Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering og karakterisering af Mesenchymale stromacellers fra human navlestrengen og føtalt Placenta

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55224
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 2,4, 1,2
1Department of Biological Sciences, Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology, St. John Provindence - Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery, Beaumont Health System

Summary

Her præsenteres en protokol for dissektion af human navlestreng (UC) og føtal placenta prøven i ledning foring (CL), Whartons gelé (WJ), snor-placenta motorvej (CPJ), og føtal placenta (FP) til isolering og karakterisering af mesenchymale stromale celler (MSC'er) under anvendelse af eksplantatet dyrkningsteknik.

Abstract

Den menneskelige navlestreng (UC) og placenta er ikke-invasive, primitive og rigelige kilder til mesenkymale stromale celler (MSC), der i stigende grad har fået opmærksomhed, fordi de ikke udgør nogen etiske eller moralske bekymringer. Nuværende fremgangsmåder til isolering MSC'er fra UC opnåelse lave mængder af celler med variable spredning potentialer. Da UC er en anatomisk-komplekst organ, kan forskelle i MSC egenskaber skyldes forskellene i anatomiske områder i deres isolation. I denne undersøgelse vi først dissekeret ledning / placenta prøver i tre adskilte anatomiske områder: UC, snor-placenta junction (CPJ), og føtal moderkage (FP). Sekund, to særskilte zoner, ledning foring (CL) og Whartons gelé (WJ), blev separeret. Eksplantatet dyrkningsteknik blev derefter anvendt til at isolere celler fra fire kilder. Den nødvendige tid til den primære dyrkning af celler fra eksplantaterne varierede afhængigt af kilden af ​​vævet. Udvækst af cellerne forekom inden for 3 - 4 days af CPJ eksplantater, hvorimod der blev observeret vækst efter 7 - 10 dage og 11 - 14 dage efter den CL / WJ og FP eksplantater hhv. De isolerede celler blev adhærerende til plast og vises fibroblastoide morfologi og overflademarkører, såsom CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105 svarende til knoglemarv (BM) afledte MSC'er. Imidlertid kolonidannende effektivitet af varierede celler, med CPJ-MSC'er og WJ-MSC'er, der viser højere effektivitet end BM-MSC'er. MSC fra alle fire kilder differentieret i adipogeniske, chondrogene og osteogene afstamninger, hvilket indikerer, at de var multipotente. CPJ-MSC'er differentieret mere effektivt i forhold til andre MSC kilder. Disse resultater antyder, at CPJ er den mest potente anatomiske område og giver et højere antal celler, med større spredning og selvfornyelse kapacitet in vitro. Konklusionen er, at sammenlignende analyse af MSC'erne fra fire kilder indikerede, at CPJ er en mere lovende kilde af MSC'er til celleterapi, regenerative medicin, og vævsmanipulering.

Introduction

Stamceller er til stede i forskellige organer og væv i kroppen. De besidder regenerativ potentiale og spiller en stor rolle i at reparere beskadigede væv i kroppen hele span af menneskeliv 1, 2. Det har skabt en stor interesse i voksne stamceller (ASC), især da, i modsætning til embryonale stamceller (EKSF), vil brug af ASCer ikke udgør moralske og etiske dilemmaer. Adskillige undersøgelser har rapporteret isolering af ASC'er, såsom mesenchymale stromale celler (MSC'er); hæmatopoietiske stamceller (HSC'er); og forskellige progenitorer, herunder forskellige voksent kilder spænder fra knoglemarv (BM) til fedtvæv (AT) og dental pulp 3, 4, 5. Imidlertid er antallet af ASC'er stede i de fleste af de voksne nicher er begrænset, og deres isolation omfatter generelt en invasiv og smertefuld procedure med mulig donorwebsted sygelighed. Desuden kunne donor alder og miljømæssig stress også spille en væsentlig rolle i bestemmelsen af kvaliteten og biologiske aktivitet af de isolerede celler 6, 7, 8. ASC'er udviser også begrænset proliferation og differentiering potentiale under dyrkning in vitro.

For at overvinde disse ulemper ved nuværende ASC, har nye kilder blevet forfulgt for at isolere stamceller. Disse bestræbelser har ført til isoleringen af stamceller fra perinatale kilder, herunder navlestrengsblod, ledning væv, placenta og fostervand 9. Disse kilder har fået opmærksomhed på grund af deres let og rigelig tilgængelighed 10, 11, 12, 13. Endvidere perinatale væv kan opnås ikke-invasiv, og stamceller fra dem ermere primitive end ASC'er isoleret fra voksne kilder 14, 15. De er isoleret fra væv opnået ved fødslen og anses for at have undergået minimale ændringer i genomet på grund af aldring og miljøbelastninger 16.

Men de rapporterede karakteristika for stamceller fra perinatale kilder og deres potentiale til at forny sig selv samt at differentiere varierer meget 11, 17. Dette kunne delvis skyldes, at den menneskelige navlestreng (UC) er en komplekst organ. Vi hypotesen, at de diskrete områder af perinatal væv skaber specifikke nicher ansvarlige for variationer og mere primitive natur af disse stamceller i sammenligning med ASC'er afledt af ikke-perinatale kilder. Denne undersøgelse beskriver dissektion af ledning / placenta prøver i tre adskilte anatomiske områder: UC, snor-placenta junction (CPJ), end føtal placenta (FP). UC blev yderligere dissekeret i to zoner: ledning foring (CL) og Whartons Jelly (WJ). Analyse af de isolerede celler fra CL, WJ, CPJ, og FP vist, at de udviste alle fibroblastoid morfologi og udtrykt MSC markører, men de adskiller sig i deres selvfornyelse og differentiering potentiale. CPJ-afledte celler udviste en højere proliferationshastighed og selvfornyelse potentiale sammenlignet med UC og FP-afledte celler, hvilket gør dem en mere lovende kilde til celleterapi, regenerativ medicin, og vævsmanipulering.

Protocol

Prøver (n = 3) blev opnået fra samtykkende, raske donorer gennem Beaumont Hospital BioBank, Royal Oak, MI og Providence Hospital, Southfield, MI under HIC- (HIC # 2012-101) og IRB (IRB # 820662- 3) henholdsvis godkendte protokoller og forarbejdet som godkendt af IBC (# 2858) for Oakland University, Rochester, MI.

1. Forarbejdning Humant navlestrengen, Cord-placenta Junction, og føtalt Placenta og isolering af celler

  1. Aseptisk indsamle prøver af UC ca. 10 cm i længden, herunder 5 - 6 cm forbundet til CPJ og 3 - 4 cm fra FP. Anbring straks hver prøve i en samling bæger indeholdende medium (DMEM med 4.500 mg / mL glucose og antibiotisk opløsning (0,1% gentamicin, 0,2% streptomycin og 0,12% penicillin)) og opbevares ved 4 ° C, indtil det transporteres til laboratoriet ved placere den på is i en Styrofoam boks. Bearbejde prøven ved 4 ° C inden for 2 - 4 timer for indsamlingen.
  2. Prøven anbringes i en 150-mm petriskål blev vedis i en biosikkerhed kabinet. Anvendelse af en nål og sprøjte, skylles flere gange med iskold PBS til fjernelse af blodpropper. Sørg for, at prøven holdes våd med PBS under bearbejdning og ikke lade det tørre. At opretholde sterilitet, håndtere prøven aseptisk under anvendelse autoklaveret PBS og kirurgiske værktøjer på prøve behandling.
  3. Nøje undersøge prøven for at identificere forskellige anatomiske regioner: UC, CPJ, og FP. Først dissekere UC. Hold føtale ende af UC med pincet og omhyggeligt gøre det første snit lige i toppen af ​​CPJ ved hjælp af en saks. Gøre andet snit under CPJ at adskille CPJ (1,5-2,0 cm) fra FP. Placer adskilt UC, CPJ, og FP i særskilte petriskåle til videreforarbejdning.
  4. Skær UC på langs med hjælp af saks og pincet, helt udsætte blodkarrene og omgivende WJ uden at forstyrre epitel.
  5. Skrab WJ væk fra blodkar og indre epitel af subamnionved hjælp af en skalpel, og derefter fjerne blodkarrene. Vær sikker på at indsamle alle resterende perivaskulær WJ under og omkring blodkarrene, og placer det indsamlede WJ i en separat petriskål.
  6. Indsamle det resterende væv, ledning foring (CL), i en separat petriskål.
  7. Efter separation af væv, der repræsenterer CL, WJ, CPJ, og FP, erstatte PBS med 3 - 5 ml af kommerciel trypsinopløsning og separat skær hver af vævene i 1 til 2 mm stykker med en saks.
  8. Inkubér vævsstykker i kommerciel trypsin opløsning ved 37 ° C i 30 minutter i en 5% CO2 inkubator i delvis fordøjelse af prøverne. Observere delvis fordøjelse ved at visualisere frigivelse af celler under anvendelse af et fasekontrastmikroskop.
  9. Til de delvist fordøjede prøver, tilsættes et lige volumen dyrkningsmedium (CM; DMEM med 4.500 mg / mL glucose og 2 mM L-glutamin, suppleret med 10% humant serum / FBS og antibiotika-opløsning (0,1% gentamicin, 0,2% streptomycin og 0,12% penicillin)) for at neutralisere den kommercielle trypsin løsning. Overføre indholdet i 50-ml-centrifugerør og lad delvist fordøjede vævsstykker nøjes med 3 min.
  10. Aspirere omhyggeligt supernatanten, herunder enkelte celler (de ikke udvide effektivt), og pladen 15 - 20 delvist fordøjede vævsstykker på en 75-cm2 vævskulturkolbe og tilsæt 9 ml CM. Der inkuberes ved 37 ° C og ikke forstyrrer kulturkolberne for 2 - 3 dage for at give mulighed for vedhæftningen af ​​vævsstykker.
    BEMÆRK: Den resterende del af de delvist fordøjede vævsprøver kan være kryokonserveres for den fremtidige isolering af celler.
  11. Efter 3 dages inkubation ændre CM og se efter forekomsten af ​​udvækst af celler fra eksplantatet på daglig basis; cellevækst bør fremgå af de adhærerende eksplantater efter 3 - 4 dage, 7 - 10 dage, og 11 - 14 dage inkubation i CPJ, CL / WJ, og FP hhv. Fra dette tidspunkt, ændre CM efter hver 3 dage eller somhavde brug for.
    BEMÆRK: Cellevækst når 70% konfluens 7 - 10 dage efter den indledende celleudvækst fra eksplantatet. Bemærk, at ikke-klæbende væv stykker ikke vil give anledning til nogen celleudvækst indtil de klæber til plastik. skal sørges for, at flasken ikke forstyrres for at undgå udløsning af de adhærerende vævsstykker. Hvis der er nogen flydende stykker efter de første 3 dage af dyrkning, kunne de blive reddet ved at overføre dem til en ny kolbe til fastgørelse.
    BEMÆRK: Når cellevækst fra vævseksplantater når 70% konfluens, bør de subkultiveres. Som anført ovenfor, MSC'er fra CL / WJ, FP, CPJ og vil nå konfluens i 10 - 14 dage 14 - 20 dage, og 17 - 24 dage hhv.
  12. At videredyrke vokset celler fra eksplantaterne, dissociere cellerne ved hjælp af 1 - 2 ud ml kommerciel trypsinopløsning / 75-cm2 dyrkningskolbe og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter. Neutraliser med 1 - 2 ml af CM og centrifugeres 1.500 xg i 3 min. LaveSørg for at rotere kolben samtidig tilføjer trypsin for endnu breder sig i hele.
  13. BEMÆRK: pelleterede celler betragtes passage 0 (P0) og vil blive suspenderet i CM, talt og subkultiveret ved en podningsdensitet på 1 x 10 4 / cm2 til amplifikation, karakterisering og kryokonservering. De overskydende celler kan kryopræserveres ved P0.

2. Karakterisering af de isolerede celler

  1. Kolonidannende effektivitet (CFE) assay
    1. Coate 100 mm petriskåle (overfladeareal på 60 cm2) med 0,1% gelatine i 30 minutter og placere dem i CO2-inkubator ved 37 ° C.
      BEMÆRK: Skønt det ikke er nødvendigt, gelatine-coating forbedrer celleadhærens.
    2. Fjerne overskydende gelatine og pode overtrukne plade med P0 celler ved en koncentration på 1,63 celler / cm2. Tilsæt 3 ml CM og inkuberes i CO2-inkubator ved 37 ° C.
    3. Overvåge de podede plader til klonal vækstved lysmikroskopi (LM) og ændre medium hver 3 dage.
    4. Efter 10 - 14 dages cellevækst, vaske petriskåle to gange med PBS og fikseres cellerne i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Paraformaldehyd er giftigt. Venligst øve forsigtighed ved at bære handsker og briller under brug.
    5. Farv de fikserede celler med 0,1% krystalviolet i 1 time ved stuetemperatur og skylles pladen med postevand indtil det ubundne blåsplint er væk.
    6. Tæl antallet af kolonier bestående af mindst 50 celler under anvendelse af LM.
  2. Ekspression af celleoverflademarkører
    1. Kultur de isolerede celler til 70% sammenflydning, dissocierer med den kommercielle trypsin opløsning og vaske og pellet ved centrifugering ved 1500 xg i 3 min. Suspendere cellerne i FACS-buffer (1x PBS med 2% FBS og 0,1% natriumazid).
      BEMÆRK: Natriumazid er giftigt. Venligst øve forsigtighed ved at bære handsker og briller under brug.
      2. 6) med FITC- eller APC-mærkede MSC-specifikke antistoffer (FITC-konjugerede antistoffer mod: CD44 og CD90 eller APC-konjugerede antistoffer imod: CD29, CD73 og CD105) i FACS-buffer i 30 minutter ved 4 ° C i mørke.
    2. Centrifuger de farvede celler ved 670 xg i 5 min, aspireres supernatanten, og cellerne resuspenderes i 500 pi FACS buffer.
    3. Analyser de antistof-farvede celler under anvendelse af FACS ifølge fabrikantens protokol.

3. Differentiering Potentiel

  1. adipogenisk differentiering
    1. Kultur de isolerede celler til 70% sammenflydning, dissocierer med den kommercielle trypsin opløsning og vaske og pellet ved centrifugering ved 1500 xg i 3 min.
    2. I en CO2-inkubator ved 37 ° C, dyrke cellerne i en koncentration på 100.000 celler / brønd af en 6-brønds plade indeholdende 2 ml CM.
    3. Efter 24 timer, udskifte CM med adipogENIC differentieringsmedium (0,5 uM isobutyl-methylxanthin, 1 uM dexamethason, 10 pM insulin, og 200 uM indomethacin) og inkuber. Skift differentiering medium hver 3. dag eller så ofte som nødvendigt.
    4. Efter 3 ugers inkubation fikseres cellerne med 2 ml af 4% paraformaldehyd pr brønd i 30 min ved stuetemperatur og pletten med Oil Red O for at detektere produktionen af ​​lipiddråber for at analysere for adipogenisk differentiering.
      BEMÆRK: Paraformaldehyd er giftigt. Venligst øve forsigtighed ved at bære handsker og briller under brug.
    5. Behandle de fikserede celler med 60% isopropanol (2 ml / brønd af 6-brønds plade) i 5 minutter.
    6. Erstatte isopropanol med 2 ml af Oil Red O-farvning (filter 3 dele Oil Red O plet og 2 dele destilleret vand), inkuberes i 15-30 minutter ved stuetemperatur, og vask 3 - 4 gange med ledningsvand for at fjerne eventuelt ubundet plet .
    7. Visualisere de røde-farvede lipiddråber, indikerer adipogenisk cellelinie, usynge LM.
  2. chondrogen differentiering
    1. Kultur isolerede celler til 70% sammenflydning, dissocierer med den kommercielle trypsin opløsning og vask med PBS.
    2. At pelletere celler for chondrogen induktion, centrifuge 250.000 celler i et 15-ml centrifugerør med 2 ml CM ved 11.000 xg i 8 min. Inkuber pillerne natten over ved 37 ° C.
    3. Efter 24 timer forsigtigt erstatte CM med chondrogen differentiering medium (20 ng TGF-Ø1, 10 ng insulin, 100 nM dexamethason, og 100 uM ascorbinsyre) uden at forstyrre pelleten og fortsætte inkubationen. Skift differentiering medium hver 3. dag eller så ofte som nødvendigt.
    4. Efter 3 ugers inkubation fikseres cellerne med 2 ml af 4% paraformaldehyd pr brønd i 30 minutter ved stuetemperatur. Kryosektion og pletten med 1% toluidinblåt at undersøge tilstedeværelsen eller produktionen af ​​ekstracellulær matrix for at bestemme chondrogen differentiering.
      BEMÆRK: Paraformaldehyde er giftigt. Venligst øve forsigtighed ved at bære handsker og briller under brug.
    5. For Fremstilling af frysesnit, forsigtigt vaske de høstede cellepellets to gange med PBS og fastgøres med 1 ml 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Paraformaldehyd er giftigt. Venligst øve forsigtighed ved at bære handsker og øje slid under brug.
    6. Vask pellets to gange med PBS til fjernelse af paraformaldehyd og overføres til en saccharose / OLT-opløsning (1: 2, 20% Sucrose: OCT). Inkubere ved stuetemperatur i 24 timer for at lade opløsningen fuldstændigt sive ind cellepellets; dette vil give glat sektionering.
    7. Overfør pillerne ind i OLT forme. Frys formene ved -20 ° C i 4 - 6 timer og kryosektion cirka 10 - 12 micron tyk sektioner af cellepellets under anvendelse af en kryostat til toluidin-blåfarvning.
    8. Vask kryosektionerne forsigtigt med PBS; tilføje nogle få dråber 1% toluidinblåt plet, der dækker granulatstrengene sektioner på objektglasset fuldstændigt; og incUbate i 1 time ved stuetemperatur.
    9. Vask dias med PBS flere gange for at affarvning. Fjerne det overskydende pletten ved at dyppe slæden i HCl-baserede alkohol-opløsning (95% alkohol + 0,5 ml HCI) flere gange, indtil det ubundne blå farve er forsvundet. Montere de farvede snit under anvendelse af 100 pi af monteringsløsning til langsigtet opbevaring af objektglassene.
      BEMÆRK: blåfarvning af sektionerne indikerer tilstedeværelsen af ​​glycosaminoglycaner og glycoproteiner og vil være observerbar med LM.
  3. osteogen differentiering
    1. Igen kultur de isolerede celler til 70% sammenflydning, dissocierer med den kommercielle trypsin opløsning og vaske og pellet ved centrifugering ved 1500 xg i 3 min.
    2. Videredyrke cellerne ved en koncentration på 100.000 celler / brønd i plader med 6 brønde indeholdende 2 ml CM i en CO2-inkubator ved 37 ° C.
    3. Efter 24 timer, udskifte CM med osteogen differentiering medium (0,1 μM dexamethason, 10 pM β-glycerophosphat, og 50 uM ascorbat phosphat) og fortsætte inkubationen. Skift differentiering medium hver 3. dag eller så ofte som nødvendigt.
    4. Efter 3 ugers inkubation fikseres cellerne med 2 ml 4% paraformaldehyd pr brønd i 30 minutter ved stuetemperatur og pletten med alizarinrødt at detektere tilstedeværelsen af ​​en calcium deposition for at bestemme osteogen differentiering.
      BEMÆRK: Paraformaldehyd er giftigt. Venligst øve forsigtighed ved at bære handsker og briller under brug.
    5. Forsigtigt vaske de fikserede celler to gange med destilleret vand og behandles med 2% alizarin rød plet (2 ml / brønd i en 6-brønds plade) i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
    6. Fjern overskydende pletten ved forsigtigt at vaske med vand fra hanen, så kalkaflejringer ikke fjerne.
    7. Visualisere de røde-farvede kalkaflejringer ved hjælp LM.

4. Kvantitativ revers transkriptase Polymerase Chai reaktionsskema (QRT-PCR) Analyse

  1. Kultur de isolerede celler til 70% sammenflydning, dissocierer med den kommercielle trypsinopløsning, vask, og pellet ved centrifugering ved 1500 xg i 3 min for at isolere det totale cellulære RNA.
  2. Vask cellerne med PBS for at fjerne spor af FBS, og derefter gå videre til RNA-isolering under anvendelse af et kommercielt RNA-oprensningskit ifølge producentens anvisninger.
  3. Oprense det isolerede totalt RNA ved behandling med DNase ved 37 ° C i 30 minutter under anvendelse af en thermocycler. Syntetisere cDNA under anvendelse af kommercielt kit ifølge producentens instruktioner.
  4. Forberede tredobbelte 10-pi PCR-reaktioner i en plade med 96 brønde, med hver reaktion indeholdt 5 pi SYBR-green PCR Supermix; 3 pi dobbeltdestilleret vand; 0,5 pi af hver primer, fremad og tilbage; og 1 pi af den fortyndede (1:10) cDNA.
  5. Udføre PCR under følgende parametre: 10 min ved 98 ° C efterfulgt af 44 cykler af 30 sekunder hver ved 98 &# 176; C, 20 sekunder ved 60 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C.
  6. Normalisere amplifikation af målgener af referencepunkterne gener, GAPDH og β-actin-; primersekvenserne er anført i tabel 1.

5. Statistisk analyse

  1. Udfør alle analyser ved hjælp af statistisk software. Præsentere data som gennemsnittet ± SEM. Resultater med en p-værdi (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05) blev betragtet som statistisk signifikant.

Representative Results

Dissektion og isolering af celler fra human navlestrengen, Cord-placenta Junction, og føtalt Placenta

Perinatal væv består af tre diskrete anatomiske områder. Den første er UC, indeholdende to arterier og en vene, samt to særskilte zoner: CL (den ydre foring af ledningen) og WJ (den geleagtige materiale, som omgiver blodkarrene inde i ledningen). Den anden er CPJ (forbindelsen mellem ledningen og placenta), og den tredje er FP, som er umiddelbart efter CPJ (ledningen indsættes i placenta, som er fastgjort til livmodervæggen af ​​moderen). Den skematiske af isolation protokol af celler fra perinatal væv er afbildet i figur 1. De fire kilder-CL, WJ, CPJ, og FP-klart kan identificeres og adskilles for at isolere celler fra eksplantaterne, som vist i figur 2. Than udseende celleudvækst fra eksplantatkulturer blev rutinemæssigt overvåges og registreres af LM. Adhærente fibroblastoidceller iagttoges efter 3-4 dages dyrkning af CPJ eksplantater. Celler med lignende morfologi optrådte 7-8, 9-10, og 11-14 dage efter dyrkning af WJ, CL, og FP eksplantater hhv. Udvæksten af celler fra eksplantaterne repræsenterer de forskellige kilder (CL, WJ, CPJ, og FP) er afbildet i figur 3A. Disse celler blev betragtet som P0. Når P0 celler blev videredyrket, de syntes at vokse klonalt, viser en fibroblastoid morfologi ligner BM-MSC. Men de udviste variation i populationsfordoblingstid, der spænder fra 32 timer til 94 timer for celler fra CPJ og FP, som vist i figur 3B og C. Celler fra WJ og CL havde lignende fordoblingstider medialt til CPJ og FP. Yderligere analyse af P0 celler viste, at de også varieret i CFE, der spænder fra 16 til 92 kolonier.Celler fra CPJ havde den højeste (92), mens FP-celler havde den laveste (16) CFE. Celler fra CL og WJ havde CFE-værdier på 59 og 80 kolonier, henholdsvis (figur 4A-C). Cellerne fra CL havde CFE værdier svarende til BM-MSC'er. Disse resultater antyder, CPJ-afledte celler har højere proliferative og selvfornyelse kapaciteter.

Immunoprofile af de isolerede celler

Celler isoleret fra CL, WJ, CPJ, og FP blev undersøgt for ekspression af cellespecifikke markører. P3-5 celler udviste positiv ekspression for MSC'er markører, såsom CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105 (figur 5A og B). Disse celler er også kendt for at udtrykke major histocompatibility klasse I Marker, HLA-ABC, og udtrykker ikke klasse II markering, HLA-DR 3. Procentdelene af positive celler for these udvalgte markører fra alle fire kilder var svarende til den, der udtrykkes af standard BM-MSC'er. Imidlertid MFI-forhold indikerer, at WJ- og CPJ-afledte celler er næsten ens og er endnu højere end CL- og FP-afledte celler (figur 5C). Interessant nok til trods for varierende CFE værdier, alle celler fra forskellige kilder udtrykte tilsvarende niveauer af MSC markører. Baseret på resultaterne af celleoverflademarkører blev de isolerede celler fra alle fire kilder anses for MSC'er. Yderligere analyse af disse celler viste, at de også udtrykker pluripotensmarkører gener, OCT4, NANOG, KLF4 og SOX2, som vist i figur 5D. Den CPJ-MSC'er havde den højeste ekspression af pluripotensmarkør efterfulgt af WJ-, CL- og FP-MSC'er.

Differentiering potentiale isolerede MSC'er

Den gyldne standard for at karakterisere MSC er deres evne til at differentiate i flere slægter. Vores resultater viste, at isolerede MSC'er fra alle de perinatale kilder let differentieret i adipogeniske, chondrogene og osteogene celletyper. Adipogeniske derivater produceret lipiddråber der var positivt farvet med Oil Red O, som vist i figur 6A. Toluidinblåtfarvning af den chondrogene derivat af MSC'er viste tilstedeværelsen af proteoglycaner og glycoproteiner, der støttede i produktionen af ekstracellulær matrix (figur 6B). Osteogene derivater af MSC'er positivt farvede med alizarinrødt indikere tilstedeværelsen af kalkaflejringer involveret i knoglemineralisering, som vist i figur 6C.

Som forventet den transkriptionelle analyse af isolerede MSC'er fra alle kilder udviste trilineage differentiering (figur 6D -F). Dog pottenential differentiering varierede afhængigt af kilden af ​​MSC'er. Adipogeniske derivater af WJ-MSC'er havde 2 gange større ekspressionsniveauer for de udvalgte adipogeniske gener (CEBPβ, FABP4, og PPARy) sammenlignet med CPJ-MSC'er. CL- og FP-MSC havde den laveste udtryk for disse gener. I tilfælde af chondrogen differentiering, udtrykt CPJ-MSC-derivater valgt chondrogene gener (Sox9 og Col2) 50-fold højere end de WJ- og FP-MSC-derivater. Svarende til den dårlige adipogenisk differentiering af CL-MSC'er, de havde lavere chondrogene potentiale, som tydeligt ved den laveste ekspression af chondrogene gener. CPJ-MSC'er viste også den højeste osteogen differentiering potentiale, som angivet ved 2-fold højere transkriptniveauer af udvalgte osteogene gener (Col1, OPN og OCN). Men ekspressionen af ​​progenitor markør RUNX2 var, højest i osteogene derivater af WJ-MSC'er, hvilket indikerer, at disse celler var langsomme til at reagere på differentieringstilstande. Igen viste dårlig CL-MSCdifferentiering i osteogene afstamning. Disse resultater antyder, CPJ-MSC'er og WJ-MSC'er vises større differentiering potentiale end CL- og FP-MSC'er. CL-MSC havde den laveste potentiale til at differentiere til trilineage derivater.

figur 1
Figur 1: Skematisk af isolering af celler fra human navlestrengen, Cord-placenta Junction, og føtalt Placenta. Inspicere opsamlede prøve og fortsætte med dissektion. Trin 1. Manuel dissekere og adskille ledningen / placenta prøve i tre adskilte regioner: navlestreng (UC), snor-placenta motorvej (CPJ), og føtal placenta (FP). Adskille de to særskilte zoner af UC i ledningen foring (CL) og Whartons Jelly (WJ) under anvendelse af saks og pincet. Trin 2. Skær hver af de dissekerede væv separat ind 1- to 2-mm stykker med en saks og delvist fordøje stykkerne. Trin 3. Kultur vævet stykker. Trin 4. Isoler cellerne fra eksplantaterne ved trypsinbehandling. Subkultur og karakterisere de isolerede celler. Trin 5. Isolerede og karakteriseret celler kan opformeres og anvendes til forskellige anvendelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Dissektion og dyrkning af eksplantater fra human navlestrengen, Cord-placenta Junction, og føtalt Placenta. Vist er tre forskellige anatomiske områder i ledningen / placenta prøve: UC (split ind i CL og WJ), CPJ, og FP, samt den tilhørende arterier og vener. CL, WJ, CPJ,og FP blev separeret ved manuel dissektion for at isolere celler fra eksplantaterne. Hver af de dissekerede områder blev separat skåret i små fragmenter og dyrket i 75 cm2 plader ved anvendelse 9 ml CM. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3: Morfologi af isolerede celler fra human navlestrengen, Cord-placenta Junction, og føtalt Placenta. (A) Cell udvækst fra eksplantater af CL, WJ, CPJ, og FP, som visualiseret ved LM. (B) Subkultur af de isolerede celler fra CL, WJ, CPJ, og FP eksplantater viste fibroblastoid morfologi. Skalaen bjælke repræsenterer 100 um (forstørrelse: 4X). (C) Population fordoblingstid på tHan isolerede celler fra CL, WJ, CPJ, og FP. BM-MSC'er blev anvendt som en standard. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien af ​​de tredobbelte målinger (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4: kolonidannende effektivitet af Celler fra human navlestrengen, Cord-placenta Junction, og føtalt Placenta. (A) Vækst af cellerne (P0) isoleret fra CL, WJ, CPJ, og FP, udpladet ved en klonal densitet på 1,63 celler / cm2, blev visualiseret ved LM. (B) mikrofotografier af celler farvet med krystalviolet visning kolonidannende kapacitet. (C) Enkelt koloni af celler farvet with krystalviolet. Skalabjælkeme repræsenterer 100 um (forstørrelse: 4X). (D) Grafisk fremstilling af antallet af kolonier dannet ud fra celler afledt af CL, WJ, CPJ, og FP. BM-MSC'er blev anvendt som en standard. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien af ​​de tredobbelte målinger (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 5
Figur 5: Analyse af MSC markører udtrykt af cellerne isoleret fra humane navlestrengen, Cord-placenta Junction, og føtalt Placenta. (A) Ekspression af mesenchymale overflademarkører (CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105) af cellerne fra CL, WJ, CPJ, og FP, som afskrækkeudvindes ved flowcytometri. (B og C) Grafisk fremstilling af procentdelene af positive celler og den mediane fluorescensintensitet (MFI) -forhold for de valgte mesenchymal overflademarkører. MFI-forhold blev beregnet ved at dividere MFI på markøren (genereret af software baseret på fluorescensintensiteten af ​​gatede cellepopulationer) ved MFI på isotypen. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien af ​​de tredobbelte målinger. (D) Ekspression af pluripotensmarkører gener (OCT4, NANOG, KLF4, og Sox2) af cellerne fra CL, WJ, CPJ, og FP, som bestemt ved QRT-PCR. (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05). Genekspression blev normaliseret til GAPDH og β-actin og fejlen repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien af ​​de tredobbelte målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 6: multilineage Differentiering af MSC'er isoleret fra humane navlestrengen, Cord-placenta Junction, og føtalt Placenta. (A) Celler blev inkuberet i adipogenisk differentiering medium i 3 uger og farvet med Oil Red O, hvilket indikerer tilstedeværelsen af lipiddråber. (B) Cellepellets blev inkuberet i chondrogent differentiering medium i 3 uger. Histologiske snit af frosset pellet kulturer blev farvet med toluidinblåt, der viser tilstedeværelsen af ​​glycosaminoglycaner. (C) Celler blev inkuberet i osteogen differentiering medium i 3 uger og farvet med alizarinrødt, viser produktionen af kalkaflejringer tyder knoglemineralisering. Alle billeder blev opnået ved LM. Skalaen bjælke repræsenterer 100 um (forstørrelse: 4X). BM-MSC vire anvendt som standard. (DF) Ekspression af udvalgte gener (CEBPβ, FABP4 og PPARy, Sox9, AKAN, og Col2 og Col1, RUNX2, OPN og OCN repræsenterer differentieringen af MSC'er i adipogeniske, chondrogene og osteogene afstamninger henholdsvis), som bestemt ved QRT-PCR-analyse (** p ≤ 0,01 og * p ≤ 0,05). Genekspression blev normaliseret til GAPDH og β-actin og fejl repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien af ​​de tredobbelte målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Gene primer sekvenser Produkt Længde
OCT4 Fremadrettede CCCCTGGTGCCGTGAA 97
Revers-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </ Td>
NANOG fremadrettede AAAGAATCTTCACCTATGCC 110
reverse GAAGGAAGAGGAGAGACAGT
KLF4 fremadrettede CGAACCCACACAGGTGAGAA 94
reverse TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC
SOX2 fremadrettede TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA 75
reverse CTGGGGCTCAAACTTCTCTC
Sox9 fremadrettede AGCGAACGCACATCAAGAC 85
reverse CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
Col2 fremadrettede CTCGTGGCAGAGATGGAGAA 252
reverse CACCAGGTTCACCAGGATTG
EN DÅSE fremadrettede AGCCTGCGCTCCAATGACT 103
col1 fremadrettede AAGGTCATGCTGGTCTTGCT 114
reverse GACCCTGTTCACCTTTTCCA
RUNX2 fremadrettede TGCTTCATTCGCCTCACAAA 111
reverse AGTGACCTGCGGAGATTAAC
OPN fremadrettede CATACAAGGCCATCCCCGTT 112
reverse TGGGTTTCAGCACTCTGGTC
OCN fremadrettede TAAACAGTGCTGGAGGCTGG 191
reverse CTTGGACACAAAGGCTGCAC
CEBPβ fremadrettede TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 94
reverse AGCTTTCTGGTGTGACTCGG
FABP4 fremadrettede TTAGATGGGGGTGTCCTGGT 158
reverse GGTCAACGTCCCTTGGCTTA
PPARy fremadrettede GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74
reverse ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG
GAPDH fremadrettede ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG 101
reverse GCCATCACGCCACAGTTTC
actin fremadrettede AATCTGGCACCACACCTTCTAC 170
reverse ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC

Tabel 1: Liste over Menneskelige Primer sekvenser anvendt i denne undersøgelse.

Discussion

Nylige fremskridt i stamcelleforskning ikke kun forbedret forståelse af grundlæggende udviklingsprocesser, men også lovende muligheder for anvendelse af stamceller i bioteknologiske, farmaceutiske, celleterapi, regenerativ medicin, og vævskonstruktionsanvendelser 18, 19, 20. Mens pluripotente økonomiske og sociale råd isoleret fra tidlige embryoner er de mest lovende, de står over for tekniske udfordringer og etiske dilemmaer 21, 22, 23. Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) afledt fra voksne celler tilvejebringe en alternativ, men også de står over for lignende tekniske og sikkerhedsmæssige problemer 23. Endvidere kan iPSCs ikke være genetisk stabile eller kan have undergået genetiske ændringer, hvilket begrænser deres terapeutiske anvendelse. Stamceller er også blevet rapporteret i mange forskellige postnatal tisanlægger og organer. De mest almindelige kilder til disse ASC'er er knoglemarven, adipose, og muskelvæv. Imidlertid har ASC'er fra postnatale kilder begrænset vækst og differentiering potentiale 24, 25. De lider også på grund af ældning og eksponering for miljømæssige påvirkninger, og derfor er det ikke altid effektive til terapeutiske applikationer 26, 27, 28. Dette har ført os og andre til at søge efter nye kilder til stamceller, der er mere naive end ASCer.

Vi har undersøgt perinatale kilder til primitive stamceller som et alternativ til ASC'er. I denne rapport, giver vi en pålidelig, robust og enkel metode til at isolere humane MSC'er fra ledning / placenta prøver. I sammenligning med andre kilder og metoder til isolering af ASC'er, tilvejebringer denne fremgangsmåde en effektiv og ikke-invasiv fremgangsmåde til isolering af store mængder HIGh kvalitet MSC'er. Det yderligere accentuerer højere vækst og differentiering potentiale perinatale MSC'er sammenlignet med MSC'er fra voksne kilder såsom BM.

UC fastgørelse af fosteret til moderkagen er et stort orgel med distinkte anatomiske områder, herunder to arterier, en vene, CL, og WJ (væv, der omgiver blodkarrene). Adskillige undersøgelser har rapporteret isolering af MSC'er fra hele ledningen, WJ, eller placenta, med variabel vækst og differentiering potentialer 25, 29. Ikke desto mindre, til dato, ingen undersøgelse har effektivt undersøgt og sammenlignet de celler fra forskellige anatomiske områder i snor / moderkagen prøve. Vi leverer her en systematisk og simpel metode til dissektion af UC, CPJ, og tilsluttet FP til isolering af MSC. Vi viser også en omfattende og simpel protokol til at karakterisere og vurdere kvaliteten af ​​de isolerede celler ved at bestemme deres spredning capabilteter, såvel som deres selvfornyelse og differentiering potentialer. Denne metode er reproducerbar og giver en stor mængde af fineste kvalitet MSC'er.

Vi fandt, at den delvise fordøjelse af vævsstykker 1-2 mm i størrelse under anvendelse af en kommerciel trypsinopløsning reproducerbart gav celler fra eksplantaterne, hvorimod fuldstændig fordøjelse af væv i enkelte celler havde dårlige udbytter af isolerede celler. Men en undersøgelse rapporteret, at større vævseksplantater af UC ca. 10 mm i størrelse var optimal for celleisolering 30. Omvendt anden undersøgelse foreslog, at vævseksplantatet metode resulterede i en længere kultur cyklus og lavere udbytte af celler sammenlignet med enzymet fordøjelsesmetoden 31. I tidligere beretninger, behandling af ledningen væv med collagenase II og hyaluronidase, separat eller efter trypsin, er blevet udført for at isolere ledningen celler 32, 33 34. Ikke alene er der en stor variation i fordøjelse metoder ledningen væv før dyrkning, men også de isolerede celler syntes at være heterogen. Brug af skrappe enzymer i længere tidsperioder kan forringe cellemembranen, påvirker celleadhærens og proliferation. Resultaterne af denne metode viser, at delvist fordøjede perinatale vævseksplantater billede udvækst af celler uden at forårsage omfattende cellebeskadigelse, vedligeholdes levedygtighed og gav højere mængder af homogene populationer af MSC'er.

Mens protokollen for dissektion og isolering af celler fra eksplantaterne er ligetil, kan nogle af trinnene vise sig at være en udfordring. Først sikre eksplantat vedhæftning ved at lade deres fastgørelse til overfladen af ​​dyrkningskolben. Dette kan lettes ved anvendelse af en lille mængde medium, der dækker henholdsvis de vævsstykker for de første 2 timer af kultur, og derefter forsigtigt at tilsætte det resterende medium. Second, begrænse antallet af eksplantater til mindre end 15 per T75 kolbe. For lidt plads mellem stykkerne eller for mange styk pr kolbe er hæmmende for celleudgroning. Tredje, vævsstykker, der ikke klæber til overfladen af ​​dyrkningskolben efter 3 dages inkubation bør overføres til en ny kolbe i adhærens og dyrkning. Fjerde, vævsstykker dyrkes bør være fri for cellerester, som inhiberer binding. Femte, dyrkning af store stykker kræver mere medium og forbedrer ikke celleudvækst effektivitet. Endelig overvåge eksplantatkulturer nøje, navnlig efter fremkomsten af ​​celleudvækst, når cellerne hurtigt kan blive sammenflydende og differentiere afhængigt af vævskilde. Nogle få begrænsninger i teknikken indbefatter en manglende ekspertise i dissekering prøverne at adskille CL, WJ, CPJ, og FP; en lille prøvestørrelse, hvilket resulterer i lav WJ udbytte; og forsinkede forarbejdning-prøverne, der skal behandles inden 2-4 timer for indsamling til avoid et tab i celleindvinding.

Den gyldne standard for karakterisering af MSC'er er evnen til at klæbe til plast, danner fibroblastfænotype, og differentierer til flere slægter. Disse er også almindeligt anvendte kriterier til bestemmelse MSC'er som beskrevet af ISCT 35. I denne undersøgelse celler isoleret fra alle fire kilder adhærerede til plast og havde positivt udtryk for MSC-markører (CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105), men negative udtryk for den hæmatopoietiske markør CD45. Desuden udtrykte de humane leukocyt-antigen (HLA) klasse I, men var negative for HLA-klasse II. Sammenlignet med BM-MSC'er, WJ- og CPJ-afledte celler var højere. Disse resultater stemmer overens med de foregående rapporter i UC MSC'er 33, 36, 37, 38. Desuden viste vores resultater, CL-, WJ-, CPJ-, FP-MSC'er udtrykte tværnationalepotens gener, såsom OCT4, NANOG, og SOX2; Men deres udtryk var lavere end for økonomiske og sociale råd, som tidligere 39 rapporteret. Disse resultater var også i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, som rapporterede ekspressionen af pluripotensmarkør i perinatale afledte celler 40. Interessant nok blev det observeret, at ekspressionen af ​​pluripotente markør var højere i CPJ-MSC'er end i celler isoleret fra andre kilder. Det blev også bemærket, at UC-MSC'erne udstillet større selvfornyelse potentiale end BM-MSC 41. Interessant nok til trods for ligheden i fænotypiske karakteristika, de celler isoleret fra de fire kilder havde variable CFE-værdier. Men bortset fra FP-MSC, de alle havde bedre CFE værdier end BM-MSC. CPJ-MSC havde den højeste CFE værdi og hastigheden af ​​spredning i forhold til alle andre MSC. Desuden WJ- og CPJ-MSC'er viste højere differentieringsfaktorer potentialer end BM-MSC'er. CL-MSC'er udviste den mindste differentieringpotentiale i alle tre slægter (dvs. adipogeniske, chondrogene og osteogene), hvorimod CPJ-MSC havde den højeste trilineage differentiering potentiale og FP-MSC viste den mindste adipogenisk differentiering potentiale.

Afslutningsvis viste vores resultater, at kvaliteten og kvantiteten af ​​isolerede MSC afveg mellem de fire kilder i ledningen / moderkagen prøve. CPJ-MSC havde mere spredning kapacitet og større selvfornyelse potentiale. De var også potente i deres differentiering i trilineage celletyper. Grund af deres lave fordoblingstid kunne CPJ-MSC'er være hurtigt udvidet 1000 gange og anvendes til high-throughput lægemiddel eller biomateriale screening. Disse celler kunne være en mere lovende kilde til celleterapi og regenerativ medicin applikationer.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev støttet af OU-WB ISCRM, Oakland University og Michigan hoved og Spine Institute. N. Beeravolu og C. McKee modtaget Provost Graduate Research Award fra Oakland University. Vi sætter pris på S. Bakshi for revision af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM with 4,500 mg/mL glucose Invitrogen 11995065
FBS Aleken Biologicals FBSS500
Isobutyl-methylxanthine Sigma I5879-250mg
Dexamethasone Sigma D4902-100mg
Insulin Prospec CYT-270
Indomethacin Sigma I7378-5G
TGFβ1 Prospec CYT-716
Ascorbic acid Sigma A-7631
Ascorbate 2-phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate Sigma G-6251
TrypLE Invitrogen 50591419
GeneJET RNA purification kit Thermo Scientific K0732
DNase Promega M6101
iScript kit Biorad 1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit Biorad 1725274
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943
OCT Thermo Scientific SH75-125D
Oil Red O  American MasterTech Scientific STORO100
Toluidine blue Thermo Scientific S71363
Crystal violet Sigma C3886
Alizarin red stain Thermo Scientific S25131
APC Mouse anti-Human CD29 BD Biosciences  559883
APC Mouse anti-Human CD34 BD Biosciences  555824
FITC Mouse anti-Human CD44 BD Biosciences  555478
FITC Mouse anti-Human CD45 BD Biosciences  555482
APC Mouse anti-Human CD73 BD Biosciences  560847
FITC Mouse anti-Human CD90 BD Biosciences  561969
APC Mouse anti-Human CD105 BD Biosciences  562408
Centrifuge IEC 93522M-2
CO2 incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i
Light microscope (LM) Nikon Instruments Inc. Olympus
Hemacytometer Thermo Scientific 0267151B
Cryostat Leica CM3050 S
FACS Canto II and Diva Software BD Biosciences  Canto II 
Thermocycler MJ Research Inc. PTC-100
Real-Time PCR System  Bio-Rad CFX96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upadhyay, R. K. Role of regeneration in tissue repairing and therapies. J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1 (2015).
  2. English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).
  3. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. Biomed Res Int. 2014, 436029 (2014).
  4. Hocking, A. M. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds. Adv Wound Care. 1 (4), New Rochelle. 166-171 (2012).
  5. Anthony, D. F., Shiels, P. G. Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs. Transplant Res. 2 (1), 10 (2013).
  6. Teschendorff, A. E., et al. Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation. Genome Med. 4 (3), 24 (2012).
  7. Liu, L., et al. Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).
  8. Bentivegna, A., et al. DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability. Stem Cells Int. 2013, 192425 (2013).
  9. Bieback, K., Brinkmann, I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).
  10. Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res Ther. 6, 215 (2015).
  11. Kim, D. W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  12. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).
  13. Díaz-Prado, S., et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells. Differentiation. 1, 162-171 (2011).
  14. Puissant, B., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).
  15. Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013, 246134 (2013).
  16. Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives. Pediatr Res. 71 (4), Pt 2 482-490 (2012).
  17. Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  18. Law, S., Chaudhuri, S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).
  19. Brower, J., et al. Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds. Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).
  20. Angelos, M. G., Kaufman, D. S. Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine. Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).
  21. Pera, M. F. Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine. Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).
  22. Espinoza, N., Peterson, M. How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too). J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).
  23. Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. Inducing iPSCs to escape the dish. Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).
  24. Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
  25. Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).
  26. Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).
  27. Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms. Ageing Res Rev. 23, Pt A 29-36 (2015).
  28. Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer. Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).
  29. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  30. Trivanovic, D., et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly. Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).
  31. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).
  32. Steigman, S. A., Fauza, D. O. Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Chapter 1 (2007).
  33. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013, (2013).
  34. Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview. J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).
  35. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  36. Weiss, M. L., et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).
  37. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  38. Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases. Stem Cells Int. 2011, 212487 (2011).
  39. Beeravolu, N., et al. Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord. Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).
  40. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).
  41. Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).

Tags

Developmental Biology perinatal navlestreng Cord-placenta junction placenta Mesenchymal stromale celler MSC markører Multipotente celler Pluripotente markører
Isolering og karakterisering af Mesenchymale stromacellers fra human navlestrengen og føtalt Placenta
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri,… More

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri, A., Mikhael, S., Brown, C., Perez-Cruet, M., Chaudhry, G. R. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. J. Vis. Exp. (122), e55224, doi:10.3791/55224 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter