El objetivo de este estudio fue elaborar tecnologías que permiten la transducción génica exitosa en natural killer (NK) las células primarias. La transducción lentivirales dextrano-mediada de humanos o resultados primarios de las células NK del ratón en una mayor eficiencia de expresión génica. Este método de transducción génica mejorará enormemente la manipulación genética de la célula NK.
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Artículo de método
Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas
En este artículo
Resumen
Resumen
El transduction eficiente de genes específicos en células de naturales del asesinos (NK) ha sido un gran reto. Transducciones éxito son fundamentales para definir el papel del gen de interés en el desarrollo, diferenciación y función de las células NK. Los avances recientes relacionados con receptores de antígeno quimérico (coches) en inmunoterapia del cáncer acentúan la necesidad de un método eficiente entregar genes exógenos a los linfocitos effector. Las eficiencias de transducciones de lentivirales mediada por el gen en humanos primarios o células de NK de ratón siguen siendo considerablemente bajas, que es un factor limitante. Avances recientes usando polímeros catiónicos, como el polibreno, muestran una eficacia de transducción genética mejorada en células de T. Sin embargo, estos productos no pudo mejorar la eficiencia de la transducción de las células NK. Este trabajo muestra dextrano, un polisacárido ramificado glucan, mejora significativamente la eficiencia de la transducción de humano y ratón primaria NK. Esta metodología altamente reproducible de la transducción de señales proporciona una herramienta competente para transducing humano primario las células NK, que pueden mejorar enormemente gene clínica entrega aplicaciones y así inmunoterapia de cáncer basadas en células NK.
Introducción
Natural killer (NK) células son la población linfocítica importante del sistema inmune innato1. Las células NK funcionan como los defensores de primera línea de la respuesta inmune del huésped contra tumores e infecciones2,3,4. Las células NK también juegan un papel central en el desarrollo de la tolerancia a través de la secreción de potentes citoquinas y quimiocinas5. Debido a su potente capacidad de apuntar y eliminar las células tumorales, se están realizando varios ensayos clínicos para evaluar células NK humanas derivados ....
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Protocolo
Todos los protocolos de animales siguieron el tratamiento humano y ético de los animales y fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en el centro de investigación biomédica (BRC) de la Universidad médica de Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. El uso de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) fue aprobado por la Junta de revisión institucional (IRB) del Instituto de investigación de sangre de la sangre centro de Wisconsin, Milwaukee, WI.
1. ratones, líneas celulares y vectores
- Obtener ratones C57BL/6 de proveedores comerciales. Mantener las colonias de ratón en condiciones libres de....
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Resultados
Dextrano induce a la transferencia génica eficiente de vectores lentivirales en primaria murinas y humanas de las células NK
Células NK humanas fueron aisladas y purificadas de PBMC (con una pureza de más del 85%) y se incubó toda la noche con U/mL de rIL-2 300. Estas células NK primarias fueron entonces transduced con lentivirus GFP en variados multiplicidades de infección (MOI; 3, 10 y 20 UI por la célula) en placas de 24 pocillo.......
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Discusión
Este estudio demuestra que el uso de dextrano como un polímero catiónico agente aumenta la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primarias murinas y humanas. Además, otros agentes catiónicos, como el Pb o PS, no tienen ningún efecto discernible sobre la entrega de vectores virales en las células NK primarias humanas. Previamente, se ha demostrado que Pb puede aumentar la transducción de genes en el humano de células T17. Sin embargo, estos resultados, sugieren que ni Pb ni PS t.......
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Divulgaciones
Los autores afirman no hay conflicto de intereses financiero.
Agradecimientos
Agradecemos a Lucía Sammarco y su Lulu Lemonade Stand de inspiración, motivación y apoyo. Este trabajo fue apoyado en parte por los NIH R01 AI102893 y NCI R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); el Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); el programa HRHM del fondo MACC (S.M.; S.R.; [M.S.T); la Fundación de la familia de Nicholas (S.M.); la familia Gardetto (S.M.); Programa de los eruditos de Hyundai (M.S.T.); Hyundai esperanza sobre ruedas (S.R.); el fondo MACC (M.S.T. y S.M.); Instituto de investigación de los niños, MCW (S.R.); y el Premio de Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dextrano | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polibreno (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| sulfato de protamina (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Tripsina | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Suero fetal bovino | ATALANTA | S11150 | |
| Penicilina | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoetanol | SIGMA | M3148 | |
| piruvato de sodio | Corning | MT25000CI | |
| Interferón gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Solución de tinción de propidio | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurano | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| Kit de selección de negativos de células NK | Célula madre | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Ratones | Jakson | 664 | |
| 293T Células | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 Frascos Cornnig | 430641U | ||
| Kits de selección negativa basados en anticuerpos | Stem Cell | 19055 | |
| 51Ensayos de liberación de cromo (Cr) | Perkin Elmer's | NEZ030 | |
| Kits ELISA | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Butirato de sodio | Sigma | 5887-5G | |
| Polietileno lineal | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
Referencias
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (....
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Reimpresiones y permisos
