Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Resumen

Se presenta un método para el aislamiento y cultivo de conducto de Wolff ratón (WD). También demostramos un procedimiento detallado para toda la inmunotinción monte de WDS cultivadas / recién aisladas con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio del desarrollo de WD, bobinado, y la diferenciación.

Resumen

morfogénesis de trompas es un requisito fundamental para el desarrollo de la mayoría de los órganos de mamíferos, incluyendo el sistema reproductivo masculino. El epidídimo, una parte integral del tracto reproductivo masculino, es responsable del almacenamiento de esperma, la maduración y el transporte. El epidídimo es un tubo de adultos altamente enrollado que se desarrolla a partir de una simple y directo precursor embrionario conocido como conducto de Wolff (WD). bobinado adecuada del epidídimo es esencial para la fertilidad masculina, ya que los espermatozoides en el testículo no son capaces de fertilizar un óvulo. Sin embargo, el mecanismo responsable del desarrollo de epidídimo y de bobinado no está claro, en parte debido a la falta de métodos de cultivo de órganos y de formación de imágenes enteras. En este estudio, se describe un sistema de cultivo in vitro y toda protocolo de inmunofluorescencia de montaje para visualizar mejor el proceso de bobinado WD y el desarrollo, que también puede ser aplicado al estudio de otros órganos tubulares.

Introducción

El sistema reproductor masculino consiste principalmente en los testículos, el sitio para el desarrollo de células germinales y la diferenciación, y un sistema ductal complejo que se requiere para la maduración, el transporte, y el almacenamiento de los espermatozoides. Epidídimo es un órgano tubular que conecta los testículos con los conductos deferentes y participa principalmente en el desarrollo post-testicular y la maduración de las células germinales ^1. Los altamente espiral epidídimo de ratón adulto se desarrolla a partir de un simple y sencillo tubo de precursor, conducto de Wolff (WD) ^1. La compleja estructura en espiral y del epidídimo es esencial que los espermatozoides adquieren la capacidad para fertilizar las células germinales femeninas ^2. ¿Cómo un órgano tan esencial para la fertilidad masculina se desarrolla y se mete en la forma no se entiende bien. Varias vías de señalización se han demostrado estar involucrados en el desarrollo de WD tales como la vía de señalización Wnt ^3,4 y de la vía de señalización de ⁵ andrógenos. Nuestro trabajo reciente ha establecido el requisito de balANZAD señalización Wnt para WD bobinado durante el desarrollo prenatal ^4. Sin embargo, se necesitan más estudios para comprender los mecanismos implicados en el bobinado posnatal del epidídimo, la diferenciación celular, y la comunicación de célula a célula en el epitelio del epidídimo y con las células intersticiales.

Modelos de ratones genéticamente modificados han demostrado ser una herramienta poderosa para la identificación / validación de los mecanismos moleculares desarrollo y la enfermedad de varios sistemas de órganos ⁶ subyacentes. A pesar de su amplio uso, existen limitaciones significativas de los modelos de ratones genéticamente modificados, incluyendo el fenotipo inesperado de los mutantes de ratón dirigidos con respecto a la función del gen presunta, y ningún fenotipo de mutantes nulos en algunos modelos, la influencia de los factores genéticos y ambientales, mano de obra y proceso que consume tiempo de desarrollar modelos de ratón. Por lo tanto, la interpretación de la importancia de los resultados sólo de los genéticamente modificadoscados modelos de ratón no siempre es sencillo ^6. Estas limitaciones se pueden superar mediante el uso de sistema de cultivo de órganos in vitro que nos da la flexibilidad para manipular múltiples vías de señalización en tiempo real en las condiciones de cultivo controladas. Sistema de cultivo de órganos es instrumental en la comprensión de la fisiología y patología de órganos enteros ^7. Por otra parte, de formación de imágenes de órganos enteros teñidas con anticuerpos fluoróforo marcado nos permite visualizar los marcadores de interés en un contexto de tres dimensiones, tal como existe in vivo, proporcionando de este modo una mejor comprensión de la forma del órgano, la estructura y función ^8.

Aquí, hemos descrito los métodos para el aislamiento de ratón crestas gonadales embrionarias, el cultivo in vitro y su conjunto de imágenes de inmunofluorescencia monte de WDS, que se pueden aplicar para responder a una variedad de cuestiones relativas a la morfogénesis de órganos tubulares tales como WDS. En este protocolo, seaislados de ratón embrionario crestas urogenitales de 15,5 días postcoital (dpc) presas embarazadas y los cultivaron durante 3 d, seguido de la inmunotinción para un marcador de células epiteliales (citoqueratina 8, CK8), un marcador de proliferación celular (fosfo-histona 3, PH3) y activa βcatenin.

Protocolo

cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Atención y Ética Animal de la Universidad de Newcastle y confirmaron a la Ley de Nueva Gales del Sur de Investigación de Animales, Gales del Reglamento de Investigación de Animales de New South, y el código de Australia para el cuidado y uso de animales con fines científicos. Todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Comité de Atención y Ética Animal de la Universidad de Newcastle.

1. El tiempo de acoplamiento

1. Par de 6 - 8 semanas ratones hembra justo antes de la final del ciclo de la luz del día de edad y.
2. Compruebe las hembras para la presencia de tapones vaginales temprano por la mañana (en o antes de las 8.00 AM), todos los días. Día de enchufe se considera como 0,5 dpc.
3. Transferir a la hembra con tapón vaginal en una nueva jaula (sin masculina) y la etiqueta de la fecha de enchufe.

2. Aislamiento embrionarias de ratón gonadales Cantos

1. Aislar embrión de ratónic crestas gonadales de 15,5 dpc hembras embarazadas como se describe en ^9, con algunas modificaciones como se describe a continuación.
2. Llevar a cabo la disección antes del mediodía ya que el tiempo se consideran las mujeres embarazadas para entrar en el día siguiente del embarazo por la tarde.
3. Sacrificar 15,5 dpc mujeres embarazadas que usan dislocación cervical (o según el protocolo aprobado por el Comité de Ética Animal institucional).
4. Mantenga el ratón sobre su espalda un pañuelo de papel absorbente y rociar la parte ventral del abdomen con un 70% de etanol.
5. Levantar la piel del abdomen inferior (lado ventral) con unas pinzas y hacer una incisión lateral utilizando tijeras quirúrgicas, que se extiende desde la apertura urogenital hasta el final de la caja torácica. Tire de la piel hacia la cabeza del animal para exponer el abdomen.
6. Cortar los músculos abdominales con tijeras quirúrgicas para exponer la cavidad peritoneal. Coge el útero grávido con una pinza justo por encima del cuello del útero y hacer un corte. Ahora levante el útero mediante la celebración de to la vejiga urinaria y cortó el ligamento ancho del útero, seguido por los recortes en las uniones uterotubarica para separar el útero de la unión peritoneal.
7. Transferir el útero en un tubo de 50 ml que contiene HBSS enfriado con hielo (solución salina equilibrada de Hank). Lavar el útero grávido suavemente con HBSS enfriado con hielo para eliminar el exceso de sangre.
8. Mantener el útero en una placa de Petri que contiene HBSS enfriado con hielo y mantener en hielo. Cortar la pared del útero y sacar los embriones. Mantener los embriones en una placa de Petri con HBSS fresco en hielo.
9. Tome un pañuelo de papel limpio y estéril y lo puso en una nueva placa de Petri. Pulverizar 70% de etanol en el papel de seda. Mantenga embrión en este papel de seda en la parte lateral y cortarlo de baja del abdomen utilizando una cuchilla estéril en la dirección mostrada por la línea de puntos en la figura 1.
10. Fijar el embrión en una base de esponja estéril tras cubrir a la columna vertebral,.
11. Colocarlo bajo el microscopio estereoscópico de disección y corte con cuidado a lo largo de la línea media ventral. Retire el hígado y los intestinos. El sistema urogenital ratón (riñón, uréter, testículo, WD y el conducto deferente) ahora debe ser visible.
12. Cortar el testículo y WD, y guardar en un plato de Petri con HBSS fresco, en el hielo. Para sacar el WD y los testículos, cortar los conductos deferentes cerca de su inserción en la uretra y cortar la fijación de la parte inferior de WD de gubernaculum.
13. Agrupar los testículos y WDS de los embriones de un mismo grupo (esto puede variar según el plan experimental).

3. Cultura de Embryonic gonadal Cantos (Figura 2)

1. Preparar medio para cultivar las crestas gonadales embrionarias completándolo DMEM / F12 con 10% FBS (suero bovino fetal), 1% de penicilina / estreptomicina y 1% de L-glutamina. Calentar los medios de comunicación a 37 ° C en un baño de agua.
2. Añadir 300 l de los medios de comunicación por pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos.
3. Tome una placa de Petri fresco y poner una pequeña gota de HBSS estéril en él. Ponga una membrana de policarbonato pista de grabado (0,881; m) en esta gota de HBSS con orientación de su superficie brillante del HBSS.
4. Utilizando unas pinzas limpias pusieron dos WDS y las gónadas en la membrana (en su superficie rugosa, mirando hacia arriba) y eliminar la máxima cantidad de HBSS usando toallitas estériles / de papel absorbente. No toque el tejido con papel absorbente; de lo contrario, se puede dañar el tejido.
5. Asegúrese de que ni el WDS ni las gónadas se tocan entre sí. De lo contrario, van a permanecer juntos durante la incubación posterior.
6. La transferencia de la membrana con los tejidos en el pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía medio de cultivo 300 l y la cultura ellos en interfase aire-medio. medio de cultivo demasiado en membranas da como resultado un crecimiento quístico de WDS.
7. Incubar la placa a 37 ° C incubadora, en presencia de 5% de CO _2.
8. Cambiar el medio de cultivo cada día. Para cambiar el medio con la pipeta, se elimina el medio del pozo primero y luego añadir 300 l de medio fresco precalentado.
   Nota:Para estudiar el efecto de diferentes vías de señalización en WD morfogénesis, activadores y / o inhibidores químicos en las concentraciones necesarias se pueden añadir al medio de cultivo.
9. Cultura los tejidos para 3 d. A menos de 3 d, WDS desenrollados recogidos de un embrión de 15,5 dpc se transforman en tubos altamente contorneados (Figura 3B). La adición del inhibidor de Wnt, IWR1, resulta en la inhibición de la WD de bobinado (Figura 3C).
10. Para la recolección de estos tejidos tienen una placa de Petri con PBS enfriado en hielo. La transferencia de la membrana con las gónadas culta y WD en la placa de Petri. La membrana flotará en el PBS. Presione la membrana para hundirlo en PBS y se llevará a cabo la gónada y WD.
11. Fijar los tejidos con 4% de paraformaldehído (PFA) O / N a 4 ° C o durante 1 hora a temperatura ambiente. Si es necesario, tome imágenes de campo claro de las WDS antes de la fijación.

4. Todo el montaje de inmunofluorescencia

1. Lavar los tejidos fijados 3 veces con PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) con balanceo lento, 10 min cada uno, a temperatura ambiente.
2. Deshidratar los tejidos en una serie graduada de etanol (25%, 50%, 75% y 100%), 10 min cada uno, a 4 ° C, con lenta basculante (~ 30 rpm). En este paso, los tejidos se pueden almacenar a 4 ° C en 75% de etanol.
   1. Para cambiar el etanol, mantener los tejidos inalteradas durante 2 minutos y dejar que los tejidos se calmen. Tome hacia fuera tanto sobrenadante como sea posible y luego agregar la siguiente concentración más elevada de etanol. Para evitar cualquier daño a los tejidos, la punta de la pipeta no debe tocar los tejidos en cualquier etapa.
3. Después de la deshidratación, rehidratar los tejidos en una serie graduada de etanol (100%, 75%, 50% y 25%), 10 min cada uno, a 4 ° C, con agitación lenta.
4. Lavar los tejidos con PBS-T (PBS + 0,1% de Triton X-100), 4x, 20 min cada uno, a temperatura ambiente, con agitación suave (~ 30 rpm).
5. Bloquear los tejidos para 1 h a TA con tampón de bloqueo (PBS + 1% BSA + 0,2% de leche seca no grasa en polvo + 0,3% de Triton X-100).
6. After bloqueo, la transferencia de los tejidos a la solución de anticuerpo primario (diluido en tampón de bloqueo) y se incuba O / N a 4 ° C con agitación suave (~ 30 rpm). Las diluciones de los anticuerpos primarios utilizados se describen en la Tabla de Materiales.
7. El día siguiente, lavar tejidos con PBS-MT (PBS + 2% no grasa de leche en polvo + 0,5% Tween-20), 4x, 30 min cada uno, a temperatura ambiente, con agitación suave (~ 30 rpm).
8. Después de esta etapa de lavado, añadir el anticuerpo secundario a una dilución de 1: 250 (este paso necesita optimización para anticuerpos individuales) en tampón de bloqueo y se incuba durante 1 h a TA, con balanceo suave.
9. De ahora en adelante, mantener los tejidos cubiertos con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz como anticuerpos secundarios están etiquetados con fluoróforos sensibles a la luz.
10. Lavar los tejidos 3 veces con PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), 30 min cada uno, con balanceo suave.
11. Preparar en otro portaobjetos para el montaje de los tejidos teñidos.
    1. Para ello, cortar las hojas de la cubierta de cristalen tiras finas utilizando un lápiz de diamante y se adhieren dos tiras una sobre la otra en el portaobjetos de vidrio utilizando el esmalte de uñas. Hacer dos límites y lugar en los tejidos entre estos dos límites.
    2. Añadir DAPI montaje de soporte y se puso un cubreobjetos. Aplicar el esmalte de uñas en las esquinas de la hoja de la cubierta para fijarla a la diapositiva.
       Nota: Los tejidos están ya listos para la imagen. Almacenar estas diapositivas a -20 ° C.

Resultados

Durante el desarrollo, el WD sufre cambios significativos en el que un tubo simple y directo se transforma en un conducto muy complejo y en espiral. El uso de métodos descritos anteriormente, WDS se someten a una transformación similar en condiciones de cultivo. Aquí hemos demostrado los resultados de WDS cultivadas durante 3 días (Figura 3). Para diseccionar los mecanismos moleculares implicados en la morfogénesis WD, el medio de cultivo se puede complementar con inhibidores y activadores dirigidos a d...

Discusión

El sistema de cultivo de órganos tiene muchas ventajas sobre el sistema de cultivo celular tradicional. Este sistema retiene las relaciones estructurales originales y las interacciones entre los diferentes tipos de células. Se imita en sistemas in vivo y da información más precisa que los estudios de cultivo celular en el que el factor de nicho está ausente. El uso de sistemas de cultivo de órganos incluso tener ventajas sobre el uso de todo el animal. Estos incluyen el mayor costo de la utilización de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Las placas de 24 pocillos	Corning, USA	3524	se pueden comprar de otros proveedores
Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, EE. UU	SH30031.02	se puede comprar de otros proveedores
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12)	Sigma, EE. UU	D8437	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Suero fetal bovino (FBS)	Interpath,  Australia	SH30034.02	10% FBS utilizado en medio
de cultivo L-Glutamina	GE Healthcare Life Sciences, EE. UU.	SH30034.01	% concentración utilizada
Penicilina/Estreptomicina	Gibco, EE. UU	15070-063	1% concentración utilizada
Whatman Nuclepore Policarbonato Track-Etch	Whatman, EE. UU.	110409	Membrana (0.8 µ m)
IWR1	Sigma, EE. UU.	10161-5mg	100 y micro; Concentración M utilizada
Paraformaldehído (PFA)Ciencias de	la Microscopía Electrónica, EE. UU	15710	16% en stock, 4% en PBS para su uso. TÓXICO: use guantes y no se puede desechar en el fregadero
Etanol	Thermo Scientific Fisher, EE. UU	214-20L PL	Absolute, haga 25, 50 y 75% con agua milliQ.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, EE. UU.	2509-500 ml	Muy viscoso, cuidado al dispensar
Triton X-100	Sigma, EE. UU	T8787-50 ml	Muy viscoso, cuidado al dispensar
Fosfato de hidrógeno disódico	Thermo Scientific Fisher, EE. UU	621-500 mg	se puede comprar de otros proveedores
Fosfato de sodio dihidrógeno	Ajax Finechem, EE. UU	4745-500g	se puede comprar de otros proveedores
Cloruro de sodio	Thermo Scientific Fisher, EE. UU	465-500g	se puede comprar de otros proveedores
Cytokeratin8/Troma I	Estudios del desarrollo Hybridoma Bank, EE. UU. (DHSB)	TROMA-I	1:250 en tampón de bloqueo
activo y beta; catenin	Tecnología de señalización celular,  EE. UU.	D13A1	1:200 en tampón de bloqueo
fosfo-Histona 3	Millipore, MA, EE. UU	06-570	1:200 en tampón
de bloqueo Alexa488 Cabra anti-conejo IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  EE. UU.	111-545-047	1:250 en tampón de bloqueo
Alexa594 Cabra anti-rata IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  EE. UU.	112-585-072	1:250 en tampón de bloqueo
Glicerol	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	242-500 ml	se puede comprar de otros proveedores
n-Galato de propilo	Sigma, EE. UU	2370-2
-(4-amidinofenil)-1H -indol-6-carboxamidina (DAPI)	Sigma, EE. UU.	D9564-10 mg	Úselo para teñir ácidos nucleicos (ADN)
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	2225-500 ml	Cubresolventes
(24 x 50 mm)	Lomb Scientific	CS24501GP	-

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