Summary
Şu anda bozukluklarına bileşik allotransplantation her türlü uzun-vadeli-immünosupresyon, hayat kritik olmayan endikasyonları desteklemek zor bağlıdır. Biz kemik VCA çalışma ve kemik canlılığı uzun süreli bağışıklık modülasyonu, gerek kalmadan korumak için cerrahi angiogenez kullanımını göstermek için kullanılan yeni bir domuz tibial VCA modeli mevcut.
Abstract
Travma, enfeksiyon malignite ve konjenital anomali kaynaklanan segmental kemik kaybı büyük bir estetik sorun kalır. Geçerli tedavi olanakları önemli hata ve önemli morbidite riski var.
Kemik kullanımı skarların bileşik allotransplantation (VCA) rezeke kemik boyutu ve şekli ve şifa ve yaşam kemik potansiyelini remodeling her iki yakın bir eşleşme sunmak. Şu anda, ömür boyu ilaç immünosupresyon (IS) gereklidir. Organ toksisite, fırsatçı enfeksiyon ve neoplazma riskleri böyle ölümcül belirtiler tedavi etmek için endişe vardır.
Biz daha önce kemik ve eklem VCA canlılığı fare ve tavşan, uzun vadeli immünosupresyon gerek kalmadan implantasyon VCA içinde alıcı türetilmiş gemilerin tarafından bulundurulmasını göstermiştir. Otojen, bir neoangiogenic kan dolaşımı ölçülebilir akışını ve remodeling, IS sadece 2 hafta gerektiren etkin kemik oluşturur. Küçük hayvan anatomisi, kemik fizyolojisi ve İmmünoloji önemli ölçüde erkekte farklı olarak, bu teknik klinik uygulama üstlenilen önce değerlendirmek için domuz kemik VCA modeli geliştirdik. Minyatür domuz allotransplantation araştırma, onların immünolojik, anatomik, fizyolojik ve boyut benzerlikler adama verilen şu anda yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, yeni bir domuz orthotopic tibial kemik VCA canlılığı korumak için otojen cerrahi angiogenez rolünü sınamak için VCA modeli açıklar.
Allojeneik tibial kemik parçaları, boyutu ve şekli eşleşen kullanarak modeli yeniden yapılandırır segmental tibial kemik defektleri arasında büyük bir domuz lökosit antijen (SLA) uyuşmazlıkla Yucatan minyatür domuz nakledilmektedir. Besin gemi onarım ve alıcı türetilmiş otojen damarları implantasyonu allojeneik tibial kemik parçaları medüller kanal içine aynı anda kısa vadeli IS ile birlikte gerçekleştirilir. Bu kısa bir süre için allojeneik besin gemiler ile akışı korumak implante dokusundan geliştirmek için bir neoangiogenic otojen dolaşım izin verir. Kez kurulan yeni otojen dolaşım ilaç tedavisi ve sonraki besin damarı trombozu kesilmesi takip kemik canlılığı tutar.
Introduction
Büyük segmental kemik defektleri sonucu travma, enfeksiyon veya uzuv sparing cerrahi malignite sonra. Geçerli Rekonstrüktif seçenekleri bozukluklarına otojen kemik grefti, kemik aktarımı, protez değiştirme ve cryopreserved nekrotik allogrefler gibi tek başına kullanılan veya birlikte, önemli morbidite ile ilişkili olan ve yüksek oranda var komplikasyonlar1,2,3.
Mikrovasküler ağ varlığı oluşumu ve homeostasis kemik, Osteojenik destekleyen, chondrogenic ve Mezenkimal kök hücrelerin kemik onarım4için gerekli gereklidir.
Yaşam allojenik kemik, onun besin Transpediküler mikrocerrahi anastomoz ile gerçekleştirilen bozukluklarına kompozit doku allotransplantation (kemik VCA), bir tür nakli gelecekteki bir Rekonstrüktif alternatif temsil edebilir. Cryopreserved allojenik kemik gibi yakından Kemik defekti Morfoloji eşleştirerek hemen istikrar sağlanmıştır. Gelişmiş şifa ve yaşam remodeling sağladığı gibi otojen greft bozukluklarına, kemik doku. Herhangi bir allotransplant yordamdaki engel uzun-vadeli-immünosupresyon (IS) ihtiyaç kalmıştı. Uyuşturucu doz 2 - 3 kere5organ nakilleri daha büyük gerektiren kas-iskelet dokularda daha ciddi bir sorundur. Eşlik eden riskleri organ toksisite, malignite, enfeksiyon veya graft - versus - host hastalığı gelişimi de dahil olmak üzere bu nonlife kritik uygulamalar6' haklı zordur. Ancak, akut ve kronik ret bölümlerini geçerli uzun vadeli IS7ile önemli bir sorun olarak kalır. Yakından MHC antijenleri maç, donör özgü tolerans ikna etmek ve/veya uyuşturucu immünoterapi geliştirmek için sürekli çaba değil henüz düzenli olarak başarılı klinik uyuşturucu ücretsiz doku hayatta kalma8,9erişimine izin verme.
Biz daha önce kemik VCA canlılığı korumak ve Transplante kemik içinde yeni bir otojen dolaşımını teşvik tarafından küçük hayvan modellerinde remodeling kemik geliştirmek için yol gösterdi. Bu implant otojen doku10,11,12den cerrahi angiogenez ek kullanımı ile yapılır. Allojenik kemik parçaları microsurgically besin kemik segment Transpediküler anastomoz ile nakledilmektedir. Ayrıca ana bilgisayar kaynaklı damarları allojeneik bozukluklarına kemik parçasının medüller kanal implante edilir. Bu 2 haftalık süreçte a_ılabilinirse allojeneik besin geminin uyuşturucu immünosupresyon ile korunur. Is-çekilme sonra besin Transpediküler sonunda thrombose13olacaktır. Ana bilgisayar kaynaklı damarları dayalı yeni kapiller yatak doku canlılığı korumak için yeterli kan dolaşımı sağlar. Şifa ve remodeling kemik osteogenesis beri geliştirilmiştir ve anjiogenezi eşleşmiş10,11,12vardır. Yok daha da immünoterapi gereklidir ve kemik canlılığı uzun vadeli bir immunologically yetkili ana bilgisayar ve donör özgü tolerans yokluğu rağmen korunur.
Çeviri kemik allotransplantation klinik uygulamaya bu yeni yöntemin en iyi şifa, mekanik özellikleri ve İmmünoloji büyük bir hayvan modelinde daha fazla çalışma tarafından öncesinde. Domuz modeli böyle VCA araştırma14,15,16için idealdir. Minyatür domuz iskelet imar temelde aynı cerrahi implantlar ve teknikleri kullanarak sağlayan adam için boyutu ve anatomi karşılaştırılabilir. Domuz İmmünoloji iyi tanımlanmış domuz lökosit antijen (SLA) haplotypes ve kan nakli ameliyatı için gereken türler de dahil olmak üzere. Detaylı analizler bağışıklık yanıtı17,18,19,20,21olarak hücre lineage çalışmalar seks eşleşmeyen nakli ile mümkün vardır.
Burada, Yucatan minyatür domuz, gelen bir segmental kemik kaybı ve yeniden yapılanma çalışması için uygun bir kemik VCA allotransplantation modelinde açıklayın. Bu model cerrahi angiogenez etkileşimi araştırmak için kullanılabilir ve kısa vadeli IS üzerinde kemik VCA hayatta kalma ve fonksiyonu, osteocyte soy, dahil olmak üzere kan akımı, şifa ve kapasiteleri, alloresponsiveness ve biyomekanik olarak için de remodeling kemik diğer yenilikçi immün düzenleyici stratejileri test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Mayo Clinic Rochester tarafından kabul edildi. Yucatan minyatür domuz bağış ve alıcıların bu VCA ameliyat sırasında hizmet. Donör ve alıcı eşleştirme SLA 22,23yılında büyük bir uyumsuzluk emin olmak için DNA dizisi domuz lökosit antijen (SLA) haplotyping üzerine dayanıyordu. Hayvanlar ve aynı kan grubu yaş ve ağırlığı eşleştirdi. İki cerrahi ekip aynı anda bir domuz tibial kemik kesimi donörden besin onun gemi ile hasat ve alıcının allojeneik tibial kemik orthopically yerleştirilen parça almak için hazır. Aynı anda ile mikrovasküler onarım kemik besin geminin otojen angiogenez için tibial segmentteki bir alıcı kaynaklı arteriyovenöz bohça yerleştirildi.
1. presurgical hazırlıkları
- Yucatan minyatür domuz gün önce yordamı hızlı ve kontrollü ilaç idaresi için tartmak.
- Subkutan uygulandı kullanan kişi hayvanlar Xylazine (2 mg/kg) ve tiletamine HCL ve zolazepam HCL (5 mg/kg) kombinasyonu ile.
- İntravenöz ilaç ve serum fizyolojik teslimat için bir kulak ven periferik bir kateter yerleştirin ve buprenorfin (0,18 mg/kg) ve profilaktik antibiyotik (1 g cefazoline Intravenous ve 5 mg/kg ceftiofur kas içi) yönetmek.
- Doğru hindlimb ve hasat site bozukluklarına tibial kemik segment ve merkezi Venöz kateter yerleştirilmesi için site için sırasıyla görevi görecek sol boyun tıraş.
- Hayati belirtileri ve sedasyon düzeyi ağız kas gevşeme test ederek kontrol edin.
- Sternal recumbency24uygun ölçekli bir endotrakeal tüpte hayvanla Tüp takacağım.
- Minyatür domuz işlem tablosuna transfer ve Solunum makinesine anestezi açısından isoflurane (1-%3) yönetmek olarak bağlanın.
- Anestezi derinliği palpebral, gözbebeği ışık ve kornea refleksleri test ederek onaylayın.
- Kulağa bağlı bir nabız oksimetre iletim sonda ile oksijen doygunluğu izlemek. Kan basıncı manşet ve sıcaklık probu intraoperatif hayati işareti izlemek için kullanın.
- Yucatan minyatür domuz ısınma bir yastık üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Ayrıca, zorla-hava ısınma battaniye işlem sırasında hipotermi engellemek için kullanın.
- Veteriner merhem gözünü kuruluk anestezi iken altında engellemek için kullanın.
2. hasat bir bozukluklarına Tibial kemik parçasının
- Sağ bacak her minyatür domuz povidone-iyot solüsyonu ile yıkayın. Steril bir havlu ile cilt kuru ve ekstremite steril bir biçimde asmak. Örtmek ve bulaşma riskini en aza indirmek için bir iyot emdirilmiş yapışkanlı kesi örtüsü ile bacak yalıtır.
- Bir kesi ile bir neşter anterolaterally klemple tibiotalar eklem tibia ön sırt boyunca uzanan diz eklemi başlayan hindlimb, gerçekleştirin.
- Deri ve subkutan doku makasla teşrih ve ön bölme kasları tibia dan yanal geri çek.
Not: Yayın tibialis anterior kas kökenli pozlama kolaylaştırır. İnterosseöz membran şimdi maruz kalmaktadır. - Kafatası tibial arter tanımlamak ve (daha sonra arteriyovenöz paket cerrahi angiogenez için kullanılmak üzere) damar.
Not: Kafatası tibial arter ve ven interosseöz membran ön yüzeyinde yalan. - Operatif görüş alanı artırmak için onun ekleme gelen tibial ön kas bir bölümünden yayın ve tibial ridge bir parçası salınan bir testere kullanarak kaldırın.
- Kafatası tibial gemileri korumak, bir makas ile tibial tubercle düzeyini interosseöz membran başında deşmek.
- Klemple membran altında çalışan Kaudal tibial gemiler, gözünde canlandır.
Not: Onlar kafatası tibial gemileri şube ve tibial diaphysis tubercle için sadece distal besin Transpediküler ortaya çıkmasına. Şimdi besin deliği ve tibial tubercle arka lateral yüzeyi sadece distal tibia girerek damarları görselleştirmek mümkündür. - Bir microclamp ile besin Transpediküler etiketleyin. Vasküler Transpediküler ayırmaz.
- Bir kas şube besin deliği yakınındaki anterior tibial bölmesinde tanımlamak; Bu bozukluklarına kemik allotransplant besin gemisine anastomoz için kullanılabilir. Kas dalı bir microclamp ile işaretleyin.
-
Vasküler Transpediküler dahil olmak üzere bir 3,5 cm tibial kemik parçasının hasat.
- Bir kesme jig kesin ve tekrarlanabilir kemik rezeksiyonu emin olmak için kullanın. Konumu ve düzeltme kesme besin deliği ve gemiler dahil etmek için tibia medial yüzeye jig.
- Jig tarafından yönlendirilen, paralel kemik keser bir 3,5 cm tibial kesimi kaldırmak için salınan bir testereyle gerçekleştirin. Aynı konumlandırma ve jig donör ve alıcı hayvanlar için boyut ve şekil eşleştirme en üst düzeye çıkarmak için kullanın.
- Bir kesme jig kesin ve tekrarlanabilir kemik rezeksiyonu emin olmak için kullanın. Konumu ve düzeltme kesme besin deliği ve gemiler dahil etmek için tibia medial yüzeye jig.
- Her iki kesim ile salınan testerenin yapıldıktan sonra tibial kemik parçasının arka yüzeyi besin Transpediküler görselleştirmek döndürün. Kafatası tibial arter üzerinden Aslına, besin Transpediküler makasla bölün. İncelemek ve makas ile kesme yüzeyinde ince bir manşet kas ve kapaklarini bırakarak, tibial segment ücretsiz.
- Tibial kemik segment geri çekmek ve kafatası tibial arter yerinde bırakarak keskin bir kelepçe ile onun vasküler Transpediküler tibial kemik segment yükseltmek.
Not: Şimdi bozukluklarına kemik segment mikrovasküler nakil için hazır ve bir 3.5 cm tibial Kemik defekti her Yucatan minyatür domuz oluşturuldu. - Kafatası tibial damarları absorbe polyglactin ayak bileğine, 3-0 dikişler, onları Perivasküler doku arteriyovenöz (AV) paket oluşturmak için bir manşet ile serbest ligate. Dikiş en az 5 cm uzunluğunda hafifletmek implantasyonu tibial kemik segment içine bırakın.
3. Orthotopic Tibial kemik VCA imar cerrahi angiogenez ile birlikte
-
Onları VCAs kemik gibi kullanmak için iki hayvan arasında onun besin vertebral ile hasat tibial kemik parçaları değiş tokuş.
- Kafatası tibial arteriyovenöz (AV) paket geçiş tibial kemik segmentine izin için salınan testerenin kullanarak proksimal kavşak sitesi segmentten şeklinde V kaldırın.
- Distal kesiminde tibial Kemik defekti site ve tibial kemik parçasının medüller kanal içine 0.5 cm çapında bir delik delme ve sonraki teşvik etmek intramedullary kanala klemple, bakmaksızın alıcı AV paket tanıtmak otojen yeni kan akımı.
-
Bozukluklarına tibial kemik segment orthotopically alıcı defekt yerleştirin.
- Besin Transpediküler tibial ön bölmenin basit kesintiye uğramış dikiş tekniği ve 9-0 dikişler25bir bitiş için son şekilde kullanılarak hazırlanan kas dalı tibial kemik parçasının anastomose.
- Sağım test26kullanarak mikrovasküler anastomoz a_ılabilinirse onaylayın.
-
Karşılaştırılan bir 9 delikli 3.5 tabağı kilitleme mm kullanarak elde.
- 9 delikli plaka üzerinde tibia anteromedially yerleştirin. Plaka üzerinde ve tibial kemik segment altında üç bicortical vida ile düzeltmek. Ayrıca, internal fiksasyon için tibial kemik kesim unicortical vidaları yerleştirin. Onaylamak için doğru kemiğin konumlandırma VCA ve plaka, kullanın hastanın ve yanal ilerlemenin.
- FASİAL gerçekleştirmek ve katmanlı cilt kapatma kullanarak 3-0 ve 2-0 absorbe dikiş kesildi. Sonunda bir tıkayıcı şeffaf soyunma yarayla kapatın.
4. Merkezi Venöz kateter yerleştirme Şah dış ven
-
Ameliyat sonrası ilaç idaresi ve immünsupresif (IS) uyuşturucu düzey izleme için bir Venöz kateter açık bir tekniği kullanarak dış juguler ven yerleştirin. Yerleştirme anestezi (bakınız Bölüm 1) altında allotransplantation yordamının sonuç olarak gerçekleştirin.
- Anterolateral kesik bir neşter ile boyun gerçekleştirin. Subkutan doku makasla teşrih ve sol juguler ven bulaşmasına neden.
- Dış juguler ven içinde küçük bir delikten juguler ven Hickman kateteri yerleştirin ve absorbe olmayan dikiş ile sabitleyin. Arkadaki kateter subkutan tünel oluşturarak exteriorize.
- Kateter yerde cilt için güvenli ve yakın 3-0 ve 2-0 absorbe dikiş kullanarak katmanları boynundan kesildi.
- Tıkayıcı bandaj kesi yerleştirin. Bir File bandaj bandaj ve kateter tutmak için kullanın.
5. Postoperatif tedavi ve takip
- Ameliyattan hemen sonra Yucatan minyatür domuz carprofen (4 mg/kg) ameliyat sonrası analjezi için bir kas içi enjeksiyon ile tedavi. Gerektiği gibi yüksek şiddette ağrı tedavisinde buprenorfin (0,18 mg/kg) yönetmek için.
- Domuz 60 dk için yeniden elde etmek ve daha sonra domuz özel yoğun bakım ünitesi pan ve monitör yakından kadar tam kurtarma dönmek izin.
- Yucatan minyatür domuz için normal bir kafes ve ad libitum erişebilmesi için su ve yiyecek taşımak.
- Kafesi yönetmek (0,8-1.5 mg/kg/gün) ve mycophenolate mofetil (MMF) (50-70 mg/kg/gün) sözlü olarak ve Metilprednizolon sodyum süksinat intravenöz (500 mg/gün ile başlayan) iki hafta için.
- İmmünsupresif ilaçlar 5.0-30.0 ng/mL için amaçlayan yalak kan düzeylerine göre günlük doz ayarlamakkafesi ve 1.0-3.5 µg/mL MMF için için sırasıyla. İdame dozu günde 50 mg ulaşılana kadar Metilprednizolon dozunu kademeli olarak azaltmak.
- Profilaktik antibiyotik gentamisin yönetmek (3 mg/kg intravenöz) ve ceftiofur (5 mg/kg İntramüsküler) iki hafta için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan tekniği dört SLA büyük eşleşmeyen Yucatan minyatür domuz ve tibial VCA boyutu eşlemeli kullanarak yeniden gelen bir segmental tibial kusurları başarıyla gerçekleştirildi. Kemik allotransplant eşzamanlı besin gemi tamiri ve implantasyon allotransplant medüller kanal içinde alıcı hayvandan bir AV paket hemen kemik dolaşım ve gelişimi yeni bir otojen kan akımı izin zaman (şekil 1). 16 haftalıkken neoangiogenic dolaşım tüm tibial VCAs, Radyoopak Anjiyografik polimer (125 ml) femoral damarlarının içine enjeksiyon ve incelemelerine, sonra mikro bilgisayarlı tomografik (mikro-CT) anjiyografi tarafından görüntülenmiştir içinde kurulmuş tibial VCA (Şekil 2).
Resim 1 : Orthotopic tibial kemik VCA yordam. Cerrahi işlem gösteren şekil. (A)donör yordamı: hasat tibial kemik parçasının onun besin Transpediküler ile. (B) değişimi tibial kemik kesimleri arasında büyük SLA domuz uyumsuz. (C) alıcı yordamı: arteriyovenöz paket implantasyon: kafatası tibial damarları dikkatle medüller kanal eklenmiş. (D) anterior tibial Osteosentez tibial diaphysis, bölme ve plaka kas dalı besin Transpediküler mikrovasküler anastomoz. Tıbbi eğitim ve araştırma için Mayo Vakfı'nın izni ile kullanılır. Tüm hakları saklıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Bir decalcified tibial VCA parçasının temsilcisi 3D mikro-CT Anjiyografik görüntü. Neongiogenic dolaşım (sarı ok) sonra perfüzyon Radyoopak silikon çözüm ile tasvir edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Minyatür domuz sıkıntı veya kendi kendine sünneti belirtisi gösterdi. Enfeksiyon ve hayvanların normal ambulated, sonuçta ilk ameliyat sonrası günden beri ayı işletilen sağ bacak üzerinde tam ağırlığı mümkün olmadan tüm yaraları iyileşti. 16th haftalık çalışma uç noktada tüm Yucatan minyatür domuz üzerinde onların orijinal vücut ağırlığının % 150 kazandı (pretransplant: 56.0 ± 6,1 16 hafta posttransplant karşı: 84,5 ± 6.0).
Kafesi oluşan immünosupresyon, iki hafta kadar yeni bir otojen kan akımı allojeneik içinde kurulmuş besin Transpediküler yoluyla kan akışını korumak için mycophenolate mofetil (MMF) ve Metilprednizolon süksinat kullanılmıştır kemik allotransplant. 2 hafta boyunca ilaç kan düzeylerini değerlendirmek için Şah kateter immünosupresyon periyodik kan örnekleri alınmıştır. Doz 1-3,5 µg/ml için MMF (Tablo 1) ve 5-30 ng/ml kafesi için yalak kan seviyesini korumak için ayarlandı. Hiç uyuşturucu ile ilgili komplikasyonlar oluştu ve yalak düzeyleri kafesi için amaçlı ve mycophenolate mofetil (şekil 3 ve şekil 4) elde olabilir.
| Baskılayıcı | İlk doz | Yalak düzeyleri | İdame dozu |
| Kafesi | 0,8-1.5 mg/kg/gün | 5-30 ng/ml | |
| Mycophenolate Mofetil | 50-70 mg/kg/gün | 1-3 µg/ml | |
| Metilprednizolon sodyum süksinat | 500 mg | 50 mg |
Tablo 1: kısa vadeli immünosupresyon protokolü. Tasvir immünsüpresif ilk 2 hafta için başlangıç dozu ile yazı ekimi kafesi, Mycophenolate mofetil ve prednizolon için iletişim kuralıdır. Ayrıca amaçlı yalak düzeyleri kafesi ve Mycophenolate mofetil ve prednizolon idame dozu için gösterilir.
Şekil 3 : Yalak kan düzeyleri kafesi için. Medyan ve kafesi için elde yalak seviyeleri üzerine ilk 2 hafta sonrası nakli interquartile dizi tasvir edilmektedir. Hata çubukları interquartile aralığı belirtmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Yalak kan düzeyleri için Mycophenolate mofetil. Medyan ve interquartile Mycophenolate mofetil 2 hafta kısa vadeli bağışıklık süre yalak kan düzeyleri yelpazesi gösterilir. Hata çubukları interquartile aralığı belirtmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
İki hafta sonra immünosupresyon kesilmesi rağmen işletilen sağ arka bacak x-ışınları ile (2, 4, 6, 10 ve 16 hafta) farklı zaman noktasındaki periyodik radyolojik değerlendirme ilerici kemik üzerinde çalışma şifa ortaya 16 hafta dönem tarafından kademeli iki bağımsız ve kör gözlemci (şekil 5)27,28. 16th hafta mikro-CT analiz birimi ve yoğunluk Kallus hem kemik oluşumunu ana bilgisayar/kemik VCA kavşaklar ve kemik VCA allotransplant görünüm27köprüleme ölçmek için kullanıldı. Azaltma veya kaybetmek, kaybı olmadan internal fiksasyon bakımından yeni otojen kan akımı tarafından terfi, gösterdiği28olabilir. Kemik Birliği tüm yırtılmalarıteşhis (şekil 6) elde edildi.
Şekil 5: Şifa ilerleme 16 hafta boyunca kemik. İlerleme bir doğrusal olmayan regresyon modeli şifa kemik belirlemek için kullanılmıştır. Değer R2 model uyum için veri belirlemek için kullanılmıştır. Hastanın ve lateral ilerlemenin VCA segmental Kemik defekti içine atan oldu kemik osseointegration farklı zamanda 25 puan en fazla değeri çalışma döneminde (2, 4, 6, 10 ve 16 hafta) tarafından iki puan üzerinde tabanlı bir skorlama sistemi kullanılarak bağımsız ve kör gözlemciler30,31. Doğrusal olmayan regresyon model medyan ve interquartile aralığı değerleri çalışma dönemi boyunca şifa kemik için tasvir (R2 0.931 =) 25 değeri 16 haftalıkken yaklaşıldığıdır ilerleme şifa sürekli kemik gösterilen. Hata çubukları interquartile aralığı belirtmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Domuz tibial diaphysis üç boyutlu rekonstrüksiyon mikro bilgisayarlı tomografik değerlendirme sonra. Temsilcisi üç boyutlu görüntü yeniden oluşturulan Tibia iç plaka fiksasyon 2 x gerçek boyutu ile hesaplanır. Tibial kemik VCAs cerrahi angiogenez ile gösterilir sonra 16 haftalıkken Birliği tamamlayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ret (yok, hafif, orta ve şiddetli) sınıflandırma yukarıda açıklanan bir ölçek kullanma bölümlerine, lekeli Hematoksilen-Eozin undecalcified histolojik analizine şiddetli ret, mademki ret hafif ve orta belirtileri olabilir belirtisi ortaya üç domuz (Şekil 7)29gösterdi.
Şekil 7: Yatay bir Hematoksilen-Eozin temsilcisi görüntüsünü lekeli tibial VCA bölümünden. Radyoopak silikon çözüm dolu gemileri brown (yıldız işareti) görüntülenir. Hafif endosteal infiltrasyon ve reaksiyon (kalın ok) osteocytes (küçük ok) uygun olarak uygun kemik dolu lacunas üçte ile görülür. 10 X büyütme. Ölçek çubuğu 300 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bozukluklarına allojenik kemik (kemik VCA) nakli büyük segmental kemik defektleri için gelecek bir Rekonstrüktif seçenek temsil edebilir. Ancak, uzun-vadeli-immünosupresyon (IS) ihtiyaç ve kemik VCA hayatta kalmak için gerekli önemli yan etkileri bu nonlife kritik uygulamalar6' haklı zordur.
Her ne kadar laboratuvar sıçan doğuştan suşları yoğun allotransplantation araştırma uzun vadeli immünosupresyon mahal vermemek için çeşitli yaklaşımlar sınamak için kullanılmıştır, domuz modelleri önemli avantajlar8,9 sağlayabilir . Yucatan mini domuz kemik VCA ret karmaşık süreci çalışma için idealdir. Fizyolojik açıdan, yeni kemik oluşumu oranı adam için karşılaştırılabilir (domuz 1.2-1,5 µm günde; insanlar 1,0-1,5 µm günlük sırasıyla)32. Anatomik benzerlikler temelde aynı cerrahi implantlar ve teknikleri kullanarak orthotopic kemik yeniden kullanımını etkinleştirin. Belki de en önemlisi, iyi tanımlanmış domuz alloresponse-domuz sitokin algılama ve farklılaşma Anti-domuz küme gelişimi ilerleme tarafından yapılan mümkün antikor-yapar bu ve diğer VCA daha titiz33çalışmalar.
Olduğu gibi herhangi bir benzer klinik uygulama, domuz tibial Kemik defekti imar VCA teknik olarak talep ediyor, kemik kullanarak yöntemi gerektiren bir iki yaklaşım mikrovasküler cerrahi yeterli cerrahi uzmanlığı ile takım ve yeniden yapılanma için kemik tekrarlanabilir sonuçlar elde edin. Steril ameliyat sırasındaki koşullar ve perioperatif antibiyotik profilaksi sıkı bakım bulaşıcı komplikasyonlar riskini azaltmak için zorunlu.
Fare ve tavşan kullanarak önceki çalışmalarda kısa vadeli IS bozukluklarına kemik allotransplants perfüzyon allojeneik onun besin damar yoluyla VCA kemiğin üzerinden ilk 2 hafta içinde canlılık yapılmaktadır. İmmünosupresyon çekilme alıcı damarları içinde elde sonra medüller kanal uzun vadeli kemik VCA şifa sağlayan neovaskülarizasyon ve canlılığı10,11,12sağlanan. Çalışma uç noktada önemli allotransplant chimerism tespit edilen34,35,36olabilir. Biz ileriye taşındı ve fare ve tavşan köklü metodolojimiz domuz modelinde uygulanmış. Bu model doku canlılığı kemik VCA araştırmada, uzun vadeli IS cerrahi angiogenez implante otojen gemiler kısa vadeli IS, etkili bir şekilde kemik dolaşımdan geçiş ile birlikte kullanarak olmadan korumak için yeni bir araç test etmek mümkün olduğunu otojen damarları allojeneik.
VCA modelleri içeren diğer mevcut domuz kemik üzerinde büyük bir avantaj bu modelin ağırlık taşıyan işlevsel değerlendirilmesi ve mekanik özellikleri, özellikle seyrek14, olan veri değerlendirilmesi olanaklı kılmak onun orthotopic tasarımım 37. yerel ve sistemik kemik VCA ret karmaşık mekanizması kolayca periferik kan moleküler biyolojik analiz yanı sıra radyolojik ve histolojik değerlendirme allotransplanted tibial kemik parçasının izlenebilir. Sonuçta cerrahi kemik VCA yordamı düşük morbidite uzun vadeli kemik VCA hayatta kalma ve çözümlemesi sağlar.
İstikrarlı internal fiksasyon, uygun allojeneik tibial kemik segment appozisyon ve uzuv hizalama domuzlar ambulation ameliyat sonrası ilk günü izin ve dikkatli presurgical planlama gerektirir için çok önemli. Plaka Osteosentez ile kombine hassas ve tekrarlanabilir kemik rezeksiyonu için özel tasarlanmış kesme jig kullanarak seçtiğiniz en az boyutu uyuşmazlığı olanlar içinde bile allotransplants rijit fiksasyonu izin için yeterince kararlı yöntemidir.
Bir sunulan teknik olarak cilt ve kas bozukluklarına kemik bileşeni yanı sıra farklı doku bileşenlerinin değerlendirme izin vermez kısıtlamasıdır. Farklı doku bileşenleri de dahil olmak üzere bir kompozit kapak mümkün olmakla birlikte, bu model çalışma çeşitli VCA doku compontents immünojenisite38değişir gibi özel kemik allotransplantation için dizayn edilmiştir.
Sonuç olarak, bu makalede bir tekrarlanabilir büyük hayvan modeli ile kemik VCA araştırma için tanımlanmış genetik oluşturma hakkında bilgi sağlar. Bu model kemik kan akımı ve kemik remodeling cerrahi angiogenez olan etkisinin araştırılması gelecekteki çalışmaları için temel olarak hizmet verebilir ve uzun vadeli immünosupresyon ihtiyacı ortadan kaldırmak. Ayrıca kemik VCA ret karmaşık süreci betimlemek ve diğer yenilikçi immün düzenleyici stratejileri test etmek için kullanılabilir. Tanımlı SLA-haplotypes ve seks eşleşmeyen domuzlarda SRY-genlerin miktar tayini allotransplant ve periferik kan chimerism ölçüde izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar bölümü, medya Destek Hizmetleri, Mayo Clinic Rochester, MN video üretimi için yanı sıra Georgios Kotsougianis video düzenleme için teşekkür ederiz. Mükemmel sanat tarafından Jim Postier, Rochester, MN yapılmıştır. Buna ek olarak, yazarlar Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgemeinschaft) teşekkür etmek Dr Dimitra Kotsougiani için maaş desteği sağlamak için istiyorum (DFG grant: KO 4903/1-1). Bu eser Tarek E. Obaid cömert bir hediye tarafından desteklenmiştir. Bu eser mikrovasküler Araştırma Laboratuvarı, bölümü, ortopedik cerrahi Mayo Clinic Rochester, MN gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
References
- Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
- Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
- Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
- Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
- Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
- Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
- Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
- Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
- Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
- Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
- Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
- van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
- Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
- Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
- Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
- Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
- Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
- Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
- Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
- Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
- Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
- Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
- Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
- Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
- Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
- Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).
