Artículo de método

Analizar los efectos beneficiosos de los suplementos nutricionales sobre las funciones epitelial intestinal de barrera durante Experimental Colitis

DOI:

10.3791/55095

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5 de enero de 2017

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1Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

En este artículo

Resumen

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Los tratamientos actuales de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) tienen como objetivo aliviar los síntomas de la enfermedad, pero pueden causar efectos secundarios graves. Por lo tanto, las estrategias alternativas están siendo investigados en modelos animales con colitis. A continuación, explicamos cómo se analizan los efectos beneficiosos de los suplementos de la dieta en los signos clínicos de la EII en un modelo de este tipo colitis.

Resumen

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Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son enfermedades crónicas recurrentes de los intestinos. Causan problemas graves, tales como calambres abdominales, diarrea con sangre, pérdida de peso, y en los individuos afectados. Desafortunadamente, no existe una cura todavía, y tratamientos sólo tienen como objetivo aliviar los síntomas. Los tratamientos actuales incluyen fármacos antiinflamatorios e inmunosupresores que pueden causar efectos secundarios graves. Esto justifica la búsqueda de opciones alternativas de tratamiento, tales como suplementos nutricionales, que no causan efectos secundarios. Antes de su aplicación en los estudios clínicos, tales compuestos deben ser probados rigurosamente para la eficacia y la seguridad en modelos animales. Un modelo experimental fiable es el modelo de colitis de dextrano sulfato de sodio (DSS) en ratones, que reproduce muchos de los síntomas clínicos de la colitis ulcerosa en humanos. Hemos aplicado recientemente este modelo para probar los efectos beneficiosos de un suplemento nutricional que contienevitaminas C y E, L-arginina, y los ácidos grasos omega 3-poliinsaturados (PUFA). Se analizaron varios parámetros de la enfermedad y se encontró que este suplemento era capaz de mejorar la formación de edema, daño tisular, infiltración de leucocitos, el estrés oxidativo y la producción de citoquinas pro-inflamatorias, lo que lleva a una mejora general en el índice de actividad de la enfermedad. En este artículo, se explica en detalle la correcta aplicación de los suplementos nutricionales utilizando el modelo de colitis DSS en ratones C57BL / 6, así como la forma parámetros de la enfermedad, tales como la histología, el estrés oxidativo y la inflamación son evaluados. El análisis de los efectos beneficiosos de los diferentes suplementos de dieta puede entonces eventualmente abrir nuevas vías para el desarrollo de estrategias de tratamiento alternativas que alivien los síntomas de IBD y / o que prolongan las fases de remisión sin causar efectos secundarios graves.

Introducción

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La colitis es una enfermedad inflamatoria del colon que puede causar diarrea y dolor abdominal. La colitis puede ser aguda, en respuesta a la infección o al estrés, o se puede desarrollar como una enfermedad crónica, tal como en la colitis ulcerosa (UC), que pertenece al grupo de las enfermedades inflamatorias del intestino (EII). A pesar de los signos clínicos de la UC han sido bien descritos, la patogénesis aún es poco conocido 1. Es un hecho aceptado entre los expertos de que la UC es una enfermedad multifactorial, con mutaciones genéticas y las respuestas inmunes aberrantes que juegan un papel importante 2. Sin embargo, los factores ambientales, como el estilo de vida y la nutrición, también contribuyen al desarrollo de la enfermedad y la progresión 3.

Por desgracia, la EII no es curable, pero hay muchas opciones de tratamiento que tienen como objetivo aliviar los síntomas clínicos. Los tratamientos actuales incluyen fármacos anti-inflamatorios, tales como la sulfasalazina y corticosteroides; inmunosupresores, tales como azathioprine; anticuerpos monoclonales que captura citoquinas pro-inflamatorias, tales como factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), o moléculas de adhesión de bloques, tales como las integrinas, para reducir el reclutamiento de leucocitos excesiva; e inhibidores que se dirigen a quinasas que activan las vías de pro-inflamatorias, tales como Janus quinasa (JAK) 4. No todos los pacientes responden a todos los tratamientos, por lo que las estrategias terapéuticas deben individualizarse 5. Además, la mayoría de estos fármacos terapéuticos interferir con el metabolismo y la respuesta inmune, causando a menudo efectos secundarios graves. Por esta razón, se han investigado las opciones de tratamiento alternativos.

Los tratamientos alternativos incluyen probióticos y suplementos nutricionales, que se han aplicado en modelos animales y ensayos clínicos con diferentes niveles de éxito 6,7. Recientemente, hemos encontrado que la aplicación de diferentes suplementos nutricionales individuales, tales como las vitaminas anti-oxidantes o ácidos grasos ω3-poli-insaturados (PUFA), es inferior a la aplicación de una combinación de tales suplementos en el alivio de la colitis y síntomas de la enfermedad cardiovascular 8,9. Estos estudios se realizaron en ratones, por lo que los estudios clínicos deben ser realizados en seres humanos para determinar si estos hallazgos también serán aplicables a los seres humanos. Antes de iniciar los estudios clínicos, la eficacia y la seguridad de las nuevas opciones de tratamiento deben ser evaluados en modelos animales.

Por IBD, el modelo de dextrano sulfato sódico (DSS) se ha utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos de desarrollo de la enfermedad y los efectos beneficiosos de los fármacos y suplementos nutricionales 6,10. En la mayoría de los estudios, sólo una enfermedad aguda durante un período de tiempo de siete días se inducidas; sin embargo, los signos clínicos observados en estos animales se parecen mucho a los observados en pacientes con EII (es decir, diarrea sanguinolenta, pérdida de peso, disfunción epitelial, y la infiltración de células inmunes) 10. DSS induce erosiones en la mucosa,lo que resulta en disfunción de la barrera y en aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal 11. El mecanismo exacto se desconoce. Sin embargo, un estudio sugiere que el DSS interactúa con ácidos grasos de cadena media-longitud para formar nano-lipocomplexes que son capaces de entrar en las células epiteliales y para inducir la señalización inflamatoria vías 12. En este artículo, se describe en detalle cómo se induce la colitis y se analizaron en ratones, cómo los suplementos nutricionales se aplica mediante una sonda para asegurar una dosificación constante en cada animal, y cómo se examinan los efectos de dichos suplementos sobre diversos síntomas de la colitis.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Cinvestav.

1. Preparación de DSS Agua Potable y la inducción de la colitis

  1. Preparar una solución de 3,5% w / v de sulfato de dextrano sódico (DSS) en el agua potable tratada en autoclave. DSS se disuelve fácilmente y no es necesario para filtrar la solución final.
    NOTA: 7 días de tratamiento DSS induce colitis severa. Si la inducción de la colitis leve, 3 - 4 Se recomienda a días de tratamiento. Mientras el agua potable DSS queda claro, no es necesario cambiar el agua. Sin embargo, si resulta turbia, debe ser reemplazado.
  2. Anotar el peso basal de los ratones machos. Asegúrese de que tengan entre 8 - 12 semanas de edad y dentro de un rango de 21 - 25 g de peso corporal.
    NOTA: La concentración DSS correspondiente debe ser optimizado en cada laboratorio. Los resultados pueden variar mucho, dependiendo de las condiciones de vivienda. Concentraciones entre 2,5 - 5% de resultados normalmente se dan para inducir una fuerte colitis en ratones C57BL / 6J WT 10. DSS de diferentes empresas y diferentes lotes debe ser probado, ya que los resultados pueden variar también con diferentes fuentes de DSS.
  3. Proporcionar agua ad libitum y reemplazarlo con agua fresca DSS 3.5% si es necesario.

2. La aplicación de suplementos nutricionales mediante sonda

  1. Preparar una solución "puede alimentar" de los suplementos nutricionales deseados en un disolvente apropiado. Para este estudio, se utilizó una mezcla que contiene 200 mg / kg de L-arginina, 83 mg / kg de vitamina C, 46 mg / kg de vitamina E, 77 mg / kg del ácido eicosapentaenoico (EPA), y 115 mg kg / ácido docosahexaenoico (DHA ) en una solución 1: 1 de agua y aceite de cártamo.
  2. Llenar una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de sonda nasogástrica (15 G x 50 mm) con la mezcla de suplemento nutricional. Limpiar el exterior de la aguja de sonda para eliminar cualquier compuesto exterior de la aguja y asegurar la aplicación de dosis adecuada.
  3. Restringir el ratón agarrando la base de la cola conuna mano y agarrando firmemente un pliegue de la piel en la parte posterior del cuello con el pulgar y el dedo índice de la otra mano. Coloque la cola entre el tercer dedo y la base del pulgar de la misma mano que sujeta el cuello.
  4. Mientras se mantiene el ratón en una posición vertical, inserte la aguja en el lado izquierdo de la boca del animal y seguir cuidadosamente el techo de la boca para localizar el esófago. Si se encuentra ninguna resistencia, avanzar la aguja hacia el estómago.
    NOTA: Asegúrese de que el animal está respirando adecuadamente antes de proceder.
  5. Administrar la mezcla lentamente, retirar el tubo lentamente tirando de la jeringa, y suelte el ratón. Aplicar suplementos nutricionales una vez al día por alimentación forzada durante el curso del experimento colitis.

3. Determinación del Índice de Actividad de la Enfermedad

NOTA: El índice de actividad de la enfermedad es la combinación de las puntuaciones para la pérdida de peso, sangrado perianal y consistencia de las heces, que son obcontenida diaria 13.

  1. Medir el peso corporal al día y asignar una puntuación de 0 a 4 de acuerdo con el porcentaje de pérdida de peso (0: 0%, 1: 1 - 5%, 2: 5 - 10%, 3: 10 - 20%, y 4:> 20 %).
    NOTA: Peso corporal pérdida se determina calculando la diferencia en porcentaje entre el peso basal antes de la inducción de colitis por DSS y el peso real.
  2. Para determinar el nivel de sangrado perianal, se recoge una muestra de materia fecal fresca y utilizar los aplicadores previstos para aplicar una capa delgada sobre un portaobjetos de un kit de prueba de sangre oculta en heces guayaco. Utilice un aplicador nuevo para cada muestra.
    1. Cierre la cubierta en la parte delantera y abra la ventana en la parte posterior de la diapositiva. Aplicar dos gotas de la solución de revelado a la parte posterior en la ubicación de la muestra.
    2. Lea los resultados después de 30 s. Cualquier rastro del color azul es positivo para sangre oculta. Asignar una puntuación de 0 a 4 (0: ninguno, 0,5 - 2,5: guayacol en heces positivo Examen de sangre oculta (dependiendo de la intensidad de la señal), y 3 - 4: grosangrado ss).
      NOTA: Si la sangre en las heces es visible, la prueba de sangre oculta en heces guayaco no tiene que ser realizado, y una puntuación de 3, 3,5, o 4 está asignado, dependiendo de la cantidad de sangre visible.
  3. Determinar consistencia de las heces mediante la observación de una muestra de heces frescas. Asignar una puntuación de 0 a 4 (0: sólido, 0,5 normales / - 2,5: heces pastosas y 3 - 4: diarrea).

4. Determinación Intestinal epitelial Permeabilidad in vivo por Evans Blue Ensayo

  1. Anestesiar a los animales mediante la inyección por vía intraperitoneal con una mezcla de ketamina (100 mg / kg de peso corporal) y xilazina (13 mg / kg de peso corporal) diluido en solución salina (0,9% NaCl), y evaluar la profundidad de la anestesia mediante la supervisión de la pizca reflejo de retirada.
  2. Coloque los animales anestesiados en una posición supina y realizar una laparotomía para exponer los intestinos.
  3. Localizar el ciego y hacer una pequeña incisión en el segmento proximal del colon unascendens (idealmente, inmediatamente adyacentes al ciego).
  4. Insertar una aguja de alimentación (G-22) y fijarlo con una ligadura usando un hilo de seda común. Limpiar, cuidadosamente abundante PBS a través del tubo para enjuagar todas las heces en el colon. Infundir solución azul de Evans (1,5% w / v en PBS) en el colon hasta que llega al ano.
  5. Incubar el azul de Evans durante 15 minutos. Lave el colorante lavando el tubo con abundante PBS hasta que el lavado perianal es clara.
  6. La eutanasia a los animales por dislocación cervical.
  7. Extirpar el colon y enjuague nuevamente con abundante PBS. Enjuagar una vez con 1 ml de 6 mM N-acetilcisteína en PBS para eliminar cualquier colorante se adhiera a la mucosa colónica.
  8. Cortar el colon longitudinalmente y enjuague una vez más con PBS y 1 ml de 6 mM N-acetilcisteína.
  9. Anotar el peso y longitud. Para extraer el colorante azul de Evans, colocar los dos puntos en 2 ml de N, N-dimetilformamida durante la noche a temperatura ambiente con suave agitationorte. Medir la concentración de colorante por espectrofotometría a 610 nm.

5. Colección de Tejidos

  1. Anestesiar a los animales mediante la inyección por vía intraperitoneal con una mezcla de ketamina (100 mg / kg de peso corporal) y xilazina (13 mg / kg de peso corporal) diluido en solución salina (0,9% NaCl), y evaluar la profundidad de la anestesia mediante la supervisión de la pizca reflejo de retirada.
  2. La eutanasia a los animales por dislocación cervical.
  3. Colocar los animales en decúbito supino y realizar una laparotomía para exponer la cavidad abdominal.
  4. Con unas tijeras, diseccionar todo el colon y registrar su longitud.
  5. Enjuague el colon cuidadosamente varias veces con PBS enfriado para eliminar las heces. Registrar el peso del tejido y prepararse para los siguientes experimentos, como se describe en los pasos 5.6 - 5.8.
  6. Para los ensayos de mieloperoxidasa (MPO) y el aislamiento de ARN, cortar una muestra de tejido del tamaño adecuado (100 mg es generalmente suficiente), colocarlo dentro de un tubo, y SNAp-congelarlo en nitrógeno líquido. Guarde los tejidos a -80 ° C para uso futuro.
  7. Para la tinción de inmunofluorescencia y la determinación del estrés oxidativo (véase más adelante), cortar una pequeña muestra de colon (0,5 - 1 cm) y sumerja en pequeños recipientes de aluminio rellenas de compuesto temperatura óptima de corte (OCT). Coloque las tazas en hielo seco y dejar que ellos se congelan lentamente, con el fin de evitar la formación de burbujas. muestras de tejido congeladas se pueden almacenar a -80 ° C para uso futuro.
  8. Para suiza rueda 14, abrir el colon longitudinalmente y retirar con cuidado las heces usando fórceps. Enrollarlo, con la mucosa hacia el interior, con unas pinzas de punta fina o un palo de madera fina, redonda. Que lo coloque dentro de un casete de inclusión y continúe con el paso 6.1.
    NOTA: DSS induce daño en el colon. Sin embargo, la distribución daño varía desde el proximal hasta el colon distal, con más daños por lo general visto en el colon distal y el recto. Por lo tanto, se recomienda el análisis de la histología, ya sea en el col distalsobre o en papeles suizos de todo el colon.

6. Análisis de Histología de colon por la tinción con hematoxilina-eosina

  1. Preparación de tejidos
    1. Para el análisis histológico, sumergir cualquiera de los brazos de gitano o los pequeños trozos de tejido de ciertas regiones del colon de ratones control y tratados en 5 ml de 10% de formaldehído durante 48 h a temperatura ambiente (RT) para conseguir una fijación adecuada.
      NOTA: Todos los pasos adicionales en el paso 6 se llevan a cabo a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
    2. Lavarlos con agua del grifo durante 18 h.
    3. Deshidratar con 15 ml de 70% de etanol durante 1 h, 96% durante 1 h, y etanol absoluto durante 1 h. Repita cada paso con alcohol fresco antes de proceder a la siguiente concentración.
    4. Continuar la deshidratación en una mezcla de 7,5 ml de etanol absoluto y 7,5 ml de xileno absoluta de 1 h. Repetir una vez antes de pasar las muestras a 15 ml de xileno absoluta de 1 h. Repita este paso una vez con xileno fresco.
  2. Incorporación de muestras de tejido de colon en parafina
    1. Sumergir las muestras en 50 ml de aceite de parafina durante 17 h. Repita este paso una vez, pero sólo el 3 h.
    2. Sumergir las muestras en cubos (de plástico, molde cuadrado, tamaño: 22 x 22 x 22 mm) en 810 ml de aceite de parafina.
    3. Dejar que la parafina con las muestras de tejido de colon se solidifique durante 24 h a TA.
  3. Corte de tejido secciones transversales utilizando un micrótomo
    1. Cortar muestras de colon utilizando un micrótomo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en un espesor de 5 micras.
    2. Recoge los recortes en un baño de agua (1 l) que contiene 0,3% de gelatina. Esto impide el plegado de tejido secciones transversales. Recuperar las secciones de tejido y montarlos en portaobjetos de vidrio.
  4. Hematoxilina y eosina de tejido secciones transversales
    1. Desparafinar las muestras durante 18 horas a 60 ° C en una incubadora. Para este fin, utilizar un cristal slide estante con un mango.
    2. Después de deparaffinization, sumergir los portaobjetos en 70 ml de xileno absoluta durante 5 min. Repita este paso una vez con xileno fresco.
    3. La transferencia de las muestras en 70 ml de alcohol absoluto durante 1 min. Repita este paso una vez con el alcohol fresco.
    4. Incubar las muestras de tejido de colon en 70 ml de etanol al 96% durante 1 min. Repita este paso una vez con el alcohol fresco.
    5. Lavar las muestras en agua del grifo dos veces durante 2 s.
    6. Incubar los tejidos en hematoxilina de Harris durante 7 min.
    7. Lavar las muestras en agua del grifo dos veces durante 2 s.
    8. Se incuban las muestras en alcohol ácido (70 ml de etanol al 70% y 700 l de 1 M de ácido clorhídrico) durante 7 s.
    9. Lavar las muestras en agua del grifo dos veces durante 2 s.
    10. Incubar las muestras de tejido en 70 ml de carbonato de litio (1 g de carbonato de litio en 100 ml de agua destilada) durante 7 s.
    11. Lavar las muestras en agua del grifo dos veces durante 2 s.
    12. Se incuban las muestras en 70 ml de etanol 80% Para 1 min.
    13. La transferencia de las muestras en 70 ml de eosina-Y durante 15 s.
    14. Incubar en 70 ml de 96% de etanol durante 1 min. Repita este paso una vez con el alcohol fresco.
    15. Incubar las muestras de tejido en 70 ml de etanol absoluto (alcohol etílico anhidro absoluto) durante 1 min. Repita este paso una vez con el alcohol fresco.
    16. Se incuban las muestras en 70 ml de una mezcla de 35 ml de alcohol absoluto y 35 ml de xileno absoluta de 1 min.
    17. La transferencia de las muestras en 70 ml de xileno absoluta durante 1 min. Repita este paso durante 5 minutos en 70 ml de xileno absoluta fresco.
    18. Añadir 80 l de resina sintética para las muestras de tejido de colon, los cubren con cubreobjetos, y dejar secar durante 24 horas a temperatura ambiente. Por último, analizar las muestras utilizando microscopía de campo brillante 8.

7. Analizar Junction Composición por inmunofluorescencia

  1. Preparar el tejido como se describe en el paso 5.7 y cortar 8 micras de espesor secciones transversalesusando un criostato.
  2. Fijar y permeabilizar de colon secciones transversales con etanol al 96% a -20 ° C durante 20 minutos.
    NOTA: Todas las incubaciones posteriores deben llevarse a cabo a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario, en una caja oscura húmeda para evitar el secado y fluorocromo desvanecimiento.
  3. muestras de aire seco, y luego enjuagar 3 veces durante 5 minutos cada uno con PBS 1x
  4. Se incuban las muestras con solución de bloqueo (PBS que contiene 0,01% de Tween y 2% BSA) durante 2 h.
  5. Retire la solución de bloqueo y enjuagar con PBS-Tween al 0,01% durante 10 min.
  6. Durante este tiempo, diluir los anticuerpos primarios a las concentraciones deseadas en PBS-Tween 0,01%.
  7. Quitar la solución de lavado, aplicar la solución de anticuerpo de la etapa anterior, y se incuba durante la noche a 4 ° C en una caja humidificada.
  8. Retirar la solución de anticuerpo y lavar 3 veces con PBS-Tween 0,01% durante 5 min cada uno y una vez con agua desionizada durante 10 minutos, con agitación muy suave.
  9. Durante el lavado, fluor centrífugaochromeconjugated, específico de la especie anticuerpos secundarios a 14.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
  10. Diluir los anticuerpos secundarios sin precipitados según lo indicado por el proveedor en PBS-Tween 0,01%, aplicarlas, y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
  11. Repita el paso 7.8 y eliminar la solución de lavado lo más completamente posible.
  12. Pipeta de 4 l de agente anti-decoloración con cada muestra en la diapositiva.
  13. Cubrir las muestras con un cubreobjetos.
  14. Deje secar al aire durante 1 h.
  15. Sello de diapositivas con esmalte de uñas. Las diapositivas se pueden almacenar a -20 ° C hasta su posterior análisis.
  16. Analizar en un microscopio láser confocal 8.

8. Determinación del estrés oxidativo mediante la oxidación de etidio

  1. Después de 7 días de DSS colitis, preparar el tejido como se describe en el paso 5.7 y cortar secciones de colon en un criostato con un espesor de 5 micras. Mount secciones transversales en portaobjetos de vidrio tratados con solución de lisina poli-L-e incubar la ingenio muestrash 5 M de dihydroethidium (DHE) en agua a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad.
  2. Lavar las muestras con PBS (pH 7,6) tres veces durante 15 min cada uno con agitación suave a temperatura ambiente. Secar las muestras y añadir una gota de medio de montaje para proteger la fluorescencia. Observar la fluorescencia de etidio oxidado en un microscopio láser confocal de barrido (aumento 40X, 568 nm longitud de onda).

9. Análisis de reclutamiento de leucocitos mediante el ensayo de MPO

  1. Después de 7 días de DSS colitis, recoger tejido de colon y homogeneizar las muestras (200 a 400 mg) con 1 ml de hexadeciltrimetilamonio (HTAB) tampón (0,5% HTAB en tampón fosfato 50 mM, pH 6,0) utilizando un homogeneizador en hielo.
  2. Enjuague la punta del homogeneizador dos veces con 1 ml de tampón HTAB para incluir todos los tejidos en el lisado y sonicar cinco veces en 40% de amplitud durante 10 s cada uno. Congelación-descongelación en nitrógeno líquido tres veces.
  3. Centrifugar a 14.000 xg durante 15 min y se recoge el sobrenadante.Preparar 2,2'-azino-bis solución (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) mediante la mezcla de ABTS, 5 ml de citrato de sodio (1 M en agua), 0,1 ml de peróxido de hidrógeno y 45 ml de bi -agua destilada.
  4. Mezclar 0,1 ml de cada sobrenadante con 0,1 ml de ABTS solución en una placa de 96 pocillos de fondo plano. Después de 10 min, se mide la absorbancia a 460 nm utilizando un espectrofotómetro.

10. Evaluación de la expresión de las citoquinas pro-inflamatorias por PCR

  1. La homogeneización del tejido
    1. Homogeneizar 50 a 100 mg de muestras de tejido de colon en 1 ml de una mezcla de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo de ácido usando un homogeneizador de energía.
    2. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
  2. La separación de fase
    1. Añadir 0,2 ml de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 s.
    2. Se incuba a 4 ° C durante 30 min.
    3. Centrifugar a 12.000 xg durante 60 min a 4 ° C.
    4. La transferencia de la Upper fase acuosa a un tubo nuevo (~ 500 l).
  3. ARN precipitación y resuspensión
    1. Añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico y se incuban las muestras a 4 ° C durante 60 min.
    2. Centrifugar a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
    3. Eliminar el sobrenadante por completo.
    4. Añadir 1 ml de etanol al 75% y agitar.
    5. Centrifugar a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
    6. Eliminar el sobrenadante.
    7. Permitir que el etanol restante se seque al aire durante 3-5 minutos.
      NOTA: Es importante no dejar que el precipitado de ARN se seque por completo, ya que esto reduciría enormemente su solubilidad.
    8. Re-disolver el precipitado en 0,3 ml de pirocarbonato de dietilo (DEPC) de agua tratada. Inmediatamente transcribir las muestras de ARN en ADNc (más estables, consulte el paso 10.5) o almacenar a -80 ° C.
  4. Cuantificación de ARN
    1. Diluir 1 l de ARN con 99 l de agua tratada con DEPC.
    2. Leer THe DO a 260 nm y 280 nm utilizando un espectrofotómetro UV / VIS para determinar la concentración de la muestra y de la pureza.
  5. Síntesis de ADNc
    1. Mezclar las muestras de ARN (1-5 mg) con 1 l de oligo (dT) 12-18 (0,5 g / l) y agua tratada con DEPC (volumen total de 12 l) en tubos estériles RNasa libre.
    2. Incubar a 70 ° C durante 10 min.
    3. Añadir 2 l de 10x tampón de PCR, 1 l de 50 mM MgCl 2, 1 l de mezcla de dNTP 10 mM, y 2 l de 0,1 M de ditiotreitol (DTT).
    4. Se incuba a 4 ° C durante 5 min.
    5. Añadir 1 l de la transcriptasa inversa y se incuba a 42 ° C durante 5 min.
    6. Incubar a 70 ° C durante 15 min.
    7. Se incuba a 4 ° C durante 15 min. cDNA se puede almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior.
  6. PCR
    1. Mezclar 2,5 l de 10x tampón de PCR, 1,5 l de 25 mM MgCl 2, 0,5 l de dNTP 10 mM de la mezcla, 0,25 μL de Taq ADN polimerasa, 0,25 l de cada cebador (10 M) y ADNc (100 ng), y agua estéril hasta un volumen total de 25 mL.
    2. Ejecutar las muestras en un termociclador de 96 pocillos. Para evitar la amplificación de ADN genómico, cebadores directo e inverso deben estar ubicados en diferentes exones: IL1β-FW: GCAACTGTTCCTGAACTCAACT y IL1β-RE: TCTTTTGGGGTCCGTCAACT; IL6-FW: CCTTCCTACCCCAATTTCCAA e IL6-RE: AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC; KC-FW: TGTCAGTGCCTGCAGACCAT y KC-RE: CCTGAGGGCAACACCTTCA; y actina-FW: TATCCACCTTCCAGCAGATGT y actina-RE: AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA. Use las siguientes condiciones de PCR: 95 ° C durante 5 min seguido de 30 ciclos a 95 ° C durante 15 s, 58 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s, más una extensión final de 10 min a 72 ° C .

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Resultados

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Suplementos de dieta puede proteger de la colitis DSS

suplementos de dieta Anti-inflamatorias y anti-oxidantes, tales como ácidos grasos omega 3-poliinsaturados vitamina C, la vitamina E, el óxido nítrico (NO) -source L-arginina, y (omega 3-PUFAs), se han utilizado con éxito variable en animales modelos para aliviar los síntomas de enfermedades inflamatorias 3,6,15. La malnutrición, el estrés oxidativo y la producción ...

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Discusión

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Con el fin de utilizar suplementos nutricionales en los estudios clínicos, los beneficios y la seguridad de estos suplementos deben ser cuidadosamente evaluados in vivo en estudios con animales. En el caso de colitis, varios modelos animales adecuados que se asemejan a los signos clínicos de la EII se han establecido, incluyendo modelos químicos usando DSS, TNBS, o en ácido acético; knock-out (KO) los modelos tales como IL10-KO; y colitis de células inmune mediada por el uso de la transferencia adoptiva de célu...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, 207268 y 233395 a Michael Schnoor). KFCO es un beneficiario de una beca del Conacyt (396260) para obtener un grado de maestría.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,3% de gelatina Bioxon158
10% formaldehídoJ.T. Baker2106-03
Placa de 96 pocillos con fondo planoCorning3368
Etanol absoluto J.T. Baker9000-03
Xileno absolutoJ.T. Baker9490-03
ABTSSigma AldrichH5882
Albúmina sérica bovinaSigma-Aldrich9048-46-8
ColoScreenHelena Laboratories5072
Corabion (Amablemente proporcionado por Merck, Naucalpan, México)Merck
Sulfato de dextrano sal de sodioAffymetrix9011-18-1(M.W. 40,000-50,000)
DihidroetidioTecnología de vidaD11347
Eosin-Y  J.T. BakerL087-03
Evans azulSigma-Aldrich314-13-6
Aguja de alimentaciónCadence Science Inc.9921
Portaobjetos de vidrio con asaMicroscopía electrónica70312-16
Portaobjetos de vidrioCorning2947
Harris hematoxilina Sigma-AldrichH3136
Hexadeciltrimetimonio (HTAB)Sigma AldrichH6269
Histosette (Casete de incrustación)SimportM498.2
Ácido clorhídrico 1 MJ.T. Baker9535-62
Peróxido de hidrógenoSigma AldrichH3410
KetaminaPiSA AgropecuariaQ-7833-028
Parafina líquida Paraplast39501-006
Carbonato de litio Sigma-Aldrich2362
N,N-dimetilformamidaJ.T. Baker68-12-2
N-acetilcisteínaSigma-AldrichA9165
Cubos de plásticoMicroscopía electrónica70181
Solución de poli-L-lisinaSigma-Aldrich25988-63-0
Prisma 5 estadístico softwareGraphPad SoftwarePrisma 5
Solución salina 0,9% NaClCS PiSAQ-7833-009
Citrato de sodioSigma-AldrichW302600
Resina sintética Poly Mont7987
Taq ADN polimerasaInvitrogen11615-010
Tissue-tek. O.C.T CompoundSakura Finetek4583
Jeringa de TuberculinaBD Plastipak305945
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5
VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración con DAPIVector LaboratoriesH-1200
XilacinaPiSA AgropecuariaQ-7833-099

Referencias

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