Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

Summary

Se describen procedimientos optimizados para el aislamiento de folículos individuales, microinyecciones de ARN citoplasmático, la eliminación de capas celulares circundantes y la expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Además, se presenta un método simple para cambios rápidos de solución en experimentos electrofisiológicos con canales iónicos activados por ligandos.

Abstract

El ovocito Xenopus como un sistema de expresión heteróloga para las proteínas, fue descrito por primera vez por Gurdon et al. ¹ y ha sido ampliamente utilizado desde su descubrimiento (Referencias 2 - 3, y sus referencias). Una característica que hace que el ovocito atractivo para la expresión del canal exterior es el pobre abundancia de canales iónicos endógenos ^4. Este sistema de expresión ha demostrado ser útil para la caracterización de muchas proteínas, entre ellas los canales iónicos activados por ligando.

La expresión de los receptores GABA _A en oocitos de Xenopus y su caracterización funcional se describe aquí, incluyendo el aislamiento de ovocitos, microinyecciones con cRNA, la eliminación de capas de células foliculares, y cambios rápidos en solución experimentos electrofisiológicos. Los procedimientos fueron optimizados en este laboratorio ^5,6 y se desvían de las que se usan rutinariamente ^7-9. Tradicionalmente, desprovistas de ovocitos se preparancon un tratamiento prolongado de la colagenasa de los lóbulos de ovario a TA, y estas desprovistas de ovocitos se microinyectan con mRNA. Utilizando los métodos optimizados, diversas proteínas de membrana se han expresado y estudiado con este sistema, tales como los receptores recombinantes GABA _A, ^10-12 humanos recombinantes canales de cloruro, canales de potasio ¹³ tripanosoma ^14, y un transportador de myo -inositol ^{15, 16.}

Los métodos detallados aquí pueden ser aplicados a la expresión de cualquier proteína de elección en oocitos de Xenopus, y el cambio de solución rápida se pueden utilizar para estudiar otros canales iónicos activados por ligando.

Introduction

Oocitos de Xenopus se usan ampliamente como un sistema de expresión (Referencias 2 - 3, y las referencias en él). Ellos son capaces de montar y de incorporar proteínas de múltiples subunidades funcionalmente activas en sus membranas plasmáticas correctamente. El uso de este sistema, es posible investigar funcionalmente proteínas de membrana solos o en combinación con otras proteínas, con el fin de estudiar las propiedades de, o proteínas quiméricas concatenados mutados, y a la pantalla de fármacos potenciales.

Ventajas del uso de oocitos sobre otros sistemas de expresión heterólogos incluyen el manejo sencillo de las células giga....

Protocol

Los experimentos con animales han sido aprobados por el comité local del cantón de Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berna (BE85 / 15).

1. Preparación de Xenopus Los ovocitos

1. Mantener ranas (Xenopus laevis) en un 12 h / 12 h luz / oscuridad ciclo en el agua que está estrictamente mantuvo a 20 ° C.
2. Retire los lóbulos de los ovarios de las ranas hembra ^9.
   NOTA: La eliminación de los lóbulos es un estímulo para la regeneración, y con frecuencia la calidad de los ovocitos mejora con la cirugía. El ovocito está cubierta por una capa vitelina, una capa de células del folíc....

Results

Oocitos de Xenopus fueron escogidos mecánicamente a cabo utilizando un asa de platino (Figura 1). Los oocitos se microinyectaron con mRNA que codifica para el receptor de GABA _A subunidades alfa _4, ß _2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / ovocito (Figura 2). Después de 4 días, las capas de células foliculares se eliminaron (Figura 3). Los oocitos se sujetan voltaje a -80 mV y se expusieron a concentraciones .......

Discussion

Los métodos descritos en este artículo se desvían de los utilizados tradicionalmente ^7-9. Es estándar para exponer los lóbulos del ovario a un tratamiento de colagenasa 1-2 h ^8; aislar, desprovistas de ovocitos en buen estado; e inyectarlos con ARNm utilizando dispositivos de inyección comerciales. Este procedimiento clásico tiene los siguientes inconvenientes: 1) Los ovocitos son susceptibles de ser dañados por la exposición prolongada a altas concentraciones de colagenasa. 2) Los ovocitos denudad.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Penicilina/estreptomicina	Gibco	15140-148	100 μ g de penicilina/mL y 100 μ g estreptomicina/mL
Bucle de alambre de platino	extractor de
micropipetas casero	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Jeringa Hamilton	Hamilton	80300	10 μ L, Tipo 701N
Tubo de politetrafluoroetileno de pared gruesa	Labmarket GmBH		1.0 mm OD
Aceite de parafina	Sigma	18512
Red de nylon, G: 0,8 mm	ZBF Zü más rico Beuteltuchfabrik AG
Tubo de vidrio de borosilicato	Corning	99445-12	PYREX
Colagenasa NB Grado estándar	SERVA	17454
Inhibidor de tripsina tipo I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Capilar de vidrio	Jencons (Scientific ) LTD.	H15/10	1,35 ID mm (para perfusión), empresa alternativa: Harvard Apparatus Limited
Capilar de vidrio de borosilicato	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1,0 OD x  0,58 ID x 100 Longitud mm (para microinyección)
Capilar de vidrio de borosilicato	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1.2 OD x 0.69 ID x 100 Longitud mm (para pinza de voltaje de dos electrodos)
γ-Ácido aminobutírico (GABA)	Sigma	A2129
3α,21-Dihidroxi-5&alfa;-pregnan-20-one (THDOC)	Sigma	P2016
	Faulhaber		Micromotor de corriente continua Tipo 2230 con engranaje Tipo 22/2
tornillo micrómetro	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Pipetas de transferencia de plástico estériles	Saint-Amand  Mfg.	222-20S