Artículo de método

Análisis de la segregación cromosómica, acetilación de histonas y morfología de huso en ovocitos de caballo

DOI:

10.3791/55242

⸱

11 de mayo de 2017

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1Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, 2IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, 3PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, 4PAO, INRA, 5Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, 6University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito describe un enfoque experimental para caracterizar morfológicamente y bioquímicamente ovocitos de caballo. Específicamente, el presente trabajo ilustra cómo recolectar ovocitos de caballo inmaduros y maduros mediante recogida de óvulos guiada por ultrasonido (OPU) y cómo investigar la segregación de cromosomas, morfología de huso, acetilación de histonas globales y expresión de mRNA.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El campo de la reproducción asistida se ha desarrollado para tratar la infertilidad en mujeres, animales de compañía y especies amenazadas. En el caballo, la reproducción asistida también permite la producción de embriones de alto rendimiento sin interrumpir su carrera deportiva y contribuye a un aumento en el número de potros de yeguas de alto valor genético. El presente manuscrito describe los procedimientos utilizados para recolectar ovocitos inmaduros y maduros de ovarios de caballo utilizando la recolección de óvulos (OPU). Estos ovocitos se utilizaron entonces para investigar la incidencia de aneuploidia mediante la adaptación de un protocolo previamente desarrollado en ratones. Específicamente, los cromosomas y los centrómeros de los ovocitos de la metafase II (MII) se marcaron fluorescentemente y se contaron en planos focales secuenciales después de un escaneado con microscopio láser confocal. Este análisis reveló una mayor incidencia en la tasa de aneuploidía cuando ovocitos inmaduros fueron recogidos de los folículos y madurado in vitro en comparación conIn vivo. La inmunotinción para la tubulina y la forma acetilada de la histona cuatro en residuos de lisina específicos también reveló diferencias en la morfología del huso meiótico y en el patrón global de acetilación de las histonas. Por último, la expresión de mRNAs que codifican histonas deacetilasas (HDAC) y acetil-transferasas (HATs) se investigó mediante transcripción inversa y PCR cuantitativa (q-PCR). No se observaron diferencias en la expresión relativa de los transcritos entre ovocitos madurados in vitro e in vivo . De acuerdo con un silenciamiento general de la actividad transcripcional durante la maduración de ovocitos, el análisis de la cantidad total de transcripción sólo puede revelar la estabilidad del ARNm o la degradación. Por lo tanto, estos hallazgos indican que otras regulaciones traslacionales y postraduccionales podrían verse afectadas.

En general, el presente estudio describe un enfoque experimental para caracterizar morfológicamente y bioquímicamente el ovocito de caballo, ceLl tipo que es extremadamente difícil de estudiar debido a la baja disponibilidad de la muestra. Sin embargo, puede ampliar nuestro conocimiento sobre la biología reproductiva y la infertilidad en las especies monovulatorias.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se ha desarrollado una amplia gama de técnicas de reproducción asistida para tratar la infertilidad en mujeres, animales de compañía y especies en peligro de extinción. Uno de los procedimientos más comunes en los contextos clínicos es la recuperación de ovocitos de la fase metafásica II (MII) de los folículos ováricos por aspiración transvaginal guiada por ultrasonido, recolección de óvulos (OPU) 1 . Estos ovocitos son entonces fertilizados in vitro (FIV), con el (los) embrión (es) resultante (s) implantado (s) en un útero receptor. Los ovocitos de fase MII (maduros) se recuperan después de la administración de gonadotropinas exógenas. Sin embargo, este tratamiento se asocia, en algunos pacientes, con el desarrollo del síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO) 2 .

Aprovechando la capacidad intrínseca de los ovocitos inmaduros (GV-etapa) para reanudar espontáneamente la meiosis una vez aislado de sus folículos, es posible obtener ovocitos maduros sin adminisLa gonadotropina 3 . Este procedimiento se denomina maduración in vitro de ovocitos (IVM) y representa un enfoque menos orientado a fármacos, menos costoso y más amigable con el paciente a la tecnología de reproducción asistida. Sin embargo, el éxito del desarrollo embrionario con ovocitos madurados in vitro es generalmente menor que con los ovocitos madurados in vivo 4 , 5 . Una posible explicación es que ovocitos madurados in vitro son más afectados por errores en la segregación cromosómica, y la aneuploidía resultante impide el desarrollo embrionario normal [ 6] .

Entender las bases moleculares de la segregación cromosómica errónea durante la IVM revelaría en última instancia todo el potencial de esta técnica. En este sentido, el enfoque experimental utilizado para investigar las características morfológicas y bioquímicas de los ovocitos madurados in vitro , en comparación con la madurez in vivoEd oocitos se describe aquí 7 , 8 . Específicamente, los procedimientos para la OPU de ovocitos inmaduros y maduros y la IVM de ovocitos inmaduros se ilustran utilizando caballos adultos y de ciclo natural como modelo experimental. Luego, la inmunofluorescencia y el análisis de imágenes se utilizan para investigar la segregación cromosómica, la morfología del huso, y el patrón global de acetilación de histonas en estos gametos. Finalmente, se describe un protocolo de transcripción inversa y PCR cuantitativa para el análisis de la expresión de mRNA.

En comparación con los modelos animales de roedores, los caballos no permiten la manipulación genética, son menos fáciles de manipular y requieren un mantenimiento costoso. Sin embargo, este modelo está ganando interés considerable para el estudio de la maduración de ovocitos 9 , 10 debido a la similitud con la fisiología ovárica humana 11 , 12 </ Sup>. Por otra parte, el desarrollo de protocolos fiables de IVM-IVF en el caballo tiene un interés económico sustancial, ya que permitiría un aumento en el número de potros de yeguas de alto valor genético.

Una de las limitaciones de realizar experimentos en ovocitos, especialmente en especies monovulatorias, es la disponibilidad restringida de muestras. Este límite se ha superado aquí ajustando un enfoque, previamente desarrollado en ratones, a ovocitos de caballo 13 , 14 con el fin de llevar a cabo el recuento de cromosomas que minimiza la pérdida de muestra (véase la discusión para una comparación con otras técnicas disponibles). Además, se ha optimizado un protocolo de tinción con fluorescencia triple para realizar múltiples análisis en la misma muestra, y se realizaron análisis de q-PCR en agrupaciones de 2 oocitos solamente.

En general, el presente estudio describe un enfoque experimental dirigido a morfológicamente y bioquímicamente chaRacterizar el ovocito del caballo, un tipo de célula que es extremadamente difícil de estudiar debido a la baja disponibilidad de la muestra. Sin embargo, puede ampliar nuestro conocimiento de la biología reproductiva y la infertilidad de las especies monovulatorias.

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Protocolo

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Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales CEEA Val de Loire Número 19 y se realizaron de acuerdo con los Principios Rectores para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Recolección de ovocitos y maduración in vitro

  1. Recolección de óvulos
    1. Evaluar diariamente por ultrasonido el diámetro de los folículos ováricos en una cohorte de yeguas adultas. En la aparición de un folículo ≥ 33 mm (folículo dominante), inyectar a la yegua 1.500 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG) en la parte superior de la vena yugular (iv).
      1. Antes de realizar la inyección, limpie el área con alcohol, ubique el surco yugular y coloque el pulgar 2-3 cm bajo el sitio de inyección para inducir la elevación de la vena. Inserte la aguja casi paralela al cuello y aspire para asegurarse de que la aguja está en la vena (la sangre entrará en la jeringa). En este punto, inyecte; HCG inducirá la mActualización del ovocito en el folículo dominante.
    2. 35 h después de la inyección de hCG, sedar la yegua con detomidina (15 μg / kg, iv), tartrato de butorfanol (10 μg / kg, iv) y bromuro de butilscopolamina (0.2-0.3 mg / kg, 15 mL / yegua iv).
    3. Conecte la aguja a la sonda de ultrasonido. Insertar la sonda de ultrasonido por vía vaginal y mantener el ovario transrectal para hacer frente a la sonda de ultrasonido. Instruir a un operador para que maniobre la aguja y el otro para mantener el ovario en su lugar, con el folículo frente a la sonda de ultrasonido . Comience desde el ovario con el folículo dominante.
    4. Perforar la pared vaginal y la pared del folículo dominante con la aguja (las sondas de ultrasonido para OPU están equipadas con un canal para la aguja conectada a un sistema de succión); Será visible en la imagen ecográfica.
    5. Aspirar el líquido folicular en un tubo cónico de 50 mL conectado al sistema de succión. Verter el contenido de la cónicaTubo en una placa de Petri grande y la búsqueda de la cumulus-oocito complejo (COC) utilizando un estereomicroscopio.
    6. Dado que el COC no siempre se recupera con el líquido folicular, enjuague el folículo con solución salina tamponada con fosfato modificada (DPBS) de Dulbecco que contiene 5 UI / ml de heparinato a 37 ° C. Examinar DPBS para la presencia de COC, como se describió anteriormente para el líquido folicular en el paso 1.1.5. Enjuague varias veces hasta que se recupere el COC.
    7. Una vez recuperado el COC del folículo dominante, puntee y limpie los folículos ≥5 y ≤25 mm, como se describe para el folículo dominante en los pasos 1.1.3-1.1.4; Los folículos ≥5 y ≤25 no expresan el receptor de la hormona luteinizante / coriogonadotropina (LHCGR) y, por tanto, sus ovocitos no madurarán en respuesta a la hCG y se recogerán en el estadio GV (inmaduro). Sólo mantenga COCs con varias capas completas de células del cúmulo y de ooplasma marrón finamente granulado. Descarta los otros.
    8. Al final de la OPU, enJect la yegua con bencil-penicilina 15.000 UI / animal para prevenir la infección.
    9. Casa de la yegua en un tranquilo, estable limpio por lo menos 2 h. Compruebe los signos de conciencia mediante la determinación de la posición de los oídos, la reacción a los estímulos ( por ejemplo, el ruido), y la marcha antes de regresar la yegua a la compañía de otros animales.
  2. Maduración in vitro
    1. TCM199 tamponado con HEPES caliente (Hepes 20 mM) suplementado con heparina de 1790 UI / L, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,4%, penicilina y estreptomicina a 37ºC. Prepare este medio por adelantado. Filtrar-esterilizar y mantenerlo a 4 ° C por hasta 6 meses.
    2. Preparar el medio IVM mediante la suplementación de NaHCO3 - tamponado TCM199 (25 mM NaHCO 3 ) con 50 ng / mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y 20% de suero de ternera [ 7] . Use NaHCO 3 -buffered TCM199 dentro de 3 semanas de abrir una nueva botella. Preparar el FCE por adelantado como 100x existencias, congelar a -20 ° C, Y utilizarlo en el plazo de 6 meses. Dispense 500 μL en los pocillos de una placa de 4 pocillos e incube en aire humidificado con 5% de CO 2 a 38,5 ° C durante al menos 2 h.
    3. Después de la recuperación de los COC de los folículos de ≥5 y ≤25 mm, ponerlos en una placa petri (3,5 cm de diámetro) llena con 2 mL de HEPES-TCM199. Mueva los COCs a diferentes áreas del plato para lavar los restos celulares.
    4. Transferir los COC al medio de IVM e incubar durante 28 h en aire humidificado con 5% de CO 2 a 38,5 ° C.

2. Análisis de inmunofluorescencia y de imágenes

  1. Recuento de cromosomas
    1. Después de la recolección del folículo dominante o al final de la IVM, incubar los COC con 100 μ M monastrol durante 1 h en el aire humidificado con 5% de CO 2 a 38,5 ° C. Preparar monastrol por adelantado como 100x existencias y almacenar a -20 ° C por un año.
    2. Eliminar las células cumulusTratándolos con hialuronidasa al 0,5% o pipeteando suavemente; Quitar la zona pelúcida tratándola en 0,2% de pronasa. Preparar la hialuronidasa y la pronasa por adelantado como 10x existencias y almacenarlos a -20 ° C durante un máximo de 1 año.
    3. Fijar los ovocitos en paraformaldehído al 4% en DPBS durante 15 min a 38,5ºC seguido por otros 45 min a 4ºC.
      ¡PRECAUCIÓN! Utilice equipo de protección personal cuando manipule paraformaldehído y deseche los materiales contaminados de acuerdo con las directrices de eliminación de desechos peligrosos.
    4. Lavar los oocitos mediante transferencia secuencial en 3 pocillos rellenos con 500 μl de DPBS suplementado con alcohol polivinílico al 0,1% (PVA). Permeabilizar en Triton X-100 al 0,3% durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
    5. Bloquear la unión no específica mediante incubación en DPBS suplementado con albúmina de suero bovino al 1% (DPBS-1% de BSA) y suero normal de burro al 10% durante al menos 30 minutos a TA. Las muestras se pueden mantener en solución de bloqueo a 4 ° C durante 3-4 días.
    6. Para la tinción primaria, incubar los oocitos en conejo anti-Aurora B fosfo-Thr232 en DPBS suplementado con 1% de BSA (dilución 1:50) a 4 ° C durante la noche.
    7. Lave los ovocitos como se describe en el paso 2.1.4. Incubar los oocitos en una solución de IgG anti-conejo (1: 100 en DPBS-1% de BSA) de burro conjugado con tetra-metilrhodamina (TRITC) durante 1 h a TA en la oscuridad.
    8. Lave los oocitos como se describe en el paso 2.1.4 y luego coloque 3-4 oocitos en una gota de medio de montaje antideslizante sin endurecimiento suplementado con YOPRO1 20 μM en un portaobjetos de vidrio. Repita el procedimiento hasta que todos los ovocitos estén montados (3-4 oocitos por diapositiva).
    9. Deje que los oocitos se asienten durante unos 10 minutos en el medio de montaje y luego cubrirlos con un cubreobjetos. Para evitar el aplastamiento de los ovocitos, aplique dos tiras de cinta de doble cara antes de colocar el cubreobjetos en el portaobjetos de vidrio.
      NOTA: Esta precaución también asegurará que todas las muestras estén igualmente comprimidas entre el vidrio sliDe y el cubreobjetos. Los portaobjetos de vidrio se pueden congelar a -20 ° C y obtener imágenes durante los siguientes 2-3 días.
    10. Imagen de las muestras en un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de 60X utilizando los canales rojo (centromeres) y verde (cromosomas) 7 , 13 , 14 , 20 , 21 . Escanear las muestras que abarcan toda la placa metafásica en el eje z, con pasos cada 0,35 μm. Guarda las imágenes digitalizadas de cada plan.
    11. Cuente los centrómeros en secciones confocales en serie utilizando la función de recuento de células del software NIH ImageJ (disponible en: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
      NOTA: Evite un recuento repetido de centrómeros que aparecen en secciones adyacentes identificando los centrómeros que aparecen, permanecen y desaparecen en secciones secuenciales con un código numérico.
    12. Repita el cromosómico coEn el paso 2.1.11 con un operador independiente.
      NOTA: Clasifique los ovocitos como euploides (32 cromosomas), hiperploides (> 32), o hipoploides (<32).
  2. Morfología del huso y acetilación de las histonas
    1. Después de la recolección del folículo dominante o al final de la IVM, retire las células del cúmulo por tratamiento en hialuronidasa al 0,5% o mediante pipeteo suave, como se describe en el paso 2.1.2.
    2. Lavar los oocitos en DPBS-PVA, como en la etapa 2.1.4, y fijarlos en paraformaldehído al 2,5% durante 20 min a 38 ° C. Lavar a fondo, como se describe en el paso 2.1.4, y permeabilizar en Triton X-100 al 0,1% durante 5 min a RT.
      NOTA: Use equipo de protección personal cuando maneje paraformaldehído y deseche los materiales contaminados de acuerdo con las directrices de eliminación de desechos peligrosos.
    3. Bloquear la unión no específica mediante incubación en DPBS suplementado con 2% de albúmina de suero bovino (DPBS - 2% BSA), 0,05% de saponina y 10% de suero normal de burro foR 2 h a TA.
      NOTA: Las muestras pueden mantenerse en solución de bloqueo a 4 ° C durante 3 - 4 días.
    4. Para la tinción primaria, incubar los oocitos en ratón anti-α-tubulina (1: 150) y conejo anti-acH4K16 (1: 250) en DPBS-2% BSA con 0,05% de saponina a 4 ° C durante la noche.
    5. Lavar los ovocitos como en el paso 2.1.4. Incubar los oocitos en una solución de IgG anti-ratón de burro conjugado con colorante fluorescente verde (1: 500) y IgG anti-conejo conjugado con TRITC (1: 100) en DPBS-BSA al 2% con saponina al 0,05% durante 1 h a RT en la oscuridad.
    6. Lavar los ovocitos como en el paso 2.1.4, y luego colocar 3-4 oocitos en una gota del medio de montaje no endurecible y antideslizante suplementado con 1 μg / mL de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) En una diapositiva de cristal.
    7. Monte los oocitos en los portaobjetos de vidrio como se describe en el paso 2.1.8.
    8. Image las muestras en un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de 60x utilizando los canales rojo (acH4K16), verde (alfa-tubulina) y azul (ADN).
      NOTA: Mantenga los ajustes del láser para los canales rojo y azul constantes durante la adquisición de todas las muestras. Escanear las muestras que abarcan todo el huso meiótico y la placa metafásica en el eje z, con pasos cada 0,35 μm. Guarda las imágenes digitalizadas (planos únicos y la imagen 3D proyectada).
    9. Mida la longitud del husillo polo-polo y el diámetro del husillo a la anchura máxima en la imagen proyectada usando la función de medición del software NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30 .html). Repetir cada 3 veces y calcular la media.
    10. Cuantifique la fluorescencia relativa de acH4K16 utilizando la función de densidad integrada del software NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Normalizar para la densidad integrada de la tinción DAPI.

3. Análisis de la expresión del mRNA

  1. Después de que los COC se hayan recuperado de los folículos de 5 a 25 mm, recoger la célula granulosa sUspensión que permaneció en la placa de Petri y se lavó dos veces en DPBS frío centrifugando a 10.600 xg durante 2 min. Congelación instantánea en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras a -80 ° C durante un máximo de 6 meses; Las células servirán para la curva estándar.
  2. Eliminar con cuidado todas las células del cúmulo, como se describe en el paso 2.1.2, a partir de ovocitos maduros (GV), madurados in vitro e in vivo .
  3. Lavar los ovocitos, como se describe en 2.1.4, en DPBS-PVA, recogerlos por separado en volúmenes de 1 μL y colocar 2 μl de RNALater en la parte superior. Snap-freeze en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras a -80 ° C durante un máximo de 6 meses.
  4. Añada 2 pg de ARN de luciferasa a cada muestra como espiga. Piscina de los ovocitos 2 x 2 y extraer el total de ARN utilizando una membrana de sílice a base de filtro de kit adecuado para recuperar el ARN de pequeñas muestras.
  5. Reverse-transcribe el ARN en 10 μL con 0,25 μg de hexámeros aleatorios y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia Moloney de ratón durante 1 h a 37 & # 176; C. Almacene las muestras a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
  6. Diluir el ADNc de las células de la granulosa en agua libre de ARNasa a 50 ng / μl. Diluya en serie esta solución 1:10 para obtener soluciones de 5 ng / μl, 0,5 ng / μL, 0,05 ng / μl y 0,005 ng / μL.
  7. Ensamble las reacciones por triplicado en un volumen total de 20 μL por reacción utilizando un cDNA equivalente a 0,05 oocitos como sustrato, o 5 μL de las diluciones en serie del ADNc de la célula de la granulosa, 10 μL de la supermezcla verde SYBR y 0,3 μM de cada cebador específico Tabla 1 ).
  8. Se lleva a cabo la reacción en un ciclador térmico usando un protocolo de 3 etapas: 95ºC durante 30 s, 60ºC durante 30 s, y 72ºC durante 20 s, repetido 40 veces. Finalmente, adquirir la curva de fusión, comenzando a partir de 60 ° C, y aumentar la temperatura en 0,5 ° C cada 20 s hasta 95 ° C.
  9. Evaluar la cantidad de partida (SQ) del mRNA específico en las muestras de ovocitos utilizando la curva estándarF "> 15 calculado sobre la base de la muestra de células de la granulosa Expresar los datos como la relación entre la SQ del gen de interés y la SQ de los genes de limpieza.

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Resultados

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Los hallazgos originales de estos experimentos se describieron en profundidad anteriormente 7 y se describen aquí como un ejemplo de resultados que se pueden obtener usando los protocolos descritos.

Tasa de maduración

De los 32 COC recuperados por OPU de los folículos dominantes, 28 (88%) estaban en la etapa MII. Catorce de los 58 AOC recogidos ...

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Discusión

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A pesar de que la IVM se ha realizado en caballos durante más de 20 años 16 , todavía no sabemos si el ovocito puede ser el origen de la aneuploidía embrionaria, como se ha propuesto para los seres humanos [ 17] . La razón es, probablemente, que la preparación de los diferenciales de oocitos para el conteo de cromosomas da lugar a una pérdida considerable de muestras. Con esto en mente, una encuesta de los métodos utilizados para investigar errores en la segregación cromos...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a Fabrice Vincent por el soporte con microscopía confocal de barrido láser (LSCM) , y Philippe Barrière y Thierry Blard por realizar el ultrasonido de exploración ovárica diaria y la inyección de hCG. Este trabajo fue apoyado en parte por el proyecto "Regione Sardegna y Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (Subvención 26096200 a AML); La beca "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" (Contrato 2012 a FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agencia Ejecutiva de Investigación (REA) "Pro-Ovum" (Subvención 303640 a VL); Y por la Escuela Postdoctoral de Agricultura y Medicina Veterinaria, cofinanciada por el Fondo Social Europeo, Programa Operativo Sectorial para el Desarrollo de los Recursos Humanos 2007-2013 (Contrato POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 a IM). La colección de ovocitos in vivo fue financiada por el Institut Français du Cheval et de l'Equitation.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
sonda de ultrasonidoAlokaUST-5820-7,5
gonadotropina coriónica humanacentravetCHO0041.500 unidad/animal IV
detomidinacentravetMED0109 - 15 µ g/kg
butilescopolamina bromurecentravetEST0010,2 mg/kg
microscopio estereoscópicoNIKONSMZ-2B
butorfanolcentravetDOL00310µ g/kg IV
bencil-penicilinacentravetDEP203 IM15.000 UI/animal
TCM199Sigma-AldrichM3769 10X1Lpolvo para hepes tamponado TCM199
Hepes sal sódicaSigma-AldrichH3784-100G
albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA8806
heparina Sigma-AldrichH3149-10KU
NaHCO3-buffered TCM199Sigma-AldrichM2154-500MLlíquido para IVM factor
crecimiento epidérmicoSigma-AldrichE4127
suero para terneros recién nacidosSigma-AldrichN4762-500ML
Platos de 4 pocillosIncubadora de144444
HeraeusBB6060
monastrolSigma-AldrichM8515
hialuronidasaSigma-AldrichH3506
pronaseSigma-AldrichP5147
paraformaldehídoSigma-AldrichP6148
polivinílicoSigma-Aldrich341584
triton-X 100Sigma-AldrichT8787
suero de burro normalSigma-AldrichD9663
conejo anti-Aurora B phospho-Thr232BioLegend636102
burro conjugado TRITC anti-conejo IgGVector Laboratories711-025-152
Vecta-ShieldVector LaboratoriesH-1000
YOPRO1Thermofisher ScientificY3603
microscopio de barrido láser confocalLSM 780Zeiss
microscopio de barrido láser confocalLSM 700Zeiss
ImageJrsb.info. nih.gov/ij/download.htmlrecurso
ratón anti-alfa-tubulinaSigma-AldrichT8203
conejo anti-acH4K16Upstate Biotecnología07-329
AlexaFluor 488-coniugated burro anti-ratón IgGLife TechnologiesA21202
4',6-diamidino-2-fenilindolSigma-AldrichD8417Centrífuga DAPI
Eppendorf5417R
RNALaterInvitrogenAM7020
Luciferasa ARNPromegaL4561
Kit de aislamiento de ARN PicoPureApplied Biosystems12204-01
hexámeros aleatoriosThermofisher ScientificN8080127
Moloney virus de la leucemia transcriptasa inversaThermofisher Scientific28025013
SYBR supermix verde BioRad1708880
imprimaciones específicasSigma-AldrichLos cebadores específicos se diseñaron utilizando el software Primer3Plus (recurso gratuito)
termocicladorBioRadMyiQ
monoclonal anti-CENPAAbcamab13939
ratón monoclonal anti-Aurora BAbcamab3609
IV de medio NUNCLON alcohol Software gratuito ratón ratón

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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