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Artículo de método

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones

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DOI:

10.3791/55113

16 de febrero de 2017

En este artículo

Resumen

Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

Resumen

Notablemente pocas vías de transducción de señales de célula a célula son necesarias durante el desarrollo embrionario para generar la gran variedad de tipos de células y tejidos en la forma del cuerpo adulto. Sin embargo, cada año se descubren más componentes de las vías de señalización individuales, y los estudios indican que, dependiendo del contexto, hay una interferencia significativa entre la mayoría de estas vías. Esta complejidad hace que el estudio de la señalización de célula a célula en cualquier sistema modelo de desarrollo in vivo sea una tarea difícil. Además, se requieren análisis funcionales eficientes para caracterizar las moléculas asociadas con las vías de señalización identificadas a partir de los grandes conjuntos de datos generados por las pantallas diferenciales de próxima generación. Aquí, ilustramos un método sencillo para identificar de manera eficiente los componentes de las vías de transducción de señales que gobiernan el destino celular y la especificación del eje en embriones de erizo de mar. La simplicidad genómica y morfológica de los embriones, similares a los del erizo de mar, los convierte en poderosos modelos de desarrollo in vivo para comprender interacciones de señalización complejas. La metodología descrita aquí se puede utilizar como plantilla para identificar nuevas moléculas de transducción de señales en vías individuales, así como las interacciones entre las moléculas en las diversas vías en muchos otros organismos.

Introducción

las redes de genes reguladores (GRNs) y las vías de transducción de señales establecen la expresión espacial y temporal de los genes durante el desarrollo embrionario que se utilizan para construir el plan de adultos cuerpo del animal. Célula a célula de las vías de transducción de señales son componentes esenciales de estas redes reguladoras, que proporcionan el medio por el cual las células se comunican. Estas interacciones celulares establecer y perfeccionar la expresión de genes reguladores y diferenciación en y entre los diversos territorios durante la embriogénesis 1, 2. Las interacciones entre los modu....

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Protocolo

1. Rendimiento estrategia de diseño de alta morfolino

  1. Identificar un gen (s) de interés (por ejemplo, enfoque de genes candidatos, el análisis de cis-regulador, RNAseq y pantallas diferenciales / o proteómica).
  2. Utilice genómica, transcriptómica, y los datos de expresión génica disponibles en los sitios web se actualizan con frecuencia (por ejemplo SpBase http://www.echinobase.org 20 y S. purpuratus genoma Búsqueda http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) para determinar que el perfil de expresión espacio-temporal se solapa con el mecanismo de desarrollo en cuestión. Si no hay datos de exp....

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Resultados

En el embrión de erizo de mar hemos demostrado que 3 de señalización Wnt diferentes ramas (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, y Wnt / PKC) 4, 25 interactúan para formar una red de señalización Wnt que gobierna anterior-posterior patrón (AP). Una de las consecuencias más importantes de estos eventos de señalización es que el expresado en términos generales neuroectodermo anterior (ANE) GRN inicial se restringe a un pequeño territorio al.......

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Discusión

La metodología que aquí se presenta es un ejemplo que ilustra el poder de utilizar embriones con menos complejidad genómica y morfológica de los vertebrados para entender las vías de transducción de señales y GRNs que rigen los mecanismos fundamentales del desarrollo .. Muchos laboratorios están usando ensayos similares durante el desarrollo de erizo de mar temprano para diseccionar el vías que participan en otros eventos de especificación del destino celular de señalización (por ejemplo, Notch, Hedgehog, TGF-β.......

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Robert Angerer por su cuidadosa lectura y edición del manuscrito. Los NIH R15HD088272-01, así como la Oficina de Investigación y Desarrollo y el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Mississippi brindaron apoyo para este proyecto a RCR.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Morfolino que bloquea la traducción y/o que bloquea el empalmeGene Tools LLCPersonalizadoMás información en www.gene-tools.com
GlycerolInvitrogen15514-011
FITC (isotiocianato de fluoresceína de dextrano)Invitrogen, Life TechnologiesD1821Hacer 25 mg/mL solución madre
de paraformaldehído al 16% Electrón de grado EM Ciencias de la Microscopía15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
FormamidaSigma Aldrich47671-1L-F
Levadura ARNtInvitrogen15401-029
Suero de cabra normalSigma AldrichG9023-10mL
Anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalinaRoche11 093 274 910
Clorhidrato de tetramisol (levamisol)Sigma AldrichL9756-5G
Tris Base UltraPureResearch Products Internationall Corp56-40-6
Cloruro de sodioFisher ScientificBP358-10
Cloruro de magnesioSigma Aldrich7786-30-3
BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfatoRoche11 383 221 001
4 Cloruro de tetrazolio azul nitro (NBT)Roche11 383 213 001
DimetilformamidaSigma AldrichD4551-500mL
Cloruro de potasioSigma AldrichP9541-5KG
Bicarbonato de sodioSigma AldrichS5761-500G
Sulfato de magnesioSigma AldrichM7506-2KG
Cloruro de calcioSigma AldrichC1016-500G

Referencias

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (201....

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