Este estudio describe métodos para la co-expresión mediada por T7 de múltiples genes de un único plásmido en Escherichia coli usando el sistema de plásmido pMGX.
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Artículo de método
Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La co-expresión de múltiples proteínas es cada vez más esencial para la biología sintética, estudiando los complejos proteína-proteína, y caracterizando y aprovechando las vías biosintéticas. En este manuscrito, se describe el uso de un sistema altamente eficaz para la construcción de operones sintéticos multigénicos bajo el control de una ARN polimerasa T7 inducible. Este sistema permite que muchos genes se expresen simultáneamente a partir de un plásmido. En este caso, un conjunto de cuatro vectores relacionados, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K y pMGX-hisK, con el marcador seleccionable de resistencia a la ampicilina o la kanamicina (A y K) y que poseen o carecen de una hexahistidina N-terminal Etiqueta (su) se describen. Se proporcionan protocolos detallados para la construcción de operones sintéticos usando este sistema vectorial junto con los datos correspondientes, mostrando que un sistema basado en pMGX que contiene cinco genes puede ser fácilmente construido y usado para producir las cinco proteínas codificadas en Escherichia coli . Este sistemaEm y el protocolo permite a los investigadores a rutinariamente expresar complejos módulos de múltiples componentes y vías en E. coli .
Introducción
La co-expresión de múltiples proteínas es cada vez más esencial, particularmente en las aplicaciones de biología sintética, donde se deben expresar múltiples módulos funcionales 1 ; En el estudio de complejos proteína-proteína, donde la expresión y la función a menudo requieren co-expresión 2 , 3 ; Y en la caracterización y el aprovechamiento de las vías biosintéticas, en las que cada gen en la vía debe expresarse 4 , 5 , 6 , 7 , ....
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Protocolo
1. Obtención de genes de interés
- Diseño de genes sintéticos.
- Optimizar una secuencia génica para la expresión de E. coli .
- Elimine cualquier sitio de restricción problemático de la secuencia (AvrII, NdeI, EcoRI y XbaI).
- Incorporar sitios de restricción para la clonación; Se recomienda un sitio 5'-NdeI y un sitio 3'-EcoRI. Otros sitios pueden ser usados, si es necesario; Se refieren a la región de clonación múltiple del plásmido seleccionado ( Figura S1 - S4 ). Si se desea, incluir una etiqueta de codificación 5 'o 3' para la detección de tr....
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Resultados
En este estudio, el objetivo era co-expresar cinco proteínas de un solo plásmido. Los fragmentos de gen sintéticos optimizados con cinco codones que codifican etiquetas de hexahistidina N- o C-terminal se compraron comercialmente. Los genes sintéticos se amplificaron por PCR y se clonaron individualmente en un vector PCR-blunt y se secuenciaron. Para generar el plásmido policistrónico, los cinco genes de interés se clonaron primero en un plásmido pMGX adecuado, pMGX-A.
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Discusión
La co-expresión de múltiples genes es cada vez más esencial, en particular en la caracterización y reconstitución complejas, multigénicas vías metabólicas [ 3 , 4 , 5] . El sistema pMGX hace co-expresión multigén en la rutina de E. coli 6 , 7 , 8 y accesible a diversos investigadores. En este estudio, s.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuertes | |||
| intestinal de ternera (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New Inglaterra Biolabs | R0145S | |
| Herculasa II ADN polimerasa de fusión | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 ADN ligasa | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb Escalera de ADN | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Geles de proteínas sin manchas | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarosa | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilina | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) Células | compenetrantes Célula comeptente preparada internamente | ||
| B-PER Reactivo de extracción de proteínas bacterianas | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP | mix Agilent Technologies | ||
| de extracción en gel de polimerasaOmega | D2500-02 | E.Z.N.A Extracción en gel, suministrada por VWR Cat 3: CA101318-972 | |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, ratón | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminiscent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Metanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Leche descremada instantánea pasteurizada en polvo | comestibles local | La leche de la tienda de comestibles sin nombre es adecuada | |
| Membrana de nitrocelulosa | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrana PT 0.45 y micro; m 200 mm x 4 m, suministrado por VWR Cat #: CA10061-086 Kit de |
| aislamiento de ADN plasmídico | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, suministrado por VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Solicitud del Boddy Lab | |
| Primers | Tecnologías | integradas Diseñe cebadores según sea necesario para el gen deseado | |
| genes sintéticos | Diseñe y optimice según sea necesario | ||
| Papel de filtro de transferencia gruesa | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue Células químicamente competentes Célula | Comeptent preparada en casa | ||
| Nombre | Compañía | Número de catálogo | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| gel - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electroforesis Cell |
| Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubadora-horno | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubadora-agitadora | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Maquinillas de afeitar | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transiluminador | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf Z316091 | Mastercycler Personal, suministrado por Sigma | |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Baño de agua | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
Referencias
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.<....
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Reimpresiones y permisos
