Summary
目前, 任何一种带血管的复合异体移植都依赖于长期免疫抑制, 难以支持非致命的适应症。我们提出了一个新的猪胫骨 VCA 模型, 可用于研究骨 VCA 和示范使用的外科血管生成, 以维持骨骼的生存能力, 而无需长期免疫调节。
Abstract
创伤、感染性恶性肿瘤和先天性畸形导致的节段骨丢失仍然是一项重大的重建挑战。目前的治疗方案有重大的失败风险和大量的发病率。
使用骨带血管的复合同种异体移植 (VCA) 将提供一个密切吻合的骨大小和形状, 愈合和重塑潜力的活骨。目前, life-long 药物免疫抑制 (是) 是必需的。器官毒性、机会感染和肿瘤风险是治疗这种非致死性适应症的关注。
我们先前已经证明, 在大鼠和家兔中可以维持骨骼和关节 VCA 的生存能力, 而不需要通过植入 VCA 内的受体血管进行长期免疫抑制。它产生一个自生, neoangiogenic 循环与可测量的流量和主动骨重塑, 只需要2周的是。由于小动物在解剖学、骨骼生理学和免疫学方面与人类有很大的不同, 我们在进行临床应用之前, 已经开发出了一种猪骨 VCA 模型来评价这一技术。小型猪目前被广泛用于同种异体移植的研究, 其免疫学, 解剖, 生理和大小相似的人。在这里, 我们描述了一个新的猪原位胫骨骨 VCA 模型, 以测试的作用, 自体外科血管生成保持 VCA 生存能力。
该模型利用大小和形状匹配的同种异体胫骨骨段, 移植在尤卡坦半岛小型猪的主要猪白细胞抗原 (SLA) 错配中, 重建胫骨节段骨缺损。将接受者自体血管移植到同种异体胫骨骨段髓管中的营养血管的修复和植入是与同期短期相结合进行的。这允许 neoangiogenic 自体循环从植入的组织中发展, 在短时间内维持通过同种异体营养血管的流动。一旦建立, 新的自体循环维持骨活力后, 停止药物治疗和随后的营养血管血栓形成。
Introduction
大节段性骨缺损是由外伤、感染或恶性肿瘤后保肢手术引起的。目前的重建选择, 如血管化自体骨移植、骨转运、人工关节置换和冷冻保存的坏死同种异体移植, 单独或联合使用, 都有显著的发病率, 并有很高的率并发症1,2,3。
微血管网络的存在对于骨骼的形成和稳态至关重要, 支持骨修复所需的成骨、软骨和间充质干细胞4。
活体同种异体骨移植是一种带血管的复合组织异体 (骨 VCA), 以其营养蒂的显微外科吻合术, 可作为未来重建的替代品。与冷冻异体骨一样, 通过紧密匹配的骨缺损形态提供即刻稳定性。像自体血管移植, 它提供了加强愈合和重塑活骨组织。任何移植程序的障碍仍然是长期免疫抑制的需要。这个问题在肌肉骨骼组织中更为尖锐, 这需要药物剂量比器官移植的2-3 倍5。伴随的风险, 包括器官毒性, 恶性肿瘤, 感染或发展移植物抗宿主病是很难证明在这些寿险关键-应用程序6。然而, 急性和慢性排斥的事件仍然是当前长期存在的一个主要问题, 即7。持续的努力, 以密切配合组织相容性抗原, 诱导捐赠特定的耐受性和/或改善药物免疫治疗尚未成功地在允许临床无药物组存活8,9。
我们先前已经证明了通过促进移植骨内的新的自生循环来维持骨 VCA 活力和增强小动物模型骨重塑的方法。这是由植入自体组织的外科血管生成的额外使用10,11,12。异体骨段移植 microsurgically 与营养骨段蒂吻合。此外, 宿主衍生血管被植入同种异体血管化骨段的髓质管。在这2周的过程中, 同种异体营养血管的通畅保持了药物免疫抑制。在取出后, 营养蒂将最终 thrombose13。新的毛细床, 基于宿主衍生的血管提供足够的循环, 以维持组织的生存能力。骨愈合和重塑是加强, 因为成骨和血管生成耦合10,11,12。不需要进一步的免疫治疗, 尽管有免疫的合格宿主和缺乏供体特定的耐受性, 但长期维持骨骼的生存能力。
将这种新的同种异体骨移植到临床实践中, 最好先对大动物模型的愈合、力学性能和免疫学进行进一步的研究。猪模型是理想的这样 VCA 研究14,15,16。微型猪在大小和解剖学上是可比较的人, 允许骨骼重建使用本质上完全相同的外科植入物和技术。猪免疫的定义很明确, 包括猪白细胞抗原 (SLA) 型和血型, 是移植手术所必需的。细胞谱系研究是可能的与性别不匹配的移植, 如详细分析免疫应答17,18,19,20,21。
在这里, 我们描述了一个骨 VCA 移植模型在尤卡坦半岛小型猪, 适合研究节段性骨丢失和重建。该模型可用于研究外科血管生成和短期的相互作用, 包括骨谱系、骨血流、愈合和重塑能力、alloresponsiveness 和生物力学的 VCA 存活和功能, 以及测试其他创新的免疫调节策略。
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Protocol
这项研究由机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准, 在梅奥诊所罗切斯特。尤卡坦半岛小型猪在这一手术 VCA 过程中作为捐赠者和受赠人。供者和受体配对是基于 DNA 序列猪白细胞抗原 (sla) haplotyping, 以确保 sla 2223中的主要不匹配。动物是年龄和体重匹配和相同的血型。两个外科手术组同时从捐献者的营养血管中采集猪胫骨骨段, 并准备接受 orthopically 的同种异体胫骨骨段。同时, 在骨营养血管的微血管修复, 一个受体衍生的动静脉束被放置在胫骨段的自体血管生成。
1. 前的准备工作
- 快速尤卡坦半岛小型猪在手术前的前一天, 并称他们为受控药物管理。
- 与嗪 (2 毫克/千克) 和 tiletamine 盐酸和唑盐酸 (5 毫克/千克) 的组合, 皮下注射的镇静动物。
- 在耳静脉内放置一个外周导管, 用于静脉注射药物和生理盐水, 并管理丁丙诺啡 (0.18 毫克/千克) 和预防性抗生素 (1 克 cefazoline 静脉注射和5毫克/千克呋肌)。
- 剃须的右后肢和左颈部, 将作为收获地点的带血管的胫骨骨段和现场放置的中心静脉导管, 分别。
- 通过测试口腔肌肉的松弛来检查生命体征和镇静程度。
- 插管的动物与适当大小的气管导管在胸骨卧床24。
- 将微型猪转移到手术台上, 并通过管理异氟醚 (1-3%) 连接到呼吸机以维持麻醉。
- 通过测试眼睑、瞳孔光和角膜反射来确认麻醉深度。
- 监测氧气饱和度与脉冲血传输探头连接到耳朵。使用血压袖带和体温探头进行术中生命标志的监测。
- 将尤卡坦微型猪放在暖垫上的仰卧位。此外, 在手术中使用强制空气加温毯来防止体温过低。
- 用眼睛上的兽医药膏来预防麻醉时的干燥。
2. 带血管的胫骨骨段的收获
- 用聚维酮碘溶液清洗每个小型猪的右腿。用无菌毛巾擦干皮肤, 用无菌的方式将四肢披上。用碘浸渍的粘合剂切口包裹和隔离肢体, 以尽量减少污染的风险。
- 用手术刀 anterolaterally 在后肢进行切口, 从膝关节开始, 沿胫骨前脊延伸至胫关节。
- 用剪刀解剖皮肤和皮下组织, 并从胫骨侧面缩回前室肌。
注: 胫骨前肌源的释放有助于暴露。骨间膜现在暴露了。 - 确定颅骨胫动脉和静脉 (以后用作血管新生的动静脉束)。
注意: 胫骨干动脉和血管位于骨间膜的前表面。 - 为了改善手术的视野, 从胫骨前肌的插入部分释放一部分, 用振荡锯去除胫骨脊的一部分。
- 保护颅内胫血管, 切开骨间膜, 从胫骨结节的水平开始, 用剪刀切割。
- 可视化胫骨尾部的血管, 在膜下远端运行。
注意: 他们从胫腓骨血管分支, 并引起胫骨骨干的营养蒂, 只是远端的结节。现在可以可视化的营养孔和血管进入胫骨的后侧面只是胫骨结节的远端。 - 用 microclamp 标记营养蒂。不要分离血管蒂。
- 在营养孔附近发现胫骨前室的肌支;可用于吻合血管的骨移植营养血管。用 microclamp 标记肌肉分支。
-
3.5 厘米胫骨骨段包括血管蒂的收获。
- 使用切割夹具, 以确保精确和可再生的骨切除。在胫骨内侧表面放置和固定切割夹具, 包括营养孔和血管。
- 在跳汰机指导下, 用振荡锯进行平行骨切割, 以去除3.5 厘米胫骨段。使用相同的定位和夹具的捐助者和受体动物, 以最大限度的大小和形状匹配。
- 使用切割夹具, 以确保精确和可再生的骨切除。在胫骨内侧表面放置和固定切割夹具, 包括营养孔和血管。
- 一旦两个切口已经用振荡锯, 旋转胫骨骨段, 以可视化的营养椎弓根在后表面。用剪刀将其来源的营养蒂从颅骨胫动脉中分离出来。用剪刀解剖和释放胫骨段, 在其表面留下一层骨膜和肌肉的薄袖。
- 将胫骨骨段缩回, 并用锋利的钳夹将胫骨骨段抬高, 使胫骨干动脉就位。
注: 带血管的骨段现已准备好微血管转移, 并在每一个尤卡坦小型猪中建立了3.5 厘米胫骨骨缺损。 - 结扎用可吸收的 polyglactin 3-0 缝合线在踝关节上的胫腓骨血管, 释放他们与血管组织的袖口, 创造一个动静脉 (AV) 捆绑。保持缝线至少5厘米长, 以减轻植入胫骨骨段。
3. 胫骨原位骨 VCA 重建联合外科血管生成
-
交换收获的胫骨骨段与它的营养蒂之间的两个动物使用它们作为骨 VCAs。
- 为了允许将颅内胫骨动静脉 (AV) 束进入胫骨骨段, 用振荡锯从近端交界部位取出 V 形段。
- 在胫骨骨缺损部位的远端钻一个直径0.5 厘米的孔, 并进入胫骨骨段的髓质管, 并引入已结扎远端的受体 AV 束, 进入髓内管, 促进随后的自生新的血液供应
-
将带血管的胫骨骨段原位入受体缺损。
- 使用简单间断缝合技术和9-0 缝合25, 将胫骨骨段的营养蒂吻合到胫骨前室的预备肌肉支。
- 用挤奶试验确认微血管吻合通畅26。
-
使用9孔 3.5 mm 锁定板实现接骨。
- 将9孔板放在胫骨 anteromedially 上。用三双螺钉固定在胫骨骨段上方和下方的钢板上。此外, 放置皮质螺钉在胫骨骨段内固定。为了确认正确定位的骨 VCA 和板, 使用前后和横向射线照相。
- 使用间断的3-0 和2-0 可吸收缝合线进行筋膜和层状皮肤闭合。最后用密闭的透明敷料封住伤口。
4. 中心静脉导管置入颈静脉外静脉
-
术后药物管理和免疫抑制 (是) 药物水平监测, 使用开放的技术, 放置静脉导管到颈外静脉。在移植手术结束时进行麻醉下的放置 (见1节)。
- 用手术刀在颈部进行前外侧切口。用剪刀解剖皮下组织, 并暴露左颈静脉。
- 通过颈外静脉小孔将希克曼导管插入颈静脉, 并用吸收缝合固定。取出导管在背部通过隧道皮下注射。
- 使用间断的3-0 和2-0 可吸收缝合线, 将导管固定在皮肤上, 并在层上缝合颈部。
- 在切口处放置咬合绷带。用渔网绷带将绷带和导管固定到位。
5. 术后治疗及随访
- 手术后立即治疗尤卡坦半岛小型猪, 肌肉注射卡洛芬 (4 毫克/千克) 用于术后镇痛。管理丁丙诺啡 (0.18 毫克/千克), 根据需要治疗高强度疼痛。
- 允许猪恢复60分钟, 然后将猪返回到一个特别的重症监护病房, 并密切监视直到完全恢复。
- 将尤卡坦半岛的小型猪移到正常的笼子里, 并提供随意的水和食物。
- 执行他克莫司 (0.8-1.5 毫克/千克/天) 和霉酚酸酯 (MMF) (50-70 毫克/千克/天) 口服和甲基泼尼松龙琥珀酸钠 (开始500毫克/天) 两周。
- 根据槽血水平调整每日剂量的免疫抑制药物, 目的为克莫司和 1.0-3.5 µg/毫升的 MMF, 分别为 5.0-30.0 ng/毫升.逐步减少甲基泼尼松龙的剂量, 直至达到每天50毫克的维持剂量。
- 用庆大霉素 (3 毫克/千克静脉注射) 和呋 (5 毫克/千克注) 进行两周的预防性抗生素的管理。
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Representative Results
该技术成功地在四 SLA 主要不匹配的尤卡坦半岛小型猪和胫骨缺损重建使用大小匹配的胫骨 VCA。同时营养血管修复的骨移植和植入的 AV 捆绑从接受动物在移植髓质管允许立即骨循环和发展新的自体血液供应超过时间 (图 1)。在16周内, neoangiogenic 循环已建立在所有胫骨 VCAs, 可视化的微计算机断层扫描 (微 CT) 造影后注射显影血管造影聚合物 (125 毫升) 到股骨血管和脱胫骨 VCA (图 2)。
图 1: 胫骨原位骨 VCA 术.显示手术过程的图示。(a) 供体程序: 以其营养蒂为胫骨骨段的收获。(B) 在主要的 SLA 不匹配的猪之间交换胫骨骨段。(C) 接受程序: 动静脉束植入: 在髓质管中仔细插入颅骨胫血管。(D) 营养蒂的显微血管吻合术, 用于胫骨前室肌支和胫骨骨干的接骨板。在梅奥医学教育和研究基金会的许可下使用。保留所有权利。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 代表性3D 脱胫骨 VCA 段的微 CT 血管造影图像.neongiogenic 循环 (黄色箭头) 是在灌注显影硅溶液后描述的。请单击此处查看此图的较大版本.
微型猪没有表现出任何窘迫或自残的迹象。所有的伤口愈合, 没有感染和动物行走正常, 最终能够承担全部重量的操作右下肢从第一个术后一天。在研究端点在 16th星期所有尤卡坦微型猪获得了超过150% 他们的原始的体重 (前: 56.0 ±6.1 与16星期后: 84.5 ± 6.0)。
两周的免疫抑制, 包括克莫司, 霉酚酸酯 (MMF) 和甲基泼尼松龙琥珀酸是用来维持血液流经营养蒂, 直到一个新的自体血液供应已经建立在异基因骨头移植在2周的免疫抑制周期性血液样本取自颈静脉导管, 以评估药物血水平。剂量进行了调整, 以保持槽血水平的 5-30 ng/毫升的克莫司和 1-3. 5 µg/毫升 MMF (表 1)。没有药物相关的并发症发生, 并瞄准槽水平的克莫司和霉酚酸酯可以实现 (图 3和图 4)。
| 免疫 | 初始剂量 | 槽水位 | 维护剂量 |
| 莫 | 0.8-1.5 毫克/公斤/天 | 5-30 ng/毫升 | |
| 霉酚酸酯 | 50-70 毫克/千克/天 | 1-3 µg/毫升 | |
| 甲基泼尼松龙琥珀酸钠 | 500毫克 | 50毫克 |
表 1: 短期免疫抑制协议描述的是免疫抑制协议的第一2周后移植与开始剂量他克莫司, 霉酚酸酯和泼尼松龙。此外, 还针对他克莫司和霉酚酸酯的水平和维持剂量的泼尼松龙显示。
图 3: 他克莫司的血液水平.在前2周的移植后, 他克莫司达到的槽位水平和分范围被描述。误差线表示分范围。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 为霉酚酸酯的血液水平.对2周短免疫期的霉酚酸酯的槽血水平和分范围进行了分析。误差线表示分范围。请单击此处查看此图的较大版本.
尽管两周后停止免疫抑制, 在不同时间点 (2、4、6、10和16周) 的放射治疗右后肢体的 x 射线显示, 渐进性骨愈合的研究期间, 16 周时, 评分两个独立的和盲的观察器 (图 5)27,28。16th周的微 CT 分析用于量化骨痂的体积和密度, 以及在宿主/骨 VCA 接合处和骨 VCA 移植出现的骨骼形成,27。由新的自体血液供应促进的内部固定的维护, 不用减少损失或丢失, 可以证明28。骨愈合是在所有胫骨 (图 6) 中实现的。
图 5:骨愈合进展超过16周.为确定骨愈合进展, 采用了非线性回归模型。值 R2用于定义模型与数据的匹配。使用评分系统, 基于前后和横向射线照相骨骨 VCA 入节段性骨缺损在研究期间 (2、4、6、10和16周) 的不同时间点的最高值为25分, 由两独立和盲观察器30,31。非线性回归模型描述了研究期间骨愈合值的中值和分范围 (R2 = 0.931), 显示了连续的骨愈合进展, 其价值接近于16周的25。误差线表示分范围。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 三维重建猪胫骨骨干在微计算机断层扫描后的评价.有代表性的三维重建胫骨内板固定在2x 实际大小的图像。在16周的完整愈合后胫骨骨 VCAs 与外科血管生成显示。请单击此处查看此图的较大版本.
苏木精-曙红脱染色切片的组织学分析使用先前描述的比例分级排斥 (无, 轻度, 中度和严重) 没有发现严重排斥的迹象, 由此轻微和适度的拒绝迹象可以演示了三只猪 (图 7)29。
图 7:来自胫骨 VCA 的水平苏木素-曙红染色切片的代表性图像显影硅溶液填充的容器显示为褐色 (星号)。轻度内浸润和反应 (粗箭头) 是看到与超过三分之二的缺陷填充骨 (小箭头) 按照可行的骨骼。10X 放大倍数。缩放栏 = 300 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
移植同种异体骨 (骨 VCA) 可能代表未来的重建选择大节段性骨缺损。然而, 需要长期免疫抑制 (是) 和它的重要副作用的骨骼 VCA 生存是很难证明这些寿险关键应用程序6。
虽然实验鼠的自交系在同种异体移植研究中被广泛应用, 以测试避免长期免疫抑制的各种方法, 但猪模型可能会提供显著的优势8,9.尤卡坦半岛迷你猪是研究骨 VCA 排斥反应复杂过程的理想选择。从生理学上来说, 新的骨形成率与人 (猪 1.2-1.5 µm 每天; 人 1.0-1.5 µm 每天分别)32。解剖学上的相似性使使用基本相同的外科植入物和技术的原位骨重建。也许最重要的是, 定义明确的猪 alloresponse--在猪细胞因子检测和 anti-porcine 簇分化抗体的发展中取得了可能--使得这种和其他 VCA 研究更加严格33。
与任何类似的临床应用一样, 用骨 VCA 修复猪胫骨骨缺损的方法在技术上要求很高, 需要两个团队的方法, 在微血管手术和骨重建方面有足够的外科专业知识, 以实现可重现的结果。严格维护无菌术中的条件和围手术期的抗生素预防, 是减少感染并发症的风险。
在以前的研究中使用大鼠和兔短期是维持生存的血管化骨 allotransplants 在前2周通过灌注的骨 VCA 通过其异体营养血管。免疫抑制剂后, 在髓管内的受体衍生血管提供了新生血管, 允许长期骨 VCA 愈合和生存能力10,11,12。在研究端点, 可以检测到大量的移植嵌34,35,36。我们已经向前迈进, 并应用了我们的鼠和兔模型的行之有效的方法。这种模型是可行的, 以测试一种新的方法, 以维持组织的生存能力, 而不是长期在骨 VCA 研究, 使用自体血管的血管生成与短期结合, 有效地切换骨循环异基因的自生血管。
这个模型的主要优势, 在其他现有的猪骨含有 VCA 模型是它的原位设计, 使功能评估的重量轴承和评估的机械性能, 特别是稀疏的数据14,37. 通过对 allotransplanted 胫骨骨段的影像学和组织学评价以及外周血的分子生物学分析, 可以很容易地监测局部和全身性骨 VCA 排斥反应的复杂机制。最终, 低发病率的手术骨 VCA 程序, 使长期骨 VCA 生存和分析。
稳定的内固定, 正确的同种异体胫骨骨段并列和肢体对齐是至关重要的, 允许在第一天后, 猪的移动和需要仔细前规划。我们所选择的方法, 使用专门设计的切割夹具, 精确和可再生的骨切除结合钢板内固定是足够稳定的允许僵硬的 allotransplants, 即使在那些最小的大小不匹配。
所提出的技术的一个限制是, 它不允许评估不同的组织成分的皮肤和肌肉除了血管化的骨成分。虽然包括不同组织成分的复合皮瓣是可能的, 该模型的目的是研究独特的同种异体骨移植作为各种 VCA 组织 compontents 的免疫原性不同的38。
最后, 本文提供的信息, 建立一个可再生的大动物模型与定义遗传学的骨 VCA 研究。该模型可作为未来研究的基础, 调查血管生成对骨血流和骨重塑的影响, 并可能消除长期免疫抑制的需要。此外, 它可用于描述骨 VCA 排斥的复杂过程, 并测试其他创新免疫调节策略。定义的 SLA-型和定量的 SRY 基因在性别不匹配的猪可以允许确定的程度嵌的移植和外周血。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
作者感谢媒体支持服务部, 梅奥诊所罗切斯特, 视频制作的锰, 以及伊亚 Kotsougianis 的视频编辑。优秀的艺术品是由吉姆 Postier, 罗切斯特, 锰。此外, 作者希望感谢德国研究基金会 (德意志 Forschungsgemeinschaft) 为 Dr. Dimitra Kotsougiani (DFG 补助金: KO 4903/1-1) 提供薪资支持。这项工作得到了来自苏拉亚·奥贝德的慷慨馈赠的支持。这项工作是在微血管研究实验室, 骨科手术部梅奥诊所罗切斯特, 锰。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
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