metástasis cerebral se ha convertido en una necesidad médica insatisfecha urgente, ya que su incidencia ha aumentado mientras que las opciones terapéuticas se han mantenido paliativos. La creación de modelos animales experimentales de metástasis en el cerebro a través de la inyección arterial intracarotídea de las células cancerosas facilita estudios sobre el mecanismo de la biología de la enfermedad y la evaluación de nuevos regímenes de intervención.
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Artículo de método
Intracarotídea inyección de las células del cáncer para Producción de ratón Modelos de metástasis cerebral
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Resumen
Resumen
La metástasis, la propagación y el crecimiento de las células malignas en los sitios secundarios dentro del cuerpo de un paciente, da cuenta de> 90% de la mortalidad relacionada con el cáncer. Recientemente, impresionantes avances en las terapias innovadoras han prolongado drásticamente la supervivencia y mejorar la calidad de vida de muchos pacientes con cáncer. Por desgracia, la incidencia de recidivas cerebrales metastásicos está aumentando rápidamente, y todas las terapias actuales no son más que paliativos. Por lo tanto, se necesitan urgentemente buenos modelos animales experimentales para facilitar los estudios a fondo de la biología de la enfermedad y para evaluar nuevos regímenes terapéuticos para la evaluación preclínica. Sin embargo, el estándar en el ensayo de metástasis in vivo a través de inyección en la vena caudal de las células cancerosas produce predominantemente lesiones metastásicas de pulmón; animales suelen sucumbir a la carga tumoral de pulmón antes de cualquier consecuencia significativa de la metástasis cerebral. inyección intracardiaca de las células tumorales produce lesiones metastásicas a múltiples sitios de órganos, incluido el cerebro; sin embargo, el variabilidad del crecimiento del tumor producido con este modelo es grande, humedeciendo su utilidad en la evaluación de la eficacia terapéutica. Para generar modelos animales fiables y coherentes para el estudio de la metástasis cerebral, aquí se describe un procedimiento para la producción de metástasis cerebral experimental en el ratón doméstico (Mus musculus) a través de la inyección intracarotídea de las células tumorales. Este enfoque permite producir gran número de ratones portadores de metástasis cerebrales con características de crecimiento y mortalidad similares, facilitando de este modo los esfuerzos de investigación para estudiar los mecanismos biológicos básicos y para evaluar nuevos agentes terapéuticos.
Introducción
La metástasis del cáncer en el sistema nervioso central (SNC) es una enfermedad devastadora, y puede implicar el parénquima cerebral o las leptomeninges ( "metástasis cerebral" se refiere tanto en este artículo). Es la neoplasia intracraneal predominante, superando en número a los gliomas primarios por> 10: 1 1, 2. El cáncer de pulmón, cáncer de mama y el melanoma son las tres principales enfermedades neoplásicas principales que producen una alta incidencia de metástasis cerebral 3, 4. En los últimos años, impresionantes avances en nuevas terapias contra el cáncer han prolongado drásticamente la supervivencia y mejorar la calidad de vida de muchos pacientes con cáncer. Sin embargo, tras la recurrencia, la incidencia de metástasis cerebral está aumentando rápidamente. Por ejemplo, el trastuzumab anticuerpo anti-HER2 (Herceptin) ha demostrado eficacia clínica significativa en pacientes con cáncer de mama HER2 +; sin embargo, una tendencia preocupante ha surgidoen estos pacientes: hasta 1/3 de aquellos cuya enfermedad sistémica extracraneal inicialmente beneficiado del tratamiento con trastuzumab más adelante desarrollar metástasis cerebral 5, 6, 7. Por desgracia, los pacientes con metástasis cerebrales son refractarios a casi todos los tratamientos actuales, por lo general experimentan un deterioro traumática de la calidad de vida y su supervivencia a un año después del diagnóstico es sólo aproximadamente el 20% 8. Las terapias actuales para la metástasis cerebral (incluyendo esteroides, la radioterapia craneal, y la resección quirúrgica en pacientes seleccionados) no son más que paliativos, no curativa 9. Por lo tanto, la metástasis cerebral se perfila como el próximo reto imponente en esta era de nuevas terapias contra el cáncer. Para hacer frente al reto pendiente pacientes se enfrentan todos los días en la clínica, es urgente comprender mejor el mecanismo subyacente de la metástasis cerebral y utilizar este conocimiento para desarrollar nuevas terapias.
colonización exitosa del cerebro por las células cancerosas metastásicas requiere el rendimiento de una serie de funciones mediadas por la intrincada interacción de múltiples jugadores biológicos, tales como la derivación de la barrera hematoencefálica (BBB) y escapar del cerebro de intrínseco mecanismos de defensa inmune 10, ninguno de los cuales se resume en una ex vivo o in vitro sistema. Por lo tanto, adecuada y fiel en modelos in vivo son cruciales para el estudio de la metástasis cerebral. A convencional ensayo de metástasis in vivo en las células del cáncer introduce a través de inyección en vena de cola, lo que lleva la mayoría de las células a quedar atrapados en el pulmón. Lesiones metastásicas del cerebro rara vez se producen en estos modelos animales antes de la muerte causada por la carga tumoral en los pulmones 11. inyección intracerebral directa de las células cancerosas produce excrecencia de tumores consistente en el SNC y se utiliza ampliamente en los estudios de gliomas primarios. Sin embargo, sinyección UCH compromete la acreditación y causa una lesión traumática en el sitio de la inyección, los dos puntos principales de preocupación en cuanto a la relevancia fisiológica de este modelo. Otra ruta introducción de células de cáncer de uso frecuente, la inyección intracardíaca, es fácil de administrar y no producir metástasis experimental para el SNC. Sin embargo, las metástasis concurrentes a sitios de órganos distintos del SNC siempre se producen y pueden causar mortalidad de los animales 11; Por lo tanto, el alto grado de variabilidad de este modelo hace que sea apropiado para la evaluación cuantitativa de los mecanismos biológicos o agentes terapéuticos con un número limitado de animales.Aquí se describen los procedimientos para producir metástasis cerebral experimental a través de la inyección de las células cancerosas en la arteria carótida común. Hemos utilizado este enfoque para diseccionar las contribuciones individuales de los genes a la cascada metastásica de metástasis cerebral y para evaluar la eficacia de la intervención terapéuticas 12, 13. Las principales ventajas de este enfoque son el alto grado de reproducibilidad y bajo grado de variabilidad; La principal desventaja es la sofisticación y la destreza necesaria para realizar la microcirugía.
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Protocolo
declaración de la ética: Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Preparar las células del cáncer de Inyección
- Sembrar las células de cáncer de uno o dos días antes de la inyección. Utilice DMEM / F12 suplementado con 10% de FBS, a menos que un medio de especialidad se indica en la literatura para una línea celular particular.
- En el día de la operación quirúrgica, las células de la cosecha cuando alcanzan 70-80% de confluencia por primera lavado con medio libre de suero una vez antes de la tripsinización (0,25%) para 1 - 2 min a 37 ° C. Añadir a las células 10% de FBS que contiene medio DMEM / F12 para apagar la tripsina 0,25%.
- Centrifugar las células a 80 × g durante 3 min. Lavar las células en medio libre de suero dos veces para eliminar el suero residual, contar las células con un hemocitómetro y volver a suspender en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 1 - 5 x 10 6 células / ml, dependiendo de la línea celular. Mantener en hielohasta el momento de la inyección.
Se han usado MDA-MB-231 células de cáncer de mama y células de melanoma K1735 en este estudio, y se utilizaron dos líneas celulares a 2 x 10 6 células / ml de concentración: NOTA. Mantenga la duración tripsinización lo más corto posible como tratamiento excesivo puede influir en los resultados de ensayos de metástasis.
2. Preparar ratones por inyección de células tumorales
- Anestesiar los ratones por vía intraperitoneal (ip) de inyección de ketamina / xilazina cóctel (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
- Confirmar la anestesia completa pellizcando los pies de los animales y observar la falta de respuesta.
- Coloque el ratón sobre una placa de vidrio (utilizado para la fundición de geles de proteínas), y asegurar con bandas de goma.
- Si es necesario, quitar el pelo de cuello por el afeitado o la aplicación de una pequeña cantidad de producto de depilación y secándose el cabello con una toalla de papel. NOTA: Si está utilizando ratones desnudos, omitir este paso, ya que no tienen vello corporal.
- Limpiar la piel del cuello mediante la aplicación depovidona yodada y 70% de alcohol.
- Coloque el ratón en el escenario del microscopio de disección
- Hacer una incisión en la piel ~ 1 cm de largo con un bisturí quirúrgico.
- Sin rodeos diseccionar el músculo con unas pinzas dentadas para exponer la arteria carótida debajo.
- Se separa la arteria carótida del nervio vago junto con unas pinzas quirúrgicas.
- El uso de pinzas quirúrgicas, separar un poco de algodón de una bola de algodón, humedecer, y la moda en una bola de algodón más pequeño. Coloque esta bola de algodón tampón-humectada por debajo de la arteria carótida del lugar previsto de la inyección.
- Colocar una sutura distal y proximal a la bola de algodón y hacer nudos sueltos. Apretar el nudo proximal para bloquear el flujo de sangre en el sitio de la inyección.
- Proceder a la inyección de células de cáncer si la arteria carótida en la bola de algodón aparece completamente presurizado con la sangre roja fresca.
3. Inyección de células cancerosas en la arteria carótida
- Vortex y dibujar o 100 lcélulas de cáncer de f en la jeringa.
- Bajo el microscopio de disección, introduzca lentamente la aguja 31 G (con bisel hacia arriba) en el lumen de la arteria carótida se sienta encima de la bola de algodón.
- Lentamente inyectar las células de la jeringa en la arteria carótida. inyección con éxito se puede observar en el microscopio por el cambio de color de los vasos sanguíneos cercanos y la musculatura cuando las células cancerosas tamponadas son empujados en la circulación.
- Cuando la inyección de todo el volumen se completa, levante la arteria carótida distal suavemente para evitar la regurgitación.
- apretar rápidamente el nudo distal para completar el proceso de inyección.
- Después de completar la inyección, apretar las ligaduras y recortar el exceso de sutura de seda con micro-tijeras bajo el microscopio de disección. Mover hacia atrás el músculo separado para cubrir el sitio de la herida. Cierre la piel con dos grapas.
4. Recuperación Quirúrgica
- Mover el animal operado sobre una almohadilla térmicapara recuperar. Puede tomar 30 - 60 minutos para que los animales puedan recobrar el conocimiento. Mientras tanto, administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) por vía subcutánea, como analgesia posquirúrgica. Nota: La analgesia debe ser proporcionada de acuerdo a su IACUC local aprobó el protocolo.
- Una vez que los animales se despiertan y reanudar su comportamiento normal, volver a los ratones a su ubicación de la vivienda. Proporcionar los ratones con comida en gel durante varios días después de la cirugía. Mantener un registro quirúrgico y mantenerlo en la habitación.
5. No invasivo imágenes in vivo
- Para las células marcadas con construcciones de reportero de luciferasa, medir la eficiencia de la inyección de células de cáncer usando el sistema de imágenes in vivo 14 en.
NOTA: Imaging no se realiza en el día de la inyección para evitar el estrés excesivo a los animales de investigación.
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Resultados
Hay dos puntos en los que la calidad de la inyección se puede evaluar. La primera oportunidad es mediante la observación del operador de cambiar los colores de los vasos sanguíneos durante la inyección. Las fugas de inyecciones pobres puede observarse fácilmente bajo el microscopio de disección. La colocación estable y segura del cuerpo del ratón (Figura 1A) y su arteria carótida (Figura 1B) en la bola de algodón de soporte son factores críticos para la ...
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Discusión
Los pasos más críticos para la inyección arterial de la carótida con éxito de células de cáncer son: 1) la anestesia profunda de ratón en la preparación para la operación quirúrgica; 2) la colocación estable de la arteria carótida en la parte superior del soporte de algodón; 3) apretada la ligadura de la arteria carótida después de la inyección con éxito.
anestesia profunda de ~ 30 minutos suele ser necesario para un rendimiento constante quirúrgica bajo el microscopio de disección. Utilizam...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores no tienen agradecimientos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de clorhidrato de ketamina/clorhidrato de xilacina | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Microscopio estereoscópico de rutina Leica M50 | Leica | M50 | El microscopio es modular y altamente configurable para adaptarse a requisitos de espacio particulares. |
| Escápula quirúrgica desechable | Integra Miltex | 4-410 | para hacer incisiones en la piel |
| Pinzas de tejido - 1 x 2 dientes | Fine Science Tools | 11021-12 | para diseccionar muclas sin rodeos |
| Dumont #5 - Pinzas con acabado de espejo | Fine Science Tools | 11252-23 | para separar y preparar la arteria carótida para la inyección |
| Tijeras de resorte | Fine Science Tools | 15025-10 | para cortar suturas |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | para cierre de heridas |
| BD Jeringa de insulina | Becton Dickinson | 328438 | para inyección |
| IVIS Spectrum In Vivo Sistema de imagen | PerkinElmer | 124262 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
