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Developmental Biology

मानव गर्भनाल और भ्रूण प्लेसेंटा से अलगाव और Mesenchymal Stromal कोशिकाओं की विशेषता

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55224
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 2,4, 1,2
1Department of Biological Sciences, Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology, St. John Provindence - Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery, Beaumont Health System

Summary

यहाँ, हम मानव गर्भनाल (यूसी) और हड्डी में भ्रूण नाल नमूना अस्तर (सीएल) अलगाव के लिए, व्हार्टन जेली (WJ), रस्सी-नाल जंक्शन (CPJ), और भ्रूण नाल (एफपी) के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और मेसेंकाईमल stromal कोशिकाओं (MSCs) explant संस्कृति तकनीक का उपयोग कर के लक्षण वर्णन।

Abstract

मानव गर्भनाल (UC) और प्लेसेंटा मेसेंकाईमल stromal कोशिकाओं (MSCs) कि तेजी से ध्यान प्राप्त की है क्योंकि वे किसी भी नैतिक या नैतिक चिंताओं पैदा नहीं करते की, गैर इनवेसिव आदिम और प्रचुर मात्रा में स्रोत हैं। मौजूदा तरीकों यूसी से MSCs अलग करने के लिए चर प्रसार क्षमता के साथ कोशिकाओं की कम मात्रा उपज। चूंकि यूसी एक संरचनात्मक रूप से-जटिल अंग है, एमएससी के गुणों के अंतर उनके अलगाव की संरचनात्मक क्षेत्रों में अंतर के कारण हो सकता है। यूसी, रस्सी-नाल जंक्शन (CPJ), और भ्रूण नाल (एफपी): इस अध्ययन में, हम पहले तीन असतत संरचनात्मक क्षेत्रों में की हड्डी / नाल नमूने विच्छेदित। दूसरा, दो अलग-अलग क्षेत्रों, कॉर्ड अस्तर (सीएल) और व्हार्टन जेली (WJ), अलग हो गए थे। explant संस्कृति तकनीक फिर चार स्रोतों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया। समय explants से कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति के लिए आवश्यक ऊतक के स्रोत के आधार पर अलग-अलग। 4 दा - कोशिकाओं के परिणाम के भीतर 3 हुईCPJ explants के वाईएस, जबकि विकास 7 के बाद मनाया गया - 10 दिन और 11 - सीएल / WJ और एफपी explants से 14 दिनों में क्रमश:। पृथक कोशिकाओं प्लास्टिक के पक्षपाती थे और इसी तरह अस्थि मज्जा (बीएम) व्युत्पन्न MSCs के लिए, इस तरह के CD29, CD44, CD73, CD90, और CD105 के रूप में fibroblastoid आकृति विज्ञान और सतह मार्करों, का प्रदर्शन किया। हालांकि, कोशिकाओं विविध की कॉलोनी बनाने दक्षता, CPJ-MSCs और WJ-MSCs साथ बी.एम.-MSCs की तुलना में अधिक दक्षता को दर्शाता है। सभी चार स्रोतों से MSCs adipogenic, chondrogenic, और osteogenic प्रजातियों में विभक्त होता, यह दर्शाता है कि वे multipotent थे। CPJ-MSCs अन्य एमएससी स्रोतों की तुलना में और अधिक कुशलता से अलग करता है। इन परिणामों का सुझाव है कि CPJ सबसे शक्तिशाली संरचनात्मक क्षेत्र है और कोशिकाओं के एक उच्च संख्या, इन विट्रो में अधिक से अधिक प्रसार और आत्म नवीकरण क्षमता के साथ अर्जित करता है। अंत में, चार स्रोतों से MSCs का तुलनात्मक विश्लेषण संकेत दिया कि CPJ सेल थेरेपी, regenerativ के लिए MSCs का एक और अधिक आशाजनक स्रोत हैई चिकित्सा, और ऊतक इंजीनियरिंग।

Introduction

स्टेम सेल विभिन्न अंगों और शरीर के ऊतकों में मौजूद हैं। वे पुनर्योजी क्षमता के अधिकारी और मानव जीवन 1, 2 की अवधि के दौरान शरीर में क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। इस वयस्क स्टेम सेल (ASCs), में ब्याज की एक महान सौदा विशेष रूप से के बाद से उत्पन्न किया है, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) के विपरीत, ASCs के उपयोग के नैतिक और नैतिक दुविधाओं पैदा नहीं करता है। कई अध्ययनों से इस तरह के मेसेंकाईमल stromal कोशिकाओं (MSCs) के रूप में ASCs, के अलगाव की सूचना दी है; hematopoietic स्टेम सेल (HSCs); और विभिन्न वयस्क अस्थि मज्जा (बीएम) वसा ऊतकों (एटी) और दंत लुगदी 3, 4, 5 से लेकर स्रोतों सहित विभिन्न पूर्वज,। हालांकि, वर्तमान ASCs की संख्या में वयस्क आलों के सबसे सीमित है, और उनके अलगाव आम तौर पर संभव दाता के साथ एक आक्रामक और दर्दनाक प्रक्रिया शामिल हैसाइट रुग्णता। इसके अलावा, दाता उम्र और पर्यावरण के तनाव भी गुणवत्ता और पृथक कोशिकाओं 6, 7, 8 की जैविक गतिविधि का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। ASCs भी इन विट्रो में संस्कृति के दौरान सीमित प्रसार और भेदभाव संभावित प्रदर्शित करते हैं।

वर्तमान ASCs की इन कमियों को दूर करने के लिए नए स्रोतों स्टेम कोशिकाओं को अलग करने का पीछा किया गया है। इन प्रयासों के गर्भनाल रक्त, गर्भनाल ऊतक, नाल, और एमनियोटिक द्रव 9 सहित प्रसवकालीन स्रोतों से स्टेम सेल के अलगाव के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। इन स्रोतों क्योंकि उनके आसान और प्रचुर मात्रा में उपलब्धता 10, 11, 12, 13 का ध्यान प्राप्त की है। उन लोगों से व्युत्पन्न इसके अलावा, प्रसवकालीन ऊतकों गैर invasively प्राप्त किया जा सकता है, और स्टेम कोशिकाओं रहे हैंवयस्क स्रोतों 14, 15 से अलग ASCs की तुलना में अधिक आदिम। वे जन्म के समय प्राप्त ऊतकों से अलग हैं और उम्र बढ़ने और पर्यावरण तनाव की वजह से 16 जीनोम में कम से कम परिवर्तन आया है माना जाता है।

हालांकि, प्रसवकालीन स्रोतों से स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं और करने के लिए अपनी क्षमता स्वयं को नवीनीकृत करने के साथ ही अंतर करने के लिए व्यापक रूप से 11 में भिन्नता है, 17। यह तथ्य यह है कि मानव गर्भनाल (यूसी) एक जटिल अंग है की वजह से भाग में हो सकता है। हम परिकल्पना है कि प्रसवकालीन ऊतक के असतत क्षेत्रों विविधताओं और गैर प्रसवकालीन स्रोतों से प्राप्त ASCs की तुलना में इन स्टेम कोशिकाओं की अधिक आदिम प्रकृति के लिए जिम्मेदार, विशिष्ट चीजों पैदा करते हैं। यूसी, रस्सी-नाल जंक्शन (CPJ), एक: इस अध्ययन तीन असतत संरचनात्मक क्षेत्रों में की हड्डी / नाल नमूनों की विच्छेदन का वर्णन करता हैघ भ्रूण नाल (एफपी)। यूसी और दो क्षेत्रों में विच्छेदित किया गया था: कॉर्ड अस्तर (सीएल) और व्हार्टन जेली (WJ)। सीएल, WJ, CPJ, और एफपी से अलग कोशिकाओं के विश्लेषण का प्रदर्शन किया है कि वे सभी fibroblastoid आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया और एमएससी मार्करों व्यक्त की, लेकिन वे अपने आत्म नवीकरण और भेदभाव क्षमता में मतभेद था। UC- और एफपी व्युत्पन्न कोशिकाओं की तुलना में, उनमें सेल थेरेपी, पुनर्योजी चिकित्सा, और ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक अधिक आशाजनक स्रोत बना CPJ-व्युत्पन्न कोशिकाओं प्रसार और आत्म नवीकरण क्षमता का एक उच्च दर का प्रदर्शन किया।

Protocol

नमूने (एन = 3) सहमति के से प्राप्त किया गया, Beaumont अस्पताल BioBank, रॉयल ओक, एमआई और प्रोविडेंस अस्पताल, Southfield, के माध्यम से स्वस्थ दाताओं एमआई HIC- (HIC # 2012-101) और IRB- (तहत आईआरबी # 820662- 3), क्रमशः, प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी और रूप से आईबीसी (# 2858) ओकलैंड विश्वविद्यालय, रोचेस्टर, एमआई की मंजूरी दे दी संसाधित।

1. प्रसंस्करण मानव गर्भनाल, गर्भनाल-नाल जंक्शन, और भ्रूण नाल और अलग प्रकोष्ठों

  1. CPJ से जुड़े 6 सेमी और 3 - - एफपी के 4 सेमी Aseptically लंबाई में लगभग 10 सेमी, 5 सहित यूसी के नमूने एकत्र। इसके तत्काल बाद एक संग्रह कप युक्त मध्यम में प्रत्येक नमूने जगह (DMEM 4,500 मिलीग्राम / एमएल ग्लूकोज और एंटीबायोटिक समाधान (0.1% जेंटामाइसिन, 0.2% स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.12% पेनिसिलिन) के साथ) 4 डिग्री सेल्सियस पर और दुकान यह प्रयोगशाला में से भेजा जाता है जब तक एक स्टायरोफोम बॉक्स में बर्फ पर रखकर। संग्रह के 4 घंटे - 2 के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना प्रक्रिया।
  2. एक 150 म पेट्रि डिश में नमूना जगह पर रखाएक बायोसेफ्टी कैबिनेट में बर्फ। एक सुई और सिरिंज का उपयोग करना, यह बहुत ठंडा पीबीएस के साथ कई बार कुल्ला रक्त के थक्के को हटाने के लिए। सुनिश्चित करें कि नमूना प्रसंस्करण के दौरान पीबीएस के साथ गीला रखा जाता है और न दें यह सूखी बनाओ। बाँझपन बनाए रखने के लिए नमूना प्रसंस्करण भर autoclaved पीबीएस और शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग नमूना aseptically संभाल।
  3. ध्यान से विभिन्न संरचनात्मक क्षेत्रों की पहचान करने के लिए नमूना जांच: यूसी, CPJ, और एफपी। सबसे पहले यूसी काटना। संदंश के साथ यूसी की भ्रूण अंत पकड़ो और ध्यान से सिर्फ एक कैंची का उपयोग कर CPJ के शीर्ष पर पहली कटौती कर सकते हैं। एफपी से - (2.0 सेमी 1.5) CPJ अलग करने के लिए CPJ नीचे दूसरी कटौती करें। अलग यूसी, CPJ, और एफपी आगे की प्रक्रिया के लिए अलग-अलग पेट्री डिश में रखें।
  4. कैंची और संदंश की मदद से अनुदैर्ध्य यूसी कट, पूरी तरह से रक्त वाहिकाओं को उजागर और उपकला को परेशान किए बिना WJ आसपास।
  5. WJ रक्त वाहिकाओं और subamnion के भीतर उपकला से दूर खुरचएक छुरी का उपयोग कर, और फिर रक्त वाहिकाओं को हटा दें। के तहत और रक्त वाहिकाओं के आसपास किसी भी शेष परिवाहकीय WJ एकत्रित करते हैं, और एक अलग पेट्री डिश में एकत्र WJ जगह सुनिश्चित करें।
  6. शेष ऊतक, गर्भनाल अस्तर (सीएल), एक अलग पेट्री डिश में एकत्र करें।
  7. ऊतकों सीएल, WJ, CPJ, और एफपी का प्रतिनिधित्व करने के अलगाव के बाद, 3 के साथ पीबीएस की जगह - वाणिज्यिक ट्रिप्सिन समाधान के 5 एमएल और अलग से कैंची का उपयोग कर 2-मिमी टुकड़े करने के लिए 1- में ऊतकों के प्रत्येक काटा।
  8. नमूनों की आंशिक पाचन के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर वाणिज्यिक ट्रिप्सिन समाधान में ऊतक टुकड़े सेते हैं। एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की रिहाई visualizing द्वारा आंशिक पाचन का निरीक्षण करें।
  9. 4,500 मिलीग्राम / एमएल ग्लूकोज और 2 मिमी एल glutamine, 10% मानव सीरम / एफबीएस और एंटीबायोटिक समाधान (0.1% जेंटामाइसिन, 0.2% स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक के साथ DMEM; आंशिक रूप से पच नमूने के लिए, संस्कृति मध्यम (मुख्यमंत्री की एक समान मात्रा जोड़ने , और 0.12% पीenicillin)) वाणिज्यिक ट्रिप्सिन समाधान बेअसर करने के लिए। 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सामग्री स्थानांतरण और आंशिक रूप से पचा ऊतक टुकड़े 3 मिनट के लिए समझौता करते हैं।
  10. ध्यान से एकल कोशिकाओं (वे कुशलता से विस्तार नहीं है) सहित सतह पर तैरनेवाला, aspirate, और 15 प्लेट - 75 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क पर 20 आंशिक रूप से पचा ऊतक टुकड़े और मुख्यमंत्री के 9 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 2 के लिए संस्कृति बोतल परेशान मत करो - 3 दिन ऊतक टुकड़े की पालन के लिए अनुमति देने के लिए।
    नोट: आंशिक रूप से पचा ऊतक के नमूने के शेष भाग की कोशिकाओं के भविष्य अलगाव के लिए cryopreserved हो सकता है।
  11. ऊष्मायन के 3 दिन बाद, मुख्यमंत्री बदल सकते हैं और एक दैनिक आधार पर explant से कोशिकाओं के परिणाम की उपस्थिति के लिए देखो; 4 दिन, 7 - - 10 दिन, और 11 - CPJ, सीएल / WJ, और एफपी, क्रमशः के लिए ऊष्मायन के 14 दिनों कोशिकाओं की वृद्धि 3 के बाद पक्षपाती explants से स्पष्ट होना चाहिए। बाद इस बिंदु से, हर 3 दिन के बाद या के रूप में मुख्यमंत्री बदलनेजरूरत है।
    नोट: - 10 दिन explant से प्रारंभिक सेल परिणाम के बाद सेल विकास 7 70% संगम तक पहुँचता है। ध्यान दें कि गैर पक्षपाती ऊतक टुकड़े किसी भी सेल परिणाम को जन्म जब तक वे प्लास्टिक का पालन नहीं दे देंगे। ताकि कुप्पी आदेश पक्षपाती ऊतक टुकड़े की टुकड़ी से बचने के लिए परेशान नहीं है ध्यान रखा जाना चाहिए। अगर वहाँ संवर्धन के पहले 3 दिनों के बाद किसी भी चल टुकड़े हैं, वे लगाव के लिए एक नई कुप्पी के लिए उन्हें स्थानांतरित करने से बचाया जा सकता है।
    नोट: ऊतक explants से कोशिकाओं की वृद्धि 70% संगम तक पहुँच जाता है, वे subcultured किया जाना चाहिए। 14 दिनों के, 14 - - 20 दिन, और 17 - 24 दिन क्रमश: जैसा कि ऊपर कहा, सीएल / WJ, एफपी, CPJ से MSCs और संगम 10 में पहुंच जाएगा।
  12. Explants से पार कोशिकाओं उपसंस्कृति करने के लिए, 1 का उपयोग करके कोशिकाओं अलग कर देना - वाणिज्यिक ट्रिप्सिन समाधान / 75 सेमी 2 संस्कृति कुप्पी की 2 एमएल और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। मुख्यमंत्री के 2 एमएल और अपकेंद्रित्र 3 मिनट के लिए 1500 XG पर - 1 के साथ बेअसर। बनानाजबकि भी भर के प्रसार के लिए ट्रिप्सिन जोड़ने कुप्पी बारी बारी से करने के लिए सुनिश्चित।
  13. नोट: pelleted कोशिकाओं बीतने 0 (P0) माना जाता है और मुख्यमंत्री में निलंबित कर दिया जाएगा गिना, और के लिए प्रवर्धन, लक्षण, और क्रायोप्रिजर्वेशन 1 एक्स 10 4/2 सेमी की बोने घनत्व पर subcultured। अतिरिक्त कोशिकाओं P0 पर cryopreserved जा सकता है।

2. पृथक सेल निस्र्पक

  1. कॉलोनी के गठन दक्षता (CFE) परख
    1. कोट 37 डिग्री सेल्सियस से कम 100-म पेट्रि डिश 30 मिनट के लिए 0.1% जिलेटिन के साथ (60 सेमी 2 की सतह क्षेत्र) और उन्हें जगह सीओ 2 इनक्यूबेटर में।
      ध्यान दें: हालांकि जरूरी नहीं, जिलेटिन कोटिंग सेल पालन में सुधार।
    2. अतिरिक्त जिलेटिन निकालें और 1.63 कोशिकाओं / 2 सेमी की एकाग्रता पर P0 कोशिकाओं के साथ लेपित प्लेट बीज। 3 एमएल मुख्यमंत्री के जोड़े और 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं।
    3. क्लोनल विकास के लिए वरीयता प्राप्त प्लेटों पर नज़र रखेंप्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) और से हर 3 दिन मध्यम बदल जाते हैं।
    4. 10 के बाद - कोशिकाओं की वृद्धि के 14 दिनों के, पेट्री डिश में दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं 4% paraformaldehyde में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए धोने और ठीक।
      नोट: Paraformaldehyde विषैला होता है। कृपया उपयोग के दौरान दस्ताने और चश्मा पहन कर सावधानी अभ्यास करते हैं।
    5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.1% क्रिस्टल बैंगनी के साथ तय हो गई कोशिकाओं दाग और नल के पानी के साथ थाली कुल्ला जब तक अबाध नीला दाग चला गया है।
    6. एल एम का उपयोग कर कम से कम 50 कोशिकाओं के शामिल कालोनियों की संख्या गिनें।
  2. कोशिका की सतह मार्करों की अभिव्यक्ति
    1. संस्कृति 70% संगम को पृथक कोशिकाओं, वाणिज्यिक ट्रिप्सिन समाधान के साथ अलग कर देना, और 3 मिनट के लिए 1500 XG पर centrifugation द्वारा धो लें और गोली। (2% एफबीएस और 0.1% सोडियम azide साथ 1x पीबीएस) FACS बफर में कोशिकाओं को निलंबित करें।
      ध्यान दें: सोडियम azide विषैला होता है। कृपया उपयोग के दौरान दस्ताने और चश्मा पहन कर सावधानी अभ्यास करते हैं।
      2. 6) दाग अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. , 5 मिनट के लिए 670 XG पर दाग कोशिकाओं अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला aspirate, और FACS बफर के 500 μL में कोशिकाओं resuspend।
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार FACS का उपयोग एंटीबॉडी से सना हुआ कोशिकाओं का विश्लेषण करें।

3. विभेदन क्षमता

  1. Adipogenic भेदभाव
    1. संस्कृति 70% संगम को पृथक कोशिकाओं, वाणिज्यिक ट्रिप्सिन समाधान के साथ अलग कर देना, और 3 मिनट के लिए 1500 XG पर centrifugation द्वारा धो लें और गोली।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में, संस्कृति 100,000 सेल की एकाग्रता पर कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से थाली मुख्यमंत्री के 2 एमएल युक्त।
    3. 24 घंटे के बाद, adipog साथ मुख्यमंत्री की जगहenic भेदभाव मध्यम (0.5 सुक्ष्ममापी isobutyl-methylxanthine, 1 माइक्रोन डेक्सामेथासोन, 10 माइक्रोन इंसुलिन, और 200 सुक्ष्ममापी इंडोमिथैसिन) और सेते हैं। भेदभाव मध्यम बदले हर 3 दिन या जितनी बार की जरूरत है।
    4. ऊष्मायन के 3 सप्ताह के बाद, आदेश adipogenic भेदभाव के लिए विश्लेषण करने के लिए में लिपिड बूंदों के उत्पादन का पता लगाने के कमरे के तापमान और तेल लाल हे के साथ दाग पर 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति 4% paraformaldehyde के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को ठीक।
      नोट: Paraformaldehyde विषैला होता है। कृपया उपयोग के दौरान दस्ताने और चश्मा पहन कर सावधानी अभ्यास करते हैं।
    5. 5 मिनट के लिए 60% isopropanol (2 एमएल / 6-अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से) के साथ तय हो गई कोशिकाओं उपचार करें।
    6. तेल लाल हे दाग के 2 एमएल (फिल्टर 3 भागों तेल लाल हे दाग और 2 भागों आसुत जल) के साथ isopropanol बदलें, कमरे के तापमान पर 15-30 मिनट के लिए सेते हैं, और 3 धोने - किसी भी अबाध दाग दूर करने के लिए नल के पानी के साथ 4 बार ।
    7. लाल से सना हुआ लिपिड बूंदों, adipogenic सेल वंश का संकेत कल्पना यूएल एम गाते हैं।
  2. Chondrogenic भेदभाव
    1. 70% संगम को संस्कृति पृथक कोशिकाओं, वाणिज्यिक ट्रिप्सिन समाधान के साथ अलग कर देना, और पीबीएस के साथ धोएं।
    2. 8 मिनट के लिए 11,000 XG पर chondrogenic प्रेरण, अपकेंद्रित्र मुख्यमंत्री के 2 एमएल के साथ एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 250,000 कोशिकाओं के लिए गोली कोशिकाओं के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में छर्रों सेते हैं।
    3. 24 घंटे के बाद, धीरे गोली को परेशान किए बिना chondrogenic भेदभाव मध्यम (20 एनजी TGFβ1, 10 एनजी इंसुलिन, 100 एनएम डेक्सामेथासोन, और 100 माइक्रोन एस्कॉर्बिक एसिड) के साथ मुख्यमंत्री की जगह और ऊष्मायन जारी है। भेदभाव मध्यम बदले हर 3 दिन या जितनी बार की जरूरत है।
    4. ऊष्मायन के 3 सप्ताह के बाद, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति 4% paraformaldehyde के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को ठीक। Cryosection और 1% toluidine नीले रंग के साथ दाग आदेश chondrogenic भेदभाव निर्धारित करने के लिए उपस्थिति या बाह्य मैट्रिक्स के उत्पादन की जांच।
      नोट: Paraformaldehyde विषैला होता है। कृपया उपयोग के दौरान दस्ताने और चश्मा पहन कर सावधानी अभ्यास करते हैं।
    5. cryosectioning के लिए, धीरे काटा सेल छर्रों दो बार पीबीएस के साथ धोने और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के 1 एमएल के साथ ठीक।
      नोट: Paraformaldehyde विषैला होता है। कृपया उपयोग के दौरान दस्ताने और आंख पहनने पहन कर सावधानी अभ्यास करते हैं।
    6. paraformaldehyde को हटाने और एक सुक्रोज / अक्टूबर समाधान में स्थानांतरण करने के लिए पीबीएस के साथ दो बार छर्रों धो (1: 2, 20% सुक्रोज: OCT)। 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते समाधान पूरी तरह से सेल छर्रों में सीप के लिए अनुमति देने के लिए; इस चिकनी सेक्शनिंग की अनुमति देगा।
    7. अक्टूबर सांचों में छर्रों स्थानांतरित करें। 6 घंटे और cryosection के बारे में 10 - - 12 माइक्रोन मोटी toluidine नीले धुंधला के लिए एक cryostat का उपयोग सेल छर्रों के वर्गों 4 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नए नए साँचे फ्रीज।
    8. पीबीएस के साथ धीरे cryosections धो; 1% toluidine नीला दाग की कुछ बूँदें, स्लाइड पूरी तरह से पर गोली वर्गों को कवर जोड़ने; और इंककमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए यूबेट।
    9. destain को पीबीएस कई बार साथ स्लाइड धो लें। एचसीएल आधारित शराब समाधान (95% शराब + एचसीएल के 0.5 एमएल) कई बार अनबाउंड नीले रंग चला गया है जब तक में स्लाइड डुबकी द्वारा अतिरिक्त दाग निकालें। स्लाइड की लंबी अवधि के संरक्षण के लिए समाधान बढ़ते के 100 μL का उपयोग कर दाग वर्गों माउंट करें।
      ध्यान दें: वर्गों के नीले धुंधला ग्लाइकोसअमिनोग्लाइकन्स और ग्लाइकोप्रोटीन की उपस्थिति का संकेत और एल एम का उपयोग कर नमूदार हो जाएगा।
  3. osteogenic भेदभाव
    1. फिर, संस्कृति 70% संगम को पृथक कोशिकाओं, वाणिज्यिक ट्रिप्सिन समाधान के साथ अलग कर देना, और 3 मिनट के लिए 1500 XG पर centrifugation द्वारा धो लें और गोली।
    2. 100,000 सेल की एकाग्रता / की अच्छी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में मुख्यमंत्री के 2 एमएल युक्त 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर कोशिकाओं उपसंस्कृति।
    3. 24 घंटे के बाद, मुख्यमंत्री osteogenic भेदभाव माध्यम के साथ (0.1 μ की जगह; एम डेक्सामेथासोन, 10 माइक्रोन β-glycerophosphate, और 50 माइक्रोन एस्कॉर्बेट फॉस्फेट) और ऊष्मायन जारी है। भेदभाव मध्यम बदले हर 3 दिन या जितनी बार की जरूरत है।
    4. ऊष्मायन के 3 सप्ताह के बाद, आदेश osteogenic भेदभाव निर्धारित करने के लिए एक कैल्शियम बयान की उपस्थिति का पता लगाने के लिए कमरे के तापमान और मजीठ लाल के साथ दाग पर 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से में 2 से 4% की एमएल paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक।
      नोट: Paraformaldehyde विषैला होता है। कृपया उपयोग के दौरान दस्ताने और चश्मा पहन कर सावधानी अभ्यास करते हैं।
    5. धीरे आसुत जल से दो बार तय कोशिकाओं धोने और 2% मजीठ लाल दाग के साथ इलाज (2 एमएल / अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से थाली में) अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए।
    6. धीरे नल का पानी के साथ धोने के लिए इतना है कि कैल्शियम जमा बेदखल नहीं है द्वारा अतिरिक्त दाग निकालें।
    7. लाल से सना हुआ कैल्शियम एल एम का उपयोग कर जमा कल्पना।

4. मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पोलीमरेज़ चारिएक्शन में (QRT- पीसीआर) विश्लेषण

  1. संस्कृति 70% संगम को अलग सेल,, वाणिज्यिक ट्रिप्सिन समाधान के साथ अलग कर देना धोने, और centrifugation द्वारा गोली 3 मिनट के लिए 1500 XG पर कुल सेलुलर शाही सेना को अलग करने की।
  2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें एफबीएस के निशान को दूर करने के लिए, और फिर एक वाणिज्यिक आरएनए शुद्धि किट का उपयोग आरएनए अलगाव के लिए आगे बढ़ें, निर्माता के निर्देशों के।
  3. एक thermocycler का उपयोग 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर DNase के साथ इलाज के द्वारा पृथक कुल शाही सेना शुद्ध। वाणिज्यिक किट का उपयोग सीडीएनए निर्माता के निर्देशों के सिंथेसाइज़।
  4. SYBR हरे रंग पीसीआर Supermix के 5 μL युक्त प्रत्येक प्रतिक्रिया के साथ, एक 96 अच्छी तरह से थाली में तीन प्रतियों 10 μL पीसीआर प्रतिक्रियाओं तैयार करें; डबल आसुत जल के 3 μL; प्रत्येक प्राइमर का 0.5 μL, आगे और रिवर्स; और पतला (1:10) सीडीएनए का 1 μL।
  5. पर 98 और 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, 30 रों प्रत्येक के 44 चक्र द्वारा पीछा किया: निम्नलिखित मानकों के तहत पीसीआर प्रदर्शन करना# 176; सी, 60 डिग्री सेल्सियस पर 20, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 s।
  6. संदर्भ जीन, GAPDH और β-actin के लिए लक्ष्य जीन की प्रवर्धन सामान्य; प्राइमर दृश्यों तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।

5. सांख्यिकी विश्लेषण

  1. सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सभी विश्लेषण निष्पादित करें। SEM ± मतलब के रूप में डेटा प्रस्तुत करते हैं। एक पी-मूल्य के साथ परिणाम (** पी ≤ 0.05 ≤ 0.01 और * पी) सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

Representative Results

विच्छेदन और मानव गर्भनाल, गर्भनाल-नाल जंक्शन, और भ्रूण प्लेसेंटा से कोशिकाओं का अलगाव

प्रसवकालीन ऊतक तीन असतत संरचनात्मक क्षेत्रों के होते हैं। सीएल (हड्डी के बाहरी आवरण) और WJ (जेली की तरह की हड्डी के अंदर रक्त वाहिकाओं आसपास के सामग्री): पहला यूसी, दो धमनियों और एक नस, साथ ही दो अलग-अलग क्षेत्रों से युक्त है। दूसरा CPJ (गर्भनाल और प्लेसेंटा के बीच संबंध) है, और तीसरा एफपी, जो CPJ के तुरंत बाद है (कॉर्ड नाल है, जो मां के गर्भाशय की दीवार से जुड़ा हुआ है में सम्मिलित करता है) है। प्रसवकालीन ऊतकों से कोशिकाओं के अलगाव प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है। चार स्रोतों-सीएल, WJ, CPJ, और स्पष्ट रूप से पहचान एफपी-कर रहे हैं और जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया, explants से कोशिकाओं को अलग करने के लिए अलग हो गए थे। टीवह explant संस्कृतियों से सेल परिणाम की उपस्थिति नियमित रूप से नजर रखी और एल एम द्वारा दर्ज की गई। पक्षपाती fibroblastoid कोशिकाओं CPJ explants संवर्धन के 3-4 दिनों के बाद देखा गया। इसी तरह की संरचना के साथ कोशिकाओं WJ, सीएल, और एफपी explants संवर्धन, क्रमशः के बाद 7-8, 9-10, और 11-14 दिनों दिखाई दिया। Explants विभिन्न स्रोतों (सीएल, WJ, CPJ, और एफपी) का प्रतिनिधित्व करने से कोशिकाओं की परिणाम चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। इन कोशिकाओं को P0 माना जाता था। जब P0 कोशिकाओं subcultured रहे थे, वे clonally विकसित करने के लिए दिखाई दिया, बी.एम.-MSCs के समान एक fibroblastoid आकृति विज्ञान प्रदर्शित। हालांकि, वे जनसंख्या दोगुनी समय में बदलाव का प्रदर्शन किया, जैसा कि चित्र 3 बी और सी में दिखाया गया है, 32 घंटे से CPJ और एफपी से कोशिकाओं के लिए 94 घंटे तक होती है। WJ और सीएल से कोशिकाओं समान दोहरीकरण बार CPJ और एफपी को औसत दर्जे का था। P0 कोशिकाओं के आगे के विश्लेषण संकेत दिया कि वे भी CFE में विविध, 16 से 92 कालोनियों को लेकर।CPJ से कोशिकाओं उच्चतम (92) था, जबकि एफपी कोशिकाओं सबसे कम (16) CFE था। सीएल और WJ से कोशिकाओं 59 और 80 कालोनियों में क्रमश: (चित्रा 4 ए -सी) की CFE मूल्यों था। सीएल से कोशिकाओं बी.एम.-MSCs के समान CFE मूल्यों था। इन परिणामों का सुझाव है कि CPJ-व्युत्पन्न कोशिकाओं उच्च प्रजनन-शील और आत्म नवीकरण क्षमताएं होती हैं।

पृथक कोशिकाओं के Immunoprofile

सीएल, WJ, CPJ, और एफपी से अलग कोशिकाओं सेल विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई। P3-5 कोशिकाओं ऐसे CD29, CD44, CD73, CD90, और CD105 (चित्रा 5 ए और बी) के रूप में MSCs मार्करों के लिए सकारात्मक अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। इन कोशिकाओं को भी प्रमुख उतक अनुरूपता वर्ग व्यक्त करने के लिए मैं मार्कर, एचएलए-एबीसी, और द्वितीय मार्कर, HLA-DR 3 व्यक्त वर्ग नहीं है जाना जाता है। वें के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशतese सभी चार स्रोतों से चयनित मार्कर मानक बीएम-MSCs द्वारा व्यक्त की कि के समान थे। हालांकि, एमएफआई अनुपात संकेत मिलता है कि WJ- और CPJ-व्युत्पन्न कोशिकाओं लगभग समान हैं और Cl- और एफपी व्युत्पन्न कोशिकाओं (चित्रा 5C) से भी अधिक है। दिलचस्प बात यह है CFE अलग-अलग मान के बावजूद, विभिन्न स्रोतों से सभी कोशिकाओं एमएससी मार्करों के समान स्तर व्यक्त की है। कोशिका की सतह मार्करों के परिणामों के आधार पर सभी चार स्रोतों से पृथक कोशिकाओं MSCs माना जाता था। इन कोशिकाओं के आगे के विश्लेषण से पता चला कि वे भी जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 5D pluripotency जीन, OCT4, NANOG, KLF4, और Sox2 व्यक्त करते हैं,। CPJ-MSCs pluripotency मार्कर की उच्चतम अभिव्यक्ति, WJ-, Cl- और एफपी-MSCs द्वारा पीछा किया था।

पृथक MSCs के भेदभाव संभावित

MSCs विशेषता बताने के लिए स्वर्ण मानक उनके diffe करने की क्षमता हैकई प्रजातियों में rentiate। हमारे नतीजे बताते हैं कि प्रसवकालीन सूत्रों के सभी से अलग MSCs आसानी से adipogenic chondrogenic, और osteogenic प्रकार की कोशिकाओं में विभक्त होता। Adipogenic डेरिवेटिव लिपिड बूंदों जो निश्चित ही, जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 6A तेल लाल हे साथ दाग रहे थे का उत्पादन किया। Toluidine MSCs की chondrogenic व्युत्पन्न के नीले धुंधला प्रोटियोग्लाइकन और ग्लाइकोप्रोटीन कि बाह्य मैट्रिक्स (चित्रा 6B) के उत्पादन में सहायता प्राप्त की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। MSCs के osteogenic डेरिवेटिव सकारात्मक मजीठ लाल के साथ दाग, कैल्शियम अस्थि खनिज में शामिल जमा की उपस्थिति का संकेत के रूप में चित्रा 6C में दिखाया गया है।

जैसी उम्मीद थी, सभी स्रोतों से अलग MSCs की ट्रांस्क्रिप्शनल विश्लेषण trilineage भेदभाव (चित्रा 6D एफ) से पता चला। हालांकि, बर्तनभेदभाव के ential MSCs के स्रोत के आधार विविधता थी। WJ-MSCs की Adipogenic डेरिवेटिव 2 गुना चयनित adipogenic जीन (CEBPβ, FABP4, और PPARγ) CPJ-MSCs की तुलना की अधिक अभिव्यक्ति स्तर था। Cl- और एफपी-MSCs इन जीनों की सबसे कम अभिव्यक्ति थी। chondrogenic भेदभाव के मामले में, CPJ-MSCs डेरिवेटिव chondrogenic जीन (SOX9 और Col2) WJ- और एफपी-MSCs डेरिवेटिव की तुलना में अधिक 50 गुना चयनित व्यक्त। सीएल-MSCs के गरीब adipogenic भेदभाव के समान, वे chondrogenic जीन की सबसे कम अभिव्यक्ति द्वारा कम chondrogenic संभावना थी, स्पष्ट रूप में। CPJ-MSCs भी रूप में चुना osteogenic जीन (col1, OPN, और OCN) के 2 गुना अधिक प्रतिलेख के स्तर से संकेत दिया, उच्चतम osteogenic भेदभाव क्षमता दिखाई। हालांकि, पूर्वज मार्कर RUNX2 की अभिव्यक्ति WJ-MSCs के osteogenic डेरिवेटिव में सबसे अधिक थी, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं भेदभाव की स्थिति का जवाब देने में धीमी रही। फिर, सीएल-MSCs गरीब से पता चलाosteogenic वंश में भेदभाव। इन परिणामों का सुझाव है कि CPJ-MSCs और WJ-MSCs Cl- और एफपी-MSCs से अधिक भेदभाव संभावित प्रदर्शन किया। सीएल-MSCs न्यूनतम संभावित trilineage डेरिवेटिव में अंतर करने के लिए किया था।

आकृति 1
चित्रा 1: मानव गर्भनाल, गर्भनाल-नाल जंक्शन, और भ्रूण प्लेसेंटा से कोशिकाओं के अलगाव के योजनाबद्ध। एकत्र नमूना निरीक्षण करें और विच्छेदन के साथ आगे बढ़ना। चरण 1. मैन्युअल रूप से काटना और तीन असतत क्षेत्रों में की हड्डी / नाल नमूना अलग: गर्भनाल (UC), रस्सी-नाल जंक्शन (CPJ), और भ्रूण नाल (एफपी)। कॉर्ड अस्तर (सीएल) और व्हार्टन जेली (WJ) कैंची और संदंश का उपयोग कर में यूसी के दो अलग क्षेत्रों को अलग करें। चरण 2। विच्छेदित ऊतकों में से प्रत्येक के लिए अलग से 1- टी में कटौतीओ 2-मिमी टुकड़े कैंची का उपयोग कर और आंशिक रूप से टुकड़े को पचाने। चरण 3. संस्कृति ऊतक टुकड़े। चरण 4. उपचार trypsin द्वारा explants से कोशिकाओं को अलग। उपसंस्कृति और पृथक कोशिकाओं की विशेषताएँ हैं। चरण 5. पृथक और विशेषता कोशिकाओं प्रवर्धित और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: विच्छेदन और Explants की संस्कृति मानव गर्भनाल, गर्भनाल-नाल जंक्शन, और भ्रूण प्लेसेंटा से। दिखाया कॉर्ड / नाल नमूना के तीन विभिन्न संरचनात्मक क्षेत्रों हैं:, CPJ, और एफपी (सीएल और WJ में विभाजित) यूसी, साथ ही जुड़े धमनियों और नसों। सीएल, WJ, CPJ,और एफपी मैनुअल विच्छेदन से अलग हो गए थे explants से कोशिकाओं को अलग करने के लिए। विच्छेदित क्षेत्रों में से प्रत्येक को अलग से मुख्यमंत्री के 9 एमएल का उपयोग कर छोटे-छोटे टुकड़ों में काट लें और 2 प्लेटें 75 सेमी में सुसंस्कृत किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: मानव गर्भनाल, गर्भनाल-नाल जंक्शन, और भ्रूण प्लेसेंटा से पृथक कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। (ए) सीएल, WJ, CPJ, और एफपी की explants से सेल परिणाम, के रूप में एल एम द्वारा कल्पना। (बी) सीएल, WJ, CPJ, और एफपी explants से अलग कक्षों की उपसंस्कृति fibroblastoid आकृति विज्ञान दिखाया। पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी (: 4 एक्स आवर्धन) का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) जनसंख्या दोगुनी टी के समयवह सीएल, WJ, CPJ, और एफपी से कोशिकाओं को अलग। बी.एम.-MSCs एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया। त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों माप का मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व (** पी ≤ 0.05 ≤ 0.01 और * पी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: कॉलोनी बनाने मानव गर्भनाल, गर्भनाल-नाल जंक्शन, और भ्रूण प्लेसेंटा से कोशिकाओं की क्षमता। (ए) कोशिकाओं (P0) सीएल, WJ, CPJ, और एफपी से अलग की वृद्धि, 1.63 कोशिकाओं / सेमी 2, का एक प्रतिरूप घनत्व पर प्लेटेड एल एम द्वारा कल्पना कर रहे थे। (बी) क्रिस्टल बैंगनी कॉलोनी बनाने की क्षमता प्रदर्शित करने के साथ दाग कोशिकाओं के Photomicrographs। (सी) कोशिकाओं दाग बुद्धि की एकल कॉलोनीज क्रिस्टल बैंगनी। पैमाने सलाखों 100 सुक्ष्ममापी (: 4 एक्स आवर्धन) प्रतिनिधित्व करते हैं। (डी) कोशिकाओं सीएल, WJ, CPJ, और एफपी से प्राप्त से गठित कालोनियों की संख्या का आलेखीय प्रतिनिधित्व। बी.एम.-MSCs एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया। त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों माप का मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व (** पी ≤ 0.05 ≤ 0.01 और * पी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: एमएससी मार्करों कोशिकाओं मानव गर्भनाल, गर्भनाल-नाल जंक्शन, और भ्रूण प्लेसेंटा से पृथक द्वारा व्यक्त का विश्लेषण। (ए) रोकते रूप मेसेंकाईमल सतह मार्कर (CD29, CD44, CD73, CD90, और CD105) सीएल, WJ, CPJ, और एफपी से कोशिकाओं द्वारा की अभिव्यक्ति,फ्लो द्वारा खनन किया। (ख और ग) का चयन किया मेसेंकाईमल सतह मार्करों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत और मंझला फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) अनुपात की चित्रमय प्रतिनिधित्व। एमएफआई अनुपात isotype की एमएफआई मूल्य द्वारा एमएफआई मार्कर का मूल्य (गेटेड सेल आबादी की प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न) को विभाजित किया गया था। त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों माप का मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। (डी) pluripotency जीन (OCT4, NANOG, KLF4, और Sox2) सीएल, WJ, CPJ, और एफपी से कोशिकाओं द्वारा की अभिव्यक्ति, के रूप में QRT- पीसीआर द्वारा निर्धारित किया। (** पी ≤ 0.01 और * 0.05 ≤ पी)। जीन अभिव्यक्ति GAPDH और β-actin के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों माप का मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्र 6: मानव गर्भनाल, गर्भनाल-नाल जंक्शन, और भ्रूण प्लेसेंटा से पृथक MSCs की Multilineage विभेदन। (ए) कोशिकाओं 3 सप्ताह के लिए adipogenic भेदभाव माध्यम में इनक्यूबेट और तेल लाल हे साथ दाग रहे थे, लिपिड बूंदों की उपस्थिति का संकेत। (बी) सेल छर्रों 3 सप्ताह के लिए chondrogenic भेदभाव माध्यम में इनक्यूबेट रहे थे। गोली संस्कृतियों के ऊतकीय cryosections toluidine नीले रंग के साथ दाग रहे थे, ग्लाइकोसअमिनोग्लाइकन्स की उपस्थिति प्रदर्शित। (सी) कोशिकाओं 3 सप्ताह के लिए osteogenic भेदभाव माध्यम में इनक्यूबेट और मजीठ लाल साथ दाग रहे थे, अस्थि खनिज सुझाव कैल्शियम जमा के उत्पादन में प्रदर्शित करना। सभी छवियों एल एम द्वारा प्राप्त किया गया। पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी (: 4 एक्स आवर्धन) का प्रतिनिधित्व करता है। बी.एम.-MSCs हमएक मानक के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। (DF) चयनित जीनों की अभिव्यक्ति (CEBPβ, FABP4, और PPARγ; SOX9, ACAN, और Col2, और Col1, RUNX2, OPN, और OCN adipogenic, chondrogenic, और osteogenic वंश में, क्रमशः में MSCs के भेदभाव का प्रतिनिधित्व), निर्धारित QRT- पीसीआर विश्लेषण द्वारा (** पी ≤ 0.05 ≤ 0.01 और * पी)। जीन अभिव्यक्ति GAPDH और β-actin के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों माप का मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जीन प्राइमर दृश्यों उत्पाद की लंबाई
OCT4 फॉरवर्ड-CCCCTGGTGCCGTGAA 97
रिवर्स-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </ Td>
NANOG आगे AAAGAATCTTCACCTATGCC 110
Reverse- GAAGGAAGAGGAGAGACAGT
KLF4 आगे CGAACCCACACAGGTGAGAA 94
Reverse- TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC
Sox2 आगे TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA 75
Reverse- CTGGGGCTCAAACTTCTCTC
SOX9 आगे AGCGAACGCACATCAAGAC 85
Reverse- CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
col2 आगे CTCGTGGCAGAGATGGAGAA 252
Reverse- CACCAGGTTCACCAGGATTG
एक कर सकते हैं आगे AGCCTGCGCTCCAATGACT 103
Col1 आगे AAGGTCATGCTGGTCTTGCT 114
Reverse- GACCCTGTTCACCTTTTCCA
RUNX2 आगे TGCTTCATTCGCCTCACAAA 111
Reverse- AGTGACCTGCGGAGATTAAC
OPN आगे CATACAAGGCCATCCCCGTT 112
Reverse- TGGGTTTCAGCACTCTGGTC
OCN आगे TAAACAGTGCTGGAGGCTGG 191
Reverse- CTTGGACACAAAGGCTGCAC
CEBPβ आगे TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 94
Reverse- AGCTTTCTGGTGTGACTCGG
FABP4 आगे TTAGATGGGGGTGTCCTGGT 158
Reverse- GGTCAACGTCCCTTGGCTTA
PPARγ आगे GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74
Reverse- ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG
GAPDH आगे ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG 101
Reverse- GCCATCACGCCACAGTTTC
actin आगे AATCTGGCACCACACCTTCTAC 170
Reverse- ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC

तालिका 1: मानव प्राइमर दृश्यों की सूची इस अध्ययन में इस्तेमाल।

Discussion

स्टेम सेल अनुसंधान में हाल के अग्रिमों न केवल बुनियादी विकास प्रक्रियाओं की समझ में सुधार, लेकिन यह भी जैव प्रौद्योगिकी, दवा, सेल थेरेपी, पुनर्योजी चिकित्सा, और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों 18, 19, 20 में स्टेम कोशिकाओं के उपयोग के लिए आशाजनक अवसर प्रदान। शुरुआती भ्रूण से अलग pluripotent ESCs सबसे होनहार हैं, वे तकनीकी चुनौतियों और नैतिक दुविधाओं 21, 22, 23 का सामना। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) वयस्क कोशिकाओं से व्युत्पन्न एक विकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन वे भी इसी तरह की तकनीकी और सुरक्षा समस्याओं 23 सामना करते हैं। इसके अलावा, IPSCs आनुवंशिक रूप से स्थिर नहीं हो सकता है या, आया आनुवंशिक परिवर्तन हो सकता है इस प्रकार उनके चिकित्सकीय प्रयोग सीमित। स्टेम सेल भी प्रसव के बाद Tis की एक किस्म में सूचित किया गया हैमुकदमा और अंगों। इन ASCs का सबसे आम स्रोतों अस्थि मज्जा, वसा, और मांसपेशियों के ऊतकों हैं। हालांकि, प्रसव के बाद स्रोतों से ASCs विकास और भेदभाव संभावित 24, 25 तक ही सीमित है। उन्होंने यह भी वजह से उम्र बढ़ने और पर्यावरण तनाव के संपर्क में रहने से पीड़ित है और इस तरह हमेशा चिकित्सीय अनुप्रयोगों 26, 27, 28 के लिए प्रभावी नहीं हैं। यह है कि ASCs की तुलना में अधिक भोली हैं स्टेम सेल के नए स्रोतों के लिए खोज करने के लिए हमें और दूसरों को प्रेरित किया है।

हम ASCs के लिए एक विकल्प के रूप में आदिम स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रसवकालीन स्रोतों की जांच की है। इस रिपोर्ट में, हम की हड्डी / नाल नमूनों से मानव MSCs अलग करने के लिए एक विश्वसनीय, मजबूत, और सरल विधि प्रदान करते हैं। अन्य स्रोतों और तरीकों ASCs के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया की तुलना में, इस विधि hig की एक बड़ी मात्रा अलग करने के लिए एक कुशल और गैर इनवेसिव तरीका प्रदान करता हैज गुणवत्ता MSCs। आगे यह भी इस तरह के बी.एम. के रूप में वयस्क स्रोतों से MSCs की तुलना में प्रसवकालीन MSCs की उच्च विकास दर और भेदभाव संभावित accentuates।

यूसी नाल को भ्रूण संलग्न दो धमनियों, एक नस, सीएल सहित विशिष्ट संरचनात्मक क्षेत्रों, के साथ एक बड़ा अंग है, और WJ (रक्त वाहिकाओं आसपास के ऊतकों)। कई अध्ययनों से पूरी की हड्डी, WJ, या प्लेसेंटा से MSCs के अलगाव, चर वृद्धि के साथ सूचित किया है और भेदभाव 25 क्षमता, 29। फिर भी, आज तक कोई अध्ययन को प्रभावी ढंग से जांच की और रस्सी / नाल नमूना के विभिन्न संरचनात्मक क्षेत्रों से कोशिकाओं की तुलना में किया गया है। हम यहाँ यूसी, CPJ के विच्छेदन के लिए एक व्यवस्थित और सरल विधि प्रदान करते हैं और MSCs के अलगाव के लिए एफपी जुड़ा हुआ है। हम यह भी विशेषताएँ और उनके प्रसार capabil के निर्धारण से अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए एक व्यापक और सरल प्रोटोकॉल दिखानेities, साथ ही उनके आत्म नवीकरण और भेदभाव क्षमता। इस विधि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और बेहतरीन गुणवत्ता वाले MSCs की एक बड़ी राशि अर्जित करता है।

हमने पाया है कि आकार में ऊतक टुकड़े 1-2 मिमी आंशिक पाचन explants से एक व्यावसायिक ट्रिप्सिन समाधान reproducibly झुकेंगे कोशिकाओं का उपयोग कर, जबकि एकल कक्षों में ऊतक का पूरा पाचन पृथक कक्षों की गरीब पैदावार था। हालांकि, एक अध्ययन की रिपोर्ट है कि यूसी के बड़े ऊतक explants लगभग आकार में 10 मिमी सेल अलगाव 30 के लिए इष्टतम थे। इसके विपरीत, एक और अध्ययन से पता चला है कि ऊतक explant विधि एंजाइम पाचन विधि 31 की तुलना में एक लंबे समय तक संस्कृति चक्र और कोशिकाओं के निचले उपज में हुई। पिछली रिपोर्टों में, हड्डी के उपचार कोलैजिनेज़ द्वितीय और hyaluronidase, अलग से या ट्रिप्सिन निम्नलिखित के साथ ऊतकों, गर्भनाल कोशिकाओं 32, 33 अलग करने के लिए प्रदर्शन किया गया है 34। इतना ही नहीं वहां संवर्धन करने से पहले गर्भनाल ऊतक के पाचन के तरीकों में बदलाव का एक बड़ा सौदा है, लेकिन यह भी अलग कोशिकाओं विषम प्रतीत होता है। अब समय अवधि के लिए कठोर एंजाइमों के उपयोग कोशिका झिल्ली में कमी आ सकती, सेल पालन और प्रसार को प्रभावित करने वाले। इस विधि के नतीजे बताते हैं कि आंशिक रूप से पच प्रसवकालीन ऊतक explants व्यापक कोशिका क्षति पहुंचाए बिना कोशिकाओं के परिणाम प्रदान की है, व्यवहार्यता बनाए रखा, और MSCs के सजातीय आबादी की अधिक मात्रा में सामने आए।

जबकि explants से विच्छेदन और कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल सीधा है, चरणों में से कुछ साबित चुनौतीपूर्ण हो सकता है। सबसे पहले, यह सुनिश्चित explant पालन संस्कृति कुप्पी की सतह के लिए उनके लगाव की अनुमति देकर। इस माध्यम की एक छोटी राशि का उपयोग कर, केवल संस्कृति के पहले 2 घंटे के लिए ऊतक टुकड़े को कवर, और फिर ध्यान से शेष मध्यम जोड़कर मदद की जा सकती। एसecond, कम से कम 15 T75 फ्लास्क प्रति explants की संख्या को सीमित। टुकड़े या कुप्पी के लिए बहुत अधिक टुकड़ों के बीच बहुत कम जगह सेल परिणाम के लिए निरोधात्मक हैं। तीसरा, ऊतक टुकड़े कि ऊष्मायन के 3 दिन के बाद संस्कृति कुप्पी की सतह से टिक नहीं पाता पालन और संवर्धन के लिए एक नई कुप्पी में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। चौथा, ऊतक टुकड़े सेल मलबे, जो लगाव को रोकता से मुक्त होना चाहिए संवर्धित किया जा सकता है। पांचवां, बड़े टुकड़ों के संवर्धन अधिक मध्यम की आवश्यकता है और सेल परिणाम दक्षता में सुधार नहीं करता है। अन्त में, explant संस्कृतियों बारीकी से, पर नजर रखने के लिए विशेष रूप से सेल परिणाम की उपस्थिति के बाद के रूप में कोशिकाओं तेजी से संगामी हो जाते हैं और ऊतक स्रोत पर निर्भर करता है को अलग कर सकते हैं। तकनीक का एक कुछ सीमाएं नमूने चीर-फाड़ सीएल, WJ, CPJ, और एफपी अलग करने के लिए विशेषज्ञता की कमी शामिल हैं; एक छोटा सा नमूना आकार, कम WJ उपज में जिसके परिणामस्वरूप; और देरी प्रसंस्करण-नमूने avo करने के लिए संग्रह के 2-4 घंटे के भीतर कार्रवाई की जाने की आवश्यकता हैआईडी सेल वसूली में कमी।

MSCs के लक्षण वर्णन के लिए स्वर्ण मानक, प्लास्टिक का पालन fibroblastic फेनोटाइप फार्म, और कई प्रजातियों में अंतर करने के लिए की क्षमता है। ये भी रूप में ISCT 35 द्वारा वर्णित MSCs परिभाषित करने के लिए सामान्य रूप से प्रयुक्त मानदंड हैं। इस अध्ययन में, सभी चार स्रोतों से अलग कोशिकाओं प्लास्टिक के पक्षपाती थे और एमएससी मार्कर (CD29, CD44, CD73, CD90, और CD105), लेकिन hematopoietic मार्कर CD45 के लिए नकारात्मक अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक अभिव्यक्ति थी। इसके अलावा, वे मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (HLA) वर्ग मैं व्यक्त लेकिन एचएलए वर्ग द्वितीय के लिए नकारात्मक रहे थे। बी.एम.-MSCs की तुलना में, WJ- और CPJ-व्युत्पन्न कोशिकाओं अधिक थी। इन परिणामों के पिछले रिपोर्ट के साथ संगत कर रहे हैं यूसी व्युत्पन्न MSCs 33, 36, 37, 38। इसके अलावा, हमारे नतीजे बताते हैं कि Cl-, WJ-, CPJ-, एफपी-MSCs pluri व्यक्तइस तरह के OCT4, NANOG, और Sox2 के रूप में शक्ति जीन; हालांकि, उनकी अभिव्यक्ति ESCs से कम के रूप में पहले से 39 की सूचना दी थी। इन परिणामों पिछले एक अध्ययन है कि प्रसवकालीन व्युत्पन्न कोशिकाओं 40 में pluripotency मार्कर की अभिव्यक्ति सूचना के साथ समझौते में भी थे। दिलचस्प बात यह है यह देखा गया है pluripotent मार्कर की अभिव्यक्ति अन्य स्रोतों से अलग कक्षों में से CPJ-MSCs में अधिक था कि। यह भी देखा गया था कि यूसी MSCs बी.एम.-MSCs 41 से अधिक आत्म नवीकरण संभावित प्रदर्शन किया। दिलचस्प बात यह है प्ररूपी विशेषताओं में समानता के बावजूद, चार स्रोतों से अलग कोशिकाओं चर CFE मूल्यों था। हालांकि, एफपी-एमएससी के अलावा, वे सब बी.एम.-MSCs की तुलना में बेहतर CFE मूल्यों था। CPJ-MSCs उच्चतम CFE मूल्य और प्रसार की दर था जब अन्य सभी MSCs की तुलना में। इसके अलावा, WJ- और CPJ-MSCs बी.एम.-MSCs की तुलना में अधिक भेदभाव क्षमता का प्रदर्शन किया। सीएल-MSCs कम से कम भेदभाव से पता चलासभी तीन प्रजातियों (यानी, adipogenic, chondrogenic, और osteogenic), जबकि CPJ-MSCs में संभावित उच्चतम trilineage भेदभाव की संभावना थी और एफपी-MSCs कम से कम adipogenic भेदभाव संभावित प्रदर्शन किया।

अंत में, हमारे नतीजे बताते हैं कि गुणवत्ता और अलग MSCs की मात्रा की हड्डी / नाल नमूने में चार स्रोतों के बीच मतभेद था। CPJ-MSCs अधिक प्रसार क्षमता और अधिक से अधिक आत्म नवीकरण की संभावना थी। उन्होंने यह भी trilineage प्रकार की कोशिकाओं में उनके भिन्नता में शक्तिशाली थे। उनके कम दोगुना समय के कारण, CPJ-MSCs तेजी से हो सकता है विस्तार 1,000 गुना और उच्च throughput दवा या biomaterial स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया। इन कोशिकाओं को सेल थेरेपी और पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक अधिक आशाजनक स्रोत हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन OU-पश्चिम बंगाल ISCRM, ओकलैंड विश्वविद्यालय और मिशिगन सिर और स्पाइन संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। N बीरावोलू और C मैककी ओकलैंड विश्वविद्यालय से प्रोवोस्ट ग्रेजुएट रिसर्च अवार्ड प्राप्त किया। हम पांडुलिपि की समीक्षा करने के लिए एस बख्शी की सराहना करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM with 4,500 mg/mL glucose Invitrogen 11995065
FBS Aleken Biologicals FBSS500
Isobutyl-methylxanthine Sigma I5879-250mg
Dexamethasone Sigma D4902-100mg
Insulin Prospec CYT-270
Indomethacin Sigma I7378-5G
TGFβ1 Prospec CYT-716
Ascorbic acid Sigma A-7631
Ascorbate 2-phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate Sigma G-6251
TrypLE Invitrogen 50591419
GeneJET RNA purification kit Thermo Scientific K0732
DNase Promega M6101
iScript kit Biorad 1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit Biorad 1725274
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943
OCT Thermo Scientific SH75-125D
Oil Red O  American MasterTech Scientific STORO100
Toluidine blue Thermo Scientific S71363
Crystal violet Sigma C3886
Alizarin red stain Thermo Scientific S25131
APC Mouse anti-Human CD29 BD Biosciences  559883
APC Mouse anti-Human CD34 BD Biosciences  555824
FITC Mouse anti-Human CD44 BD Biosciences  555478
FITC Mouse anti-Human CD45 BD Biosciences  555482
APC Mouse anti-Human CD73 BD Biosciences  560847
FITC Mouse anti-Human CD90 BD Biosciences  561969
APC Mouse anti-Human CD105 BD Biosciences  562408
Centrifuge IEC 93522M-2
CO2 incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i
Light microscope (LM) Nikon Instruments Inc. Olympus
Hemacytometer Thermo Scientific 0267151B
Cryostat Leica CM3050 S
FACS Canto II and Diva Software BD Biosciences  Canto II 
Thermocycler MJ Research Inc. PTC-100
Real-Time PCR System  Bio-Rad CFX96

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References

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मानव गर्भनाल और भ्रूण प्लेसेंटा से अलगाव और Mesenchymal Stromal कोशिकाओं की विशेषता
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Beeravolu, N., McKee, C., Alamri, A., Mikhael, S., Brown, C., Perez-Cruet, M., Chaudhry, G. R. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. J. Vis. Exp. (122), e55224, doi:10.3791/55224 (2017).

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