Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

Resumen

A continuación, se describe la purificación de Legionella pneumophila (L. pneumophila) vesículas de membrana externa (OMV) a partir de cultivos líquidos. Estas vesículas purificadas se usan después para el tratamiento de los macrófagos para analizar su potencial pro-inflamatoria.

Resumen

Las bacterias son capaces de secretar una variedad de moléculas a través de varios sistemas secretores. Además de la secreción de moléculas en el espacio extracelular o directamente en otra célula, las bacterias gramnegativas también pueden formar vesículas de membrana externa (OMV). Estas vesículas de membrana pueden entregar su carga a largas distancias, y la carga está protegida de la degradación por proteasas y nucleasas.

Legionella pneumophila (L. pneumophila) es un patógeno intracelular Gramnegativo que causa una forma grave de neumonía. En los seres humanos, infecta a los macrófagos alveolares, donde bloquea la degradación lisosomal y forma una vacuola de replicación especializada. Además, L. pneumophila produce OMV en diversas condiciones de crecimiento. Para comprender el papel de los OMV en el proceso de infección de los macrófagos humanos, establecimos un protocolo para purificar vesículas de membrana bacteriana a partir de cultivo líquido. El método se basa en la ultracentrifugación diferencial. Posteriormente, los OMV enriquecidos se analizaron con respecto a su cantidad de proteínas y lipopolisacáridos (LPS) y luego se utilizaron para el tratamiento de una línea celular monocítica humana o macrófagos derivados de la médula ósea murina. Las respuestas proinflamatorias de esas células se analizaron mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. Además, se analizaron las alteraciones en una infección posterior. Para ello, se estudió la replicación bacteriana de L. pneumophila en macrófagos mediante ensayos unitarios formadores de colonias.

Aquí, describimos un protocolo detallado para la purificación de OMVs de L. pneumophila a partir de cultivo líquido por ultracentrifugación y para el análisis posterior de su potencial proinflamatorio en macrófagos.

Introducción

Las bacterias pueden secretar factores de virulencia a través de diferentes mecanismos ^1. Además de los sistemas de secreción conocidas, las bacterias Gram-negativas pueden intercambiar información y entregar factores de virulencia a través de vesículas de membrana externa (OMV), que son pequeñas, vesículas esferoide 10-300 nm de diámetro y con una estructura de membrana de dos capas. Ellos son secretadas en una variedad de entornos de crecimiento (cultivo líquido, cultivo sólido, y biofilms) y en todas las fases de crecimiento ^{2, 3.} Las OMV son un importante medio de transporte (por ejemplo, para las proteínas, las adhesinas, toxinas y enzimas, así como para el LPS, que se encuentra en la superficie de OMV) ^4. La carga intraluminal está protegido de la degradación proteolítica, por lo que es capaz de actuar a largas distancias, y las vesículas se puede encontrar en los fluidos corporales y órganos distantes ^{5, 6,}"xref"> ^{7, 8.} No sólo pueden ser reconocidos y absorbidos por las células eucariotas ^{9, 10,} sino que, además, son capaces de facilitar la unión de las bacterias y su invasión en células huésped ^4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) es una bacteria Gram-negativa que puede liberar las OMV. En el pulmón humano, infecta principalmente macrófagos alveolares, a pesar de su huésped natural son amebas de agua dulce ^11. Una infección de L. pneumophila puede causar la enfermedad del legionario, una forma grave de neumonía ^12. Se bloquea la fusión fagosoma-lisosoma en la célula huésped. También recluta a los orgánulos de acogida, mediante el cual un nicho de replicación, la Legionella -Con vacuola (LCV), se forma ^{13, 14.} degradación lisosomal se inhibe no sólo por tra proteínas efectorasnslocation a través del sistema de secreción de tipo IV, pero también por la liberación de las OMV ^15.

Se requiere que la purificación de las OMV a partir de cultivos bacterianos para analizar su efecto sobre las células receptoras. Estudios anteriores se centraron en el contenido de proteína de L. pneumophila OMVs y en la influencia de las vesículas en las células epiteliales alveolares ^16, pero estudios posteriores con los trasplantes de tejido pulmonar humano demostraron que L. pneumophila OMVs son absorbidos por los macrófagos alveolares ^17.

A medida que los patrones actuales de OMV asociados a patógenos (PAMPs moleculares) y otros antígenos bacterianos, que podrían tener un impacto en la infección de células eucariotas y modular la respuesta inmune del huésped ^18. L. pneumophila las OMV se fusionan rápidamente con las membranas de la célula huésped y, por otra parte, activan la membranosa TLR2 ^19. Como se sabe que L. pneumophila las OMV estimulan los macrófagos y las células epiteliales de una manera pro-inflamatoria ^{16, 17,} analizamos el impacto de las OMV en el proceso de infección en los macrófagos humanos y murinos.

A continuación, se describe un protocolo para el cultivo de L. pneumophila en cultivo líquido para aislar los OMV secretadas por ultracentrifugación diferencial y para evaluar el impacto de las vesículas en las células huésped eucariotas, ya sea directamente o después de una infección.

Protocolo

1. Preparar medio y placas de agar

1. Preparar 1 L de medio de caldo (YEB). Disolver 10 g de ACES y 10 g de extracto de levadura en 900 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 6,9 con KOH (5 N). Añadir 10 ml de L-cisteína (0,4 g en 10 ml de agua destilada) y 10 ml de Fe (NO _{3) 3} x9H ₂ O (0,25 g en 10 ml de agua destilada). Llenar hasta 1 l con agua destilada y filtrar esterilizar el (tamaño de poro: 0,22 micras) solución. Almacenar a 4 ° C.
2. Preparar el extracto de levadura de carbón tamponado (BYCE) placas de agar. Disolver 10 g de ACES y 10 g de extracto de levadura en 900 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 6,9 con KOH (5 N). Añadir 15 g de agar y 2.5 g de carbón activado. Llenar hasta 1 l con agua destilada y autoclave.
   1. Añadir 10 ml de L-cisteína (0,4 g en 10 ml de agua destilada) y 10 ml de Fe (NO _{3) 3} x9H ₂ O (0,25 g en 10 mL de agua destilada, tanto esterilizado por filtración a través de 0,22-micrasporos) a BCYE enfriado (aproximadamente 50 ° C). Verter en las placas y se almacena a 4 ° C.

2. Cultivar L. pneumophila

1. Propagar la cepa de L. pneumophila Corby (tipo salvaje, WT) en placas de agar BCYE y los incuban a 37 ° C durante 3 días. Inocular 10 ml de YEB a una DO ₆₀₀ de 0,3 a L. pneumophila de la placa de cultivo previo; incubar las bacterias a 37 ° C en un agitador rotatorio (150 rpm) durante 6 h.
2. Verificar la pureza de cultivo líquido por la difusión de 100 l de la suspensión en una placa de agar sangre. Incubar toda la noche a 37 ° C.
3. Añadir el cultivo líquido restante a 90 ml de medio YEB fresco y se incuba en un agitador rotatorio (37 ° C y 150 rpm) para alcanzar una OD ₆₀₀ de 3,0 a 3,5, que tiene aproximadamente 16 a 20 h.

3. Preparar y cuantificar L. pneumophila las OMV

NOTA: Llevar a cabo todo lo siguiente etapa de centrifugacións en condiciones estériles y a 4 ° C.

1. Centrifugar el cultivo líquido a 4.000 xg durante 20 min para sedimentar las bacterias. Transferir el sobrenadante a tubos de centrífuga frescas, desechar el sedimento bacteriano, y repetir la centrifugación (4000 xg durante 20 min). Repita este paso una vez.
2. Esterilizada por el filtro del resto de sobrenadante dos veces (tamaño de poro: 0,22 micras). Transferir el sobrenadante libre de bacterias a los tubos de ultracentrífuga y ultracentrifugación a 100.000 xg durante 3 h.
3. Se decanta el sobrenadante y desecharlo. Resuspender el precipitado OMV en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y ultracentrifugación (100.000 xg durante 3 h) para eliminar las proteínas y LPS contaminantes.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el OMV en 500 l de PBS estéril. Racha de 20 l en una placa de agar sangre y en una placa de agar BYCE para excluir la contaminación bacteriana de las vesículas preparadas. Incubar la placa de agar sangre durante la noche y la placa de agar BCYE durante 3 días (ambos a 376; C).
5. Cuantificar la cantidad de proteína obtenida de la preparación de OMV utilizando un ensayo de ácido bicinconínico de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: La concentración de 100 ml de L. pneumophila cultura es normalmente de 1 g / l. Almacenar los OMV preparadas y cuantificados a -20 ° C.

Los macrófagos 4. Tratamiento previo

1. Preparar las células THP-1.
   NOTA: THP-1 es una línea celular monocítica derivada de un paciente con leucemia.
   1. Añadir 2x10 ⁵ células THP-1 por 24 pozos y diferenciarlos mediante la adición de 20 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) en células similares a los macrófagos. Incubar durante 24 horas a 37 ° C.
   2. Reemplazar el medio con 500 l de medio fresco y se incuba durante otras 24 h; el medio óptimo para las células THP-1 se compone de RPMI 1640 alta glucosa suplementado con suero de ternera fetal al 10%.
2. Aislar los macrófagos derivados de médula ósea murina (mBMDM), como se describe en ConsulteENCE 20.
3. El tratamiento de los macrófagos derivados de células THP-1 o mBMDM con las OMV.
   1. Descongelar las OMV preparadas en el paso 3 y agregarlos en función de su cantidad de proteínas (0,1, 1 y 10 mg / ml) a la macrófagos murinos o humanos. Incubar los macrófagos con las OMV a 37 ° C durante al menos 20 h. Utilice el sobrenadante por ELISA o seguir adelante con el paso 5.

5. infectar a los macrófagos y Evaluar la replicación bacteriana con un ensayo de formación de colonias (UFC)

1. Utilice L. pneumophila desde el paso 2.1, pre-tratado células THP-1 o mBMDM de la etapa 4.3, y no los macrófagos pre-tratados como controles (2x10 ^5/24 pozos). No cambiar el medio.
2. Infectar las células THP-1 con L. pneumophila Corby WT y mBMDM con un mutante que carece de flagelina de L. pneumophila Corby (ambos con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5; 1x10 ⁵ L. pneumophila / 24 pocillos) y se incuba durante 24 y 48 h, respectivamente. preparar boTH L. pneumophila Corby (WT o flagelina que carece mutante) como se describe en el paso 2.1.
3. Lisar las células en su medio de la adición de saponina (concentración final: 0,1%) y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
4. Resuspender las bacterias mediante pipeteo y transferir la suspensión a un recipiente de reacción. Preparar diluciones seriadas de la L. pneumophila -Con medios de comunicación en PBS estéril.
5. Racha de 50 l de las diluciones requeridas en placas de agar BCYE e incubar durante 3 días a 37 ° C.
6. contar visualmente las colonias formadas. Calcular la CFU Normalizar el resultado del recuento de UFC no tratados previamente, pero los macrófagos, que se establecen en 100% infectada.

Resultados

El montaje experimental para preparar L. pneumophila las OMV y analizar su influencia en la respuesta pro-inflamatoria de los macrófagos después de la infección se representa en la figura 1. El potencial pro-inflamatoria de las OMV preparadas puede ser analizada en células THP-1 diferenciadas con PMA, que se muestra en la Figura 2. THP-1 células responden con un aumento del tiempo y dependiente de la dosis de IL-8 e IL-6 secreción. Además, la influencia de diferentes TLRs sobre el reconocimiento L. pneumophila OMV se puede analizar mediante el uso de mBMDM de diferentes orígenes genéticos, tal como se presenta por el CXCL1 ELISA en la Figura 3. mBMDM de ratones WT secretadas CXCL1 después de la estimulación OMV, mientras que mBMDM TLR2 / 4 ^{- / -} secretada significativamente menor. Para estudiar el impacto de L. pneumophila las OMV en la replicación bacteriana en macrófagos THP-1, las células fueron pre-incubadas con las OMV y luego infectados, además,con L. pneumophila (Figura 4 A). El pre-estimulación de los macrófagos derivados de células THP-1 reduce en primer lugar la replicación bacteriana después de 24 h de infección, pero conduce a una duplicación en UFC cuenta en el instante más tarde (48 h pi). El impacto de receptor Toll-like (TLR) de señalización en el reconocimiento OMV después de la infección de los macrófagos puede ser evaluada por mBMDM, tal como se presenta en la Figura 4 B. Bacterianos de replicación se incrementa en diez veces en mBMDM de animales WT después de OMV pre-incubación, mientras que TLR2 ^{- / -} y TRIF / MyD88 ^{- / -} células no muestran este incremento en la replicación de L. pneumophila.

Figura 1: Procedimiento experimental. (A) L. pneumophila Corby WT de 10-cm BCYE placas de agar se usan para inocular un pequeño cultivo líquido (10 ml), que se transfiere en 90 ml de YEB frescomedio después de 6 h. Un pequeño volumen también se sembró en una placa de agar sangre para comprobar la pureza. Las bacterias se incubaron a 37 ° C hasta la fase estacionaria temprana (OD ₆₀₀ = 3,0 a 3,5). (B) El cultivo líquido se centrifuga y esterilizada por filtración para eliminar las bacterias. El sobrenadante exento de Legionella se ultracentrifugó a continuación, para obtener un pellet OMV, que se volvió a suspender en PBS y se ultracentrifuga de nuevo. Las vesículas aisladas se volvieron a suspender, comprobado por la pureza, y cuantificados por la cantidad de proteínas. La barra de escala representa 2,5 cm. (C) los macrófagos humano o murino se estimulan con las OMV cuantificados. El sobrenadante del cultivo celular se puede utilizar para ELISA, o macrófagos pueden ser infectados con L. pneumophila para determinar la replicación bacteriana mediante ensayo de CFU en 10 cm-BCYE placas de agar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: activación de pro-inflamatoria de las células THP-1 por L. pneumophila las OMV. (A) Aquí, la línea celular THP-1 monocítica se utiliza como un modelo para los macrófagos alveolares. Células diferenciadas con PMA THP-1 se trataron con dosis crecientes de L. pneumophila OMV (0,01 a 25 mg / ml) durante 24 y 48 h, respectivamente. El sobrenadante libre de células se utilizó para IL-8 ELISA. Se muestran los valores medios de tres experimentos independientes ± SEM. THP-1 células respondieron a tan poco como 0,01 g / ml L. pneumophila las OMV con significativa IL-8 secreción, que era tiempo y dependiente de la dosis. (B) L. pneumophila OMV (0,1 a 10 mg / ml) se usaron para estimular las células THP-1 diferenciadas con PMA. El sobrenadante se recogió después de 24 y 48 h de incubación, y los liberados IL-6 se midió en el sobrenadante mediante ELISA. Se muestran los valores medios de tres experimentos independientes ± SEM. THP-1 células secretadas cantidades significativas de IL-6, incluso con la dosis más baja de las OMV (0,1 mg / ml). La secreción de IL-6 aumentó con dosis crecientes de OMV y con tiempos de incubación prolongados. Estadística: prueba de Mann-Whitney; * P <0,05 y ** p <0,01 en comparación con el correspondiente 0 mg / ml OMV. Reproducido con permiso de Referencia 20. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La activación pro-inflamatoria de los macrófagos depende de TLR2 / 4. mBMDM de WT y TLR2 / 4 ^{- / -} ratones se incubaron con L. pneumophila OMV (0,1 o 1 mg / ml). la secreción de CXCL1 se analizó por ELISA después de 24 y 48 h, respectivamente. losSe muestran los valores medios ± SEM de tres experimentos independientes. mBMDM de ratones WT respondió con una secreción CXCL1 dependiente de la dosis después de L. pneumophila OMV incubación. TLR2 / 4 ^{- / -} mBMDM secretadas significativamente menor en comparación con WT CXCL1 mBMDM, y esta secreción no aumentó de forma dependiente de la dosis. Estadística: prueba de Mann-Whitney; * P <0,05 en comparación con el 0 mg / ml correspondiente OMV; #p <0,05 en comparación con una muestra WT igualmente tratada. Reproducido con permiso de Referencia 20. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: replicación de L. pneumophila OMV pre-incubación aumenta bacteriana en macrófagos. (A) diferenciada THP-1 células se pre-incubó con las OMV (0,1, 1, o 10 μ; G / ml) o LPS / IFN-γ (200 ng / ml de cada uno) o se dejaron sin tratar para el control. Después de pre-incubación (20 h), las células THP-1 fueron infectadas con L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) durante 2, 24, y 48 h, respectivamente. THP-1 células fueron lisadas por la adición de saponina, y las bacterias se sembraron en placas de agar BCYE. UFC se calcula en relación a 0 mg / ml OMV después de cada punto de tiempo. Las barras representan los valores medios ± SEM de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado técnicas. No hubo diferencias en la absorción bacteriana (2 h post-infección (pi)) en comparación con células no pre-tratadas. Las alteraciones en la replicación bacteriana se determinaron después de 24 y 48 h, respectivamente. LPS / células THP-1 pretratadas IFN-γ mostraron una reducción en la carga bacteriana 24 h pi Esto también se observó de forma dependiente de la dosis para las células pretratadas L. pneumophila OMV. En el punto de tiempo más tarde (48 h pi), las células THP-1 OMV pre-tratados mostraron una duplicación en L. pneumophila replicatura, mientras que LPS / IFN-gamma macrófagos pre-tratados mostraron una reducción adicional de la carga bacteriana. Estadística: prueba de Mann-Whitney; * P <0,05 y ** p <0,01 en comparación con el correspondiente 0 mg / ml OMV. (B) mBMDM de ratones con diferentes fondos genéticos (WT, TLR2 ^{- / -,} y TRIF / MyD88 ^{- / -)} se pre-incubó con 0,1 mg / ml L. pneumophila OMV para 20 h y luego se infecta con un flagellin- mutante deficiente de L. pneumophila Corby (MOI 0,5) durante 48 h. mBMDM se lisaron por la adición de saponina, y la Legionella se sembraron en placas de agar BCYE. La CFU se calcularon en relación a 0 g / ml de OMV, indicado por la línea sólida. Las barras representan los valores medios ±± SEM de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. mBMDM de ratones WT mostró un aumento en la replicación de L. pneumophila después de OMV pre-tratamiento. TLR2 ^{- / -} macrófagos mostraron una reducción significativa - / - mBMDM. Estadística: prueba de Mann-Whitney; p <0,05 en comparación con la muestra de WT. Reproducido con permiso de Referencia 20. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Las OMV de patógenos bacterianos y el impacto de estas vesículas de membrana de sus células diana están actualmente siendo estudiados intensamente. Por ejemplo, Clostridium perfringens -derivado OMVs inducen la secreción de citoquinas en los macrófagos, los linfocitos B pueden ser activadas por las OMV de Borrelia burgdorferi, y Helicobacter pylori -released vesículas de membrana pueden actuar sobre las células epiteliales gástricas ^{21, 22, 23.} L. pneumophila, un patógeno intracelular que puede inducir una forma grave de neumonía atípica, también libera las OMV que son capaces de activar las células y macrófagos ^{16, 19} epiteliales del pulmón. A continuación, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento a pequeña escala de L. pneumophila las OMV de cultivo líquido para estudiar el papel potencial de las OMV en la neumonía. Es fundamental para trabajar bajo Condit estériliones y descartar la contaminación de otras bacterias con el fin de obtener una L. pneumophila pura -derivado preparación de OMV. El aislamiento de las OMV incluye una etapa de filtración a través de poros de 0,22 micras con el fin de evitar la contaminación de la pastilla OMV obtenido con L. pneumophila, a pesar de que esto reduce el rendimiento de OMV, ya que los más grandes las OMV se pierden por esta etapa de filtración.

Por otra parte, hemos probado la respuesta de los macrófagos humanos y murinos a esas vesículas aisladas y células infectadas con L. pneumophila para aproximarse más de cerca la situación en la neumonía por Legionella, donde las OMV son liberados dentro de la LCV por bacterias extracelulares ^15. Las dosis empleadas OMV se han estimado de acuerdo con la cantidad libre de OMV en una infección in vitro de macrófagos humanos después de 24 h de incubación (descrito en la referencia 20). Para la estimulación de otras células receptoras o en experimentos in vivo,OMV otras dosis pueden ser necesarios y deben ser establecidos. El análisis del efecto de L. pneumophila VME representa un avance con el protocolo descrito por Jager y Steinert ^24.

Aquí, PMA-diferencian las células THP-1 sirven como modelo para los macrófagos alveolares debido a la limitada disponibilidad de material humano primario. La adición de PMA diferencia los monocitos las células THP-1 en las células como los ^{macrófagos-25.} Además, son una línea celular modelo bien conocido para L. pneumophila estudia ^26. Además de esta línea celular de monocitos humanos, se usan células mBMDM. mBMDM son ampliamente aceptados para el estudio de los efectos de L. pneumophila ^{27, 28, 29.} La posibilidad de utilizar nocauts genéticos de diferentes TLRs u otras proteínas en una herramienta valiosa para el estudio de los efectos de OMV hacer. En Order para disminuir la cantidad de ratones por experimento, mBMDM se utilizan en lugar de los macrófagos alveolares debido a las limitaciones de los macrófagos. experimentos clave podrían requerir los macrófagos alveolares para la validación.

Además del protocolo descrito en el presente documento de ultracentrifugación para purificar las OMV, es posible llevar a cabo una centrifugación en gradiente de densidad, que se incluye en el protocolo por Chutkan et al. ^30. Esto podría mejorar la pureza de la preparación de OMV obtenido y reducir la cantidad de agregados co-purificado de proteínas, flagelina, y LPS. La pureza de la preparación de OMV obtenido puede ser analizado por microscopía electrónica de transmisión o por análisis de seguimiento de nanopartículas como un paso adicional en el control de calidad. Esto puede proporcionar un medio adicional de cuantificación, más allá del procedimiento de medición de proteínas que aquí se presenta. Opcionalmente, la concentración de LPS se puede analizar mediante un ensayo de lisado de amebocitos de limulus. Si el rendimiento es bajo OMV, unaetapa de concentración adicional a través de filtros centrífugos se podría realizar, que no se hace aquí. Si el rendimiento fue menor de lo esperado, se descartaron los OMV.

Como parte de los esfuerzos en curso para aclarar los mecanismos biológicos y funciones detrás de las OMV, la influencia de diferentes condiciones de estrés sobre la producción de OMV podría ponerse a prueba. La privación de nutrientes, cambios en la temperatura de incubación, o la exposición a los agentes nocivos podría tener un impacto sobre la secreción de OMV ^31. Las posibles condiciones de estrés se discuten en el protocolo por Klimentová y Stulik ^32. Por otra parte, los mutantes de L. pneumophila hiper o hypovesiculating se podrían generar. Las diferentes preparaciones de OMV podrían entonces ser analizadas en experimentos de infección con los macrófagos, los explantes de tejido de pulmón humano (descrito en la Referencia 17), o incluso en modelos in vivo. Además del papel de las OMV en la señalización inmune innato, su influencia en la comunicación bacterianase pueden abordar experimentalmente. Además, el impacto de varias cascadas de señalización inmune innata podría ser analizado por el uso de células knockout murinos o la generación de CRISPR knockouts / Cas9 en líneas celulares humanas. Esta investigación básica en las OMV ayudará en el desarrollo de nuevas estrategias vacunales, que ya existen para la meningitis B transmitida por Neisseria meningitidis ^33.

A partir del protocolo sobre el aislamiento y caracterización de OMV, se puede aplicar esto a otras bacterias Gram-negativas y de otras células huésped; sólo necesita ser ajustado para el crecimiento de las bacterias en un cultivo líquido. El protocolo publicado por Chutkan et al. proporciona información detallada sobre la generación de las OMV de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa ^30. La cultura no debe alcanzar la fase estacionaria tardía con el fin de evitar aumentos de bacterias lisadas y las proteínas contaminantes y membranas. Además, la dosis OMV utilizado para la estimulación de las células huésped necesita ser determinado de acuerdo con la cantidad de las OMV durante las infecciones presente in vivo, sin dejar de garantizar una baja tasa de citotoxicidad. De esta manera, el papel patológico de las OMV, su impacto en la comunicación entre las especies, y las interacciones huésped-patógeno podría ser examinada.

Para estudiar más a fondo el papel de L. pneumophila las OMV en la neumonía, son necesarias preparaciones estandarizadas de OMV con suficientes rendimientos y la infección experimentos comparables. Este protocolo ayudará a estandarizar los procedimientos de aislamiento y de extender los estudios de OMV a otras bacterias Gram-negativas y a otras células huésped. Además, las investigaciones se beneficiará de la detallada en el conocimiento vitro, que puede ser usado para extender los experimentos en los ajustes in vivo. En el futuro, este protocolo podría ampliarse para el aislamiento de las OMV a partir de material biológico primario, tales como suero o lav broncoalveolarfluido de edad, para profundizar en la composición de las OMV liberada en condiciones fisiológicas. Esto ayudará a determinar los parámetros clave de la composición de OMV y para comprender las propiedades de las OMV -generated in vitro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de 10 cm	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	82.1473
Rotor de 70 Ti	Beckman Coulter Incorporated (California, EE. UU.)	337922
ACES	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	9138.2
carbón activado	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	X865.2
agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	5210.2
Agar Columbia con 5% de sangre de oveja	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemania)	254005
cubetas	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	67.742
ELISA (humano)	BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemania)	IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murino)	DuoSet, R& D (Minneapolis, EE. UU.)	CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2O	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	5632.1
Suero fetal para terneros (FCS)	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemania)	10270-106
Heracell 240i Incubadora de CO2	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	75004515
Circuito de inoculación	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemania)	86.1567.010
KOH	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	6751.1
L. pneumophila Corby	---	---	amablemente proporcionado por la Prof. Dra. Antje Flieger (RKI, Berlín, Alemania)
L. pneumophila Corby & Delta; flaA	------		amablemente proporcionado por el Prof. Dr. Klaus Heuner (RKI, Berlín, Alemania)
L-cystein	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)
mBMDM	------		amablemente proporcionado por el Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Alemania) y el Prof. Dr. Carsten Kirschning (Universidad de Duisburg Essen, Essen, Alemania)
PBS	Biochrom GmbH (Berlín, Alemania)	L 1825
forbol 12-miristato 13-acetato	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemania)	P8139-1MG
agitador giratorio (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	SHKE6000
RPMI 1640 alta glucosa	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemania)	11875-093
saponina	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Inglaterra)	80-2116-30
filtro estéril (tamaño de poro: 0,22 y micro; m)	Corning Incorporated (Nueva York, EE. UU.)	431096
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemania)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)
extracto de levadura	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemania)	2363.2
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemania)	23225