Las células estromales derivadas del tejido adiposo pueden ser útiles para diseñar nuevo tejido a partir de las propias células de un paciente. Presentamos un protocolo para el aislamiento de una subpoblación de células estromales derivadas del tejido adiposo humano (ASCs) con mayor potencial osteogénico, seguido de la aplicación de las células en un ensayo de curación calvarial in vivo.
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Artículo de método
El aislamiento rápido de BMPR-IB + derivadas de tejido adiposo células estromales de uso en un Defecto La curación Modelo de calota
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Resumen
Resumen
Los cánceres invasivos, las lesiones graves y las infecciones pueden causar defectos óseos que son demasiado grandes para ser reconstruidos con hueso preexistente del propio cuerpo del paciente. La capacidad de cultivar hueso de novo utilizando las propias células de un paciente permitiría que los defectos óseos se llenaran con tejido adecuado sin la morbilidad de recolectar hueso nativo. Existe interés en el uso de células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) como fuente para la ingeniería de tejidos, ya que se obtienen de una fuente abundante: el propio tejido adiposo del paciente. Sin embargo, las ASC son una población heterogénea y algunas subpoblaciones pueden ser más efectivas en esta aplicación que otras. El aislamiento de la población más osteogénica de ASC podría mejorar la eficiencia y la eficacia de un proceso de ingeniería ósea. En este protocolo, las ASC se obtienen a partir de tejido graso subcutáneo de un donante humano. La subpoblación de ASCs que expresan el marcador BMPR-IB se aísla mediante FACS. A continuación, estas células se aplican a un ensayo de curación de defectos de la calvaria in vivo y se descubre que tienen un potencial regenerativo osteogénico mejorado en comparación con las células no clasificadas.
Introducción
Los principales defectos óseos que resultan de una lesión, infección o cáncer invasivo tienen un impacto significativo en la recuperación y la calidad de vida de un paciente. Existen técnicas para llenar estos defectos con hueso sano de en el propio cuerpo del paciente en otro lugar, pero esta transferencia lleva su propia morbilidad y riesgo de complicaciones 1, 2, 3. Además, algunos defectos son tan grandes o complejas que suficiente hueso de donante no está disponible para llenar el defecto. Los dispositivos protésicos son una opción potencial para el relleno de defectos óseos, pero estos están asociados con varias desventajas, incluyendo el riesgo de infección, un fallo de hardware, y la reacción de cuerpo extraño 4.
Por estas razones, hay un gran interés en la posibilidad de la ingeniería de sustitutos óseos biológicos usando las propias células del paciente 5. Las células del estroma derivadas de tejido adiposo (ASC)tienen potencial para esta aplicación, ya que son abundantemente disponible en el propio tejido graso del paciente y que han demostrado la capacidad de curar defectos óseos mediante la generación de nuevo tejido óseo 6, 7. ASCs son una población diversa de células y varios estudios han demostrado que la selección de marcadores de superficie celular específicos puede producir poblaciones de células con actividad osteogénica mejorada 8, 9. Selección de ASC con el mayor potencial osteogénico aumentaría la probabilidad de que un andamio sembrada con estas células podría regenerar un defecto óseo grande.
Proteína morfogenética de señalización ósea (BMP) es fundamental para la regulación de la diferenciación y formación de hueso 10 y el tipo de BMP Receptor IB (BMPR-IB) se sabe que es importante para la osteogénesis en ASC 11. Recientemente, hemos demostrado que la expresión de BMPR-IB puede be utiliza para seleccionar de ASC con una mayor actividad osteogénica 12. Aquí se demuestra un protocolo para el aislamiento de las ASC derivadas de la grasa humana, seguido de un ensayo de su actividad osteogénica mediante un vivo calota modelo de defecto en BMPR-IB-expresión.
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Protocolo
Nota: Las muestras fueron obtenidas de pacientes que dieron su consentimiento informado. Todos los protocolos fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Stanford apropiado. Durante la manipulación de células y tejidos humanos, siempre se adhieren a la bioseguridad de nivel 2 (BSL2) precauciones, tal como se especifica por su institución.
1. Preparación de los reactivos
- Preparar tampón FACS: Añadir 10 ml de FBS, 5 ml de Poloxámero 188 y 5 ml Pen-Strep a 500 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
- Preparar digerir la mezcla: Añadir 0,375 g C. hemolyticum colagenasa tipo II en polvo y 5 ml de Poloxámero 188 a 500 ml estéril medianas / EBSS 199.
- Preparar medio estándar: Añadir 50 ml de FBS y 5 ml Pen-Strep a 500 ml de Eagle modificado por Dulbecco.
2. La recolección y aislamiento de ASC
NOTA: Asegúrese de que las aprobaciones institucionales adecuados están en su lugar para el uso de tejidos humanos y para aislar hLas células madre Uman. Obtener abdominal humana, flanquear o muslo de grasa subcutánea de un donante sano someterse a una liposucción electiva. Mantener la grasa en un recipiente de plástico de succión.
- Añadir PBS estéril en una proporción de 1: 1 a la grasa en el recipiente de plástico original. (Si hay 500 ml de grasa, añadir 500 ml de PBS). Mezclar por agitación suave durante 30 s. Permitir que la capa acuosa se asiente a la parte inferior (Figura 1) y luego aspirado y desechar la capa acuosa con una pipeta de 10 ml de plástico unido a la succión.
- Decantar la grasa en un recipiente de plástico grande y añadir digerir mezcla en una proporción de 1: 1. Cierre el contenedor y limpie el exterior con un 70% de etanol. Sellar la tapa con película de parafina.
- Agite este contenedor en un agitador orbital a 180 rpm a 37 ° C durante 30 min.
- Neutralizar la digestión mediante la adición de medio estándar en una proporción de 1: 1. (Si hay una mezcla de grasas 1.000 ml, 1.000 ml agregar medio estándar).
- Distribuir la mezcla en partes iguales en un número par de 250 ml de plástico tubos de centrífuga cónico y centrifugar la mezcla a 300 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y tener cuidado de dejar la pastilla intacta. pellets de resuspender en 5 ml de medio estándar para cada tubo cónico.
- Se filtra la suspensión a través de un filtro de 100 micras en un tubo cónico de 50 ml de centrífuga. A continuación, se centrifuga a 300 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 5 ml temperatura ambiente tampón de lisis RBC. Deje que la mezcla repose durante 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 300 g durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA).
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 15 ml de medio estándar. De nuevo se filtra a través de un filtro de 100 micras en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml.
- En un nuevo cónico de 50 ml, añadir 15 ml de solución de polisucrosa diseñado para la separación basada en la densidad (véase la lista de reactivos). Luego, sosteniendo el tubo en un ángulo de 45 °, la pipeta cuidadosamente las células en el lado deel tubo de manera que la suspensión de células suavemente capas en la parte superior de la solución polisucrosa (Figura 2).
NOTA: Es importante para las células de pipeta sobre la superficie de la solución. No añadir solución polisucrosa a una suspensión de células ya que esto crea una mezcla irreversible. Del mismo modo, no se puede pipetear las células en el centro de la solución polisucrosa. - Centrifugar esta mezcla a 300 xg durante 10 min a TA. Use un nivel bajo de aceleración (2 - 3 de cada 10) y configurar la función de freno de la centrífuga a cero para este paso.
NOTA: Tres capas serán visibles: clara en la parte inferior, nublado en el centro y en la parte superior de color salmón. La capa media contiene las células de interés. - Usando una pipeta de 10 ml retire con cuidado la capa media y la transfiere a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
NOTA: Es mejor para transferir completamente la capa media y en el proceso de tomar algunas de las capas superior e inferior que dejar atrás algunas de la capa media. - Contar las células usando un hemocitómetro y determinar el número total de células vivas.
NOTA: lo general el uso de azul de tripano añade a la mezcla de células a una concentración final de 0,8% para ayudar en el recuento de células. células vivas viables no ocupará el colorante azul y aparecerán en blanco.
3. clasificación FACS para BMPR-IB células positivas y Preparación de andamios que contiene células
- Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en tampón de FACS en una concentración de 1 millón de células por cada 100 l (basada en el recuento de células realizado en el paso 2,13).
- Transferir al menos 10 millones de células a un tubo de centrífuga de plástico con la etiqueta "BMPR-IB." Por otra parte, la transferencia de un millón de células en 100 l de tampón FACS a un tubo de centrífuga de plástico por separado con la etiqueta "no teñida." Añadir 1 ml de tampón FACS para el tubo "no teñida". Mantenga el resto de las células en tampón de FACS en hielo mientras que los FACS clasificación de parte de la experse está haciendo iment. Etiquetar estas células "no clasificados". Utilizarlos como controles más adelante en el experimento.
- Añadir una cantidad apropiada de un anticuerpo BMPR-IB anti-humana fluorescente al tubo "BMPR-IB" de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pipetear la mezcla arriba y hacia abajo suavemente para distribuir el anticuerpo.
NOTA: Utilizamos un humano BMPR-IB / ALK-6 Anticuerpo APC conjugado a una dilución 1:10 (véase la lista de reactivos para más detalles). Sin embargo, los anticuerpos de diferentes fabricantes tienen diferentes concentraciones recomendadas. - Cubrir el cubo de hielo de una manera que evita la entrada de luz. Dejar que la mezcla de célula / anticuerpo para sentarse durante 30 min (o de acuerdo a las instrucciones del fabricante anticuerpo).
NOTA: Si el anticuerpo anti-BMPR-IB viene como un anticuerpo no conjugado primaria que requiere un anticuerpo secundario, realizar una etapa de tinción separado en hielo con el anticuerpo secundario según las instrucciones del fabricante. - Centrifugar los tubos a ambos300 g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no aspirar el pellet. Resuspender las células sedimentadas en 1 ml de tampón FACS. Una vez más, centrifugar los tubos a 300 xg durante 5 min. aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender las células en tampón de FACS hasta una concentración de 1 millón de células por 1 ml.
- Se filtra la células no clasificadas "" BMPR-IB "," no teñida "y" a través de 40 micras coladores de células en nuevos tubos de vidrio etiquetados FACS. Lavar los filtros con 500 l de tampón FACS para asegurar que las células no se quedan atrás en el filtro. También añadir 2 ml de medio estándar para dos tubos de centrífuga de plástico separadas etiquetadas "BMPR-IB-positivo" y "BMPR-IB-negativo". Utilice estos dos para recoger las células clasificadas en la máquina de FACS.
- En la máquina de FACS, usar las células no teñidas para definir una puerta negativa para el marcador fluorescente.
- El uso de una boquilla de 100 micras, ordenar BMPR-IB células positivas y negativas en los respectivos tubos de estafadoresque contiene un medio estándar. Mantener estos tubos refrigerados a 4 ° C durante la ordenación si la máquina FACS tiene esta capacidad.
NOTA: Por favor, consulte el artículo JOVE 13 por Sharon et al. para un protocolo excelente para la clasificación FACS. - El uso de un hemocitómetro, contar las células en cada tubo. Centrifugar los tubos "Sin Clasificar" BMPR-IB-positivo "," BMPR-IB-negativo "y" a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. A continuación, volver a suspender las células en medio estándar a una concentración de 1 millón de células por 250 mL.
- Obtener andamios recubiertos con hidroxiapatita pre-corte 4 mm PLGA (poli [ácido láctico-co-glicólico]). Coloque cada andamio en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Cubrir cada andamio con 50 l de suspensión de células de uno de los tres grupos (i .e, 200.000 células.): Inclasificado, BMPR-IB-positivo, y BMPR-IB-negativo (Figura 3).
NOTA: Por favorconsulte el artículo JOVE 14 por Lo et al. para más detalles sobre la construcción de andamios de PLGA. - Llene parcialmente los pocillos vacíos que rodean con un medio estándar (para evitar la desecación de los andamios), cubrir la placa con su tapa, y se incuban en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C durante 30 minutos.
4. Creación de defectos de calota y la aplicación de ACS que contiene Andamios
NOTA: Asegúrese de que las aprobaciones institucionales adecuados están en su lugar para la creación de defectos de calota en ratones vivos. Este protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford.
- Anestesiar a un CD-1 de ratón desnudo usando ya sea el gas isoflurano inhalado o inyectado un cóctel de acción prolongada anestésico.
- Para utilizar gas solo, colocar el ratón en una cámara de anestesia y comenzar el flujo de oxígeno a 2 - 3 L / min con una concentración de 2% de isoflurano. Una vez que el ratón es fully inconsciente, colocarlo propensos a una cálida manta de recirculación de agua con una almohadilla absorbente y colocar su hocico en un cono de la nariz la anestesia con la misma concentración de oxígeno e isoflurano. monitorizar cuidadosamente la frecuencia respiratoria y ajustar la concentración de isoflurano según sea necesario.
- Para usar un cóctel anestésico de acción prolongada inyectado, anestesiar el ratón en una cámara de anestesia como se describe anteriormente y luego inyectar el cóctel anestésico. Retire el ratón de la cámara de anestesia y observar su comportamiento.
NOTA: El ratón puede emerger brevemente de la anestesia pero dentro de varios minutos debe ser de nuevo completamente anestesiado bajo el efecto del anestésico inyectado. Transferir el ratón a una cálida manta de recirculación de agua cubierto con una almohadilla absorbente.
NOTA: Para un cóctel anestésico, se recomienda una mezcla que contenía ketamina 10 mg / ml y xilazina 1 mg / ml en solución salina normal, entregado por vía intraperitoneal. La dosis estándar de esta mezcla es300 l para un ratón de 30 g, lo que equivale a la ketamina 100 mg / kg y xilazina 10 mg / kg. Vea la sección de discusión para más detalles sobre el anestésico inyectable. - Utilice una maniobra del dedo del pie de presión para determinar la profundidad de la anestesia. Un ratón anestesiado adecuadamente no se retrae la pata cuando está ligeramente pellizcado por el cirujano.
- Aplicar ungüento para los ojos para evitar la desecación de la córnea.
- Administrar 1 mg / kg por vía subcutánea buprenorfina SR.
NOTA: proporcionar analgesia antes de los resultados de la cirugía en el alivio del dolor superior. - Durante todo el procedimiento, controlar el ritmo respiratorio del ratón.
NOTA: Un ratón anestesiado adecuadamente bajo isoflurano debe tener una frecuencia respiratoria de 50 - 100 respiraciones / min. Un aumento de la frecuencia respiratoria indica que la anestesia es demasiado clara, mientras que una disminución de la frecuencia respiratoria puede indicar que la anestesia es demasiado profunda.
- Preparar la piel de la cara dorsal del cráneo con povidona-IODsolución ine seguido por 70% de etanol tres veces. Cubrir con paños estériles, dejando expuesta la zona quirúrgica.
NOTA: Use guantes quirúrgicos estériles y mantener una técnica estéril durante el procedimiento. solo se puede tocar las superficies y objetos estériles, tales como el campo estéril, los instrumentos esterilizados en autoclave. Haga que un asistente ajustar la iluminación, los paquetes de sutura abiertas, etc. - El uso de un bisturí 15-cuchilla, hacer una incisión en la línea media sagital que se extiende sobre la mayor parte del cráneo dorsal. El uso de un pinzas finas dentadas, retraer la piel en el lado derecho de la incisión para exponer el hueso parietal derecha.
- Usando un taladro con una broca de trépano con recubrimiento de diamante de 4 mm en autoclave, perforar un defecto a través del hueso parietal. No se extienden más allá del defecto óseo en la capa de la duramadre. (Figura 4)
- Colocar un andamio en el defecto, y luego cerrar la incisión de la piel con sutura continua de nylon.
- Monitorear el ratón y proporcionar un cuidado postoperatorio estándare acuerdo con las directrices institucionales.
- Mantenga el ratón sobre una toalla de papel limpia dentro de una jaula limpia mientras se recupera. Una mitad de la jaula debe ser colocado sobre una manta caliente de recirculación de agua y el ratón inicialmente debe ser colocado en este medio.
- No deje un ratón sin vigilancia hasta que se haya recuperado la suficiente conciencia para caminar. No devuelva un ratón que se ha sometido a una cirugía para una jaula con otros ratones hasta que esté totalmente recuperado.
- Repetir los pasos anteriores con un nuevo ratón para cada andamio que se va a probar. Esterilizar instrumentos quirúrgicos en entre cirugías usando un esterilizador de cuentas caliente u otro método adecuado.
- Poco después del procedimiento, y después a las 2, 4, 6, y 8 semanas, el uso de exploración micro CT para analizar la velocidad de cierre de defectos de calota.
NOTA: Véase el artículo de Levi et al. 6 para una descripción de tomografía computarizada micro defectos de la bóveda craneal. - Cuando el experimento es complete, la eutanasia a los ratones mediante la colocación de ellos en una cámara de eutanasia limpio y comenzar un flujo de gas de dióxido de carbono a la cámara a una velocidad de 2 L / min. Después de respiración han cesado por completo (después de aproximadamente 10 min) realizar la dislocación cervical para confirmar la eutanasia.
- Opcionalmente, después del experimento es completa, el uso de seccionamiento y tinción histológica para evaluar la formación de hueso dentro del defecto.
NOTA: Véase el artículo de McArdle et al. 12 para los detalles de la preparación ósea Las muestras para histología. Para una revisión de las técnicas histológicas y de tinción, consulte un manual histológico como el Manual de Patología Quirúrgica 15.
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Resultados
Micro CT scan hace en el día de la cirugía mostrará claramente el defecto craneal. En este momento no habrá crecimiento interno en el defecto de 4 mm. exploraciones posteriores se obtienen con el tiempo para cuantificar el tamaño del defecto en el tiempo en comparación con la línea base. Defectos sembrada con células BMPR-IB + deben demostrar más rápido cierre del defecto en comparación con BMPR-IB- y células no clasificadas (Figura 5). Además, la parte del cráneo que co...
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Discusión
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Durante la cosecha de ASC, el paso crítico es la digestión adecuada de grasa con colagenasa. Digestión inadecuada dará lugar a un bajo rendimiento de ASC. Durante FACS clasificación de células BMPR-IB +, es importante definir cuidadosamente la puerta para la positividad. Definición de puertas demasiado flojo puede dar lugar a poblaciones clasificadas que no son puros. Durante la creación del defecto de la bóveda craneal, es fundamental para perforar el de...
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Divulgaciones
Los autores no tienen divulgaciones que hacer.
Agradecimientos
C.D.M. fue apoyado por la Beca de Investigación Residente del Colegio Americano de Cirujanos (ACS). M.S.H. fue apoyado por la beca de formación Clinical Fellow del Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) TG2-01159. M.S.H., H.P.L. y M.T.L. contaron con el apoyo de la Sociedad Americana de Cirujanos Maxilofaciales (ASMS)/Fundación de Cirujanos Maxilofaciales (MSF) para la Beca de Investigación. H.P.L. contó con el apoyo de la subvención R01 de los NIH GM087609 y un regalo de Ingrid Lai y Bill Shu en honor a Anthony Shu. H.P.L. y M.T.L. contaron con el apoyo del Laboratorio Hagey de Medicina Regenerativa Pediátrica y la Fundación Oak. M.T.L. recibió el apoyo de las subvenciones U01 HL099776, R01 DE021683-01 y RC2 DE020771 de los NIH. D.C.W. contó con el apoyo de la subvención 1K08DE024269 de los NIH, el Laboratorio Hagey de Medicina Regenerativa Pediátrica y el Premio Scholar del Instituto de Investigación de Salud Infantil de la Universidad de Stanford.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colador de celdas de 100 micras | Falcon | 352360 | |
| Bisturí de 15 hojas | Miltex | 4-515 | |
| Placa de 24 pocillos | 3524 | Colador de | |
| celdas de 40 micras | Falcon | 352340 | |
| tubos centrífugos cónicos de 50 mL | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon sutura de nylon, aguja P-3 de 18", | Ethicon | 1698G | |
| Anticuerpo primario anti-BMPR-IB | R& D systems | FAB5051A | |
| guantes quirúrgicos BioGel PI | Mö lnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorfina SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo destornillador de agujas | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 ratón desnudo | Charles River | 086 | |
| Colagenasa Tipo II polvo | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM medio | Gibco | 10564-011 | |
| Taladro: Cuchillo circular de 4,0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Taladro: Z500 Micromotor sin escobillas | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Almohadillas absorbentes Fisherbrand, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand Almohadilla de gasa de algodón estéril, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Almohadilla térmica | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS medio | GE Ciencias de la Vida | SH30253.01 | |
| Isothesia isoflurano | Henry Schein | ||
| Micro Pinzas con dientes | Roboz | RS-5150 | |
| Micro Pinzas con dientes | Roboz | RS-5150 | |
| Película de parafina (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Andamios PLGA | Formulación patentada | ||
| Poloxámero 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Campo estéril poliforrado, 18" x 24" | Busse Hospital Desechables | 696 | Corte un agujero rectangular del tamaño apropiado |
| Solución de polisacarosa: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidona Solución de Preparación de Yodo | Medline | MDS093944H | |
| Ungüento oftálmico Puralube vaselina, tubo de 1/8 onzas | Dechra Veterinary Products | ||
| Sigma 11814389001 | |||
| Webcol hisopos de preparación para alcohol | Covidien | 6818 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
