagenasa y 0,1 mg / ml de inhibidor de tripsina. Sumergir el tubo en un baño de agua a 36 ° C. incubar lafolículos durante 20 minutos y agitar los tubos de vez en cuando.
2. Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s.
3. La transferencia de los folículos a un tercer tubo que contiene 0,5 ml de MBS doblemente concentradas que contienen 4 mM etilenglicol-bis (2-aminoetiléter) - N, N, N ', N'-ácido tetraacético (EGTA), y se incuba durante 4 min a RT. Agitar el tubo de vez en cuando.
   NOTA: La solución hipertónica (MBS doblemente concentrados) se utiliza para inducir la contracción de los ovocitos dentro de las capas de células del folículo, separando de esta forma las capas de células foliculares de la ovocito; se añade EGTA para inhibir la actividad de la colagenasa.
4. Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s.
5. La transferencia de los ovocitos a una placa de Petri (35 mm de diámetro) que contiene 2 ml de MBS. Bajo un microscopio estereoscópico, separar los sobres exteriores de los folículos porsimplemente empujando el oocito desnudo de distancia utilizando el asa de platino.
   NOTA: Los sobres exteriores de los ovocitos se adhieren firmemente a la placa de cultivo y se pueden separar fácilmente de los ovocitos. Algunos ovocitos perderán de forma espontánea sus sobres externos y serán recuperados como desprovistas de ovocitos. Este procedimiento resulta en una preparación relativamente estable que mantiene la apariencia esférica de los ovocitos.

4. Cambio rápido de soluciones en todo el ovocito

1. Realizar un experimento de fijación de voltaje, como se describe a ^9,26.
2. Cambie la solución del sistema de perfusión por gravedad girando los conmutadores de perfusión como se requiere por el experimento.
   1. Aplicar la solución de perfusión en 6 ml / min a través de un capilar de vidrio con un diámetro interior de 1,35 mm, la boca del que se coloca alrededor de 0,4 mm de la superficie del ovocito, para permitir cambios rápidos en la concentración de agonista alrededor del oocito.
      NOTA: La tasa de cambio ha sido previamente estimadod como 70% en menos de 0,5 s ^27.

Results

Oocitos de Xenopus fueron escogidos mecánicamente a cabo utilizando un asa de platino (Figura 1). Los oocitos se microinyectaron con mRNA que codifica para el receptor de GABA _A subunidades alfa _4, ß _2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / ovocito (Figura 2). Después de 4 días, las capas de células foliculares se eliminaron (Figura 3). Los oocitos se sujetan voltaje a -80 mV y se expusieron a concentraciones ...

Discussion

Los métodos descritos en este artículo se desvían de los utilizados tradicionalmente ^7-9. Es estándar para exponer los lóbulos del ovario a un tratamiento de colagenasa 1-2 h ^8; aislar, desprovistas de ovocitos en buen estado; e inyectarlos con ARNm utilizando dispositivos de inyección comerciales. Este procedimiento clásico tiene los siguientes inconvenientes: 1) Los ovocitos son susceptibles de ser dañados por la exposición prolongada a altas concentraciones de colagenasa. 2) Los ovocitos denudad...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Penicilina/estreptomicina	Gibco	15140-148	100 μ g de penicilina/mL y 100 μ g estreptomicina/mL
Bucle de alambre de platino	extractor de
micropipetas casero	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Jeringa Hamilton	Hamilton	80300	10 μ L, Tipo 701N
Tubo de politetrafluoroetileno de pared gruesa	Labmarket GmBH		1.0 mm OD
Aceite de parafina	Sigma	18512
Red de nylon, G: 0,8 mm	ZBF Zü más rico Beuteltuchfabrik AG
Tubo de vidrio de borosilicato	Corning	99445-12	PYREX
Colagenasa NB Grado estándar	SERVA	17454
Inhibidor de tripsina tipo I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Capilar de vidrio	Jencons (Scientific ) LTD.	H15/10	1,35 ID mm (para perfusión), empresa alternativa: Harvard Apparatus Limited
Capilar de vidrio de borosilicato	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1,0 OD x  0,58 ID x 100 Longitud mm (para microinyección)
Capilar de vidrio de borosilicato	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1.2 OD x 0.69 ID x 100 Longitud mm (para pinza de voltaje de dos electrodos)
γ-Ácido aminobutírico (GABA)	Sigma	A2129
3α,21-Dihidroxi-5&alfa;-pregnan-20-one (THDOC)	Sigma	P2016
	Faulhaber		Micromotor de corriente continua Tipo 2230 con engranaje Tipo 22/2
tornillo micrómetro	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Pipetas de transferencia de plástico estériles	Saint-Amand  Mfg.	222-20S