Artículo de método

Análisis de la segregación cromosómica, acetilación de histonas y morfología de huso en ovocitos de caballo

DOI:

10.3791/55242

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11 de mayo de 2017

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1Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, 2IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, 3PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, 4PAO, INRA, 5Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, 6University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

En este artículo

Resumen

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Este manuscrito describe un enfoque experimental para caracterizar morfológicamente y bioquímicamente ovocitos de caballo. Específicamente, el presente trabajo ilustra cómo recolectar ovocitos de caballo inmaduros y maduros mediante recogida de óvulos guiada por ultrasonido (OPU) y cómo investigar la segregación de cromosomas, morfología de huso, acetilación de histonas globales y expresión de mRNA.

Resumen

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El campo de la reproducción asistida se ha desarrollado para tratar la infertilidad en mujeres, animales de compañía y especies amenazadas. En el caballo, la reproducción asistida también permite la producción de embriones de alto rendimiento sin interrumpir su carrera deportiva y contribuye a un aumento en el número de potros de yeguas de alto valor genético. El presente manuscrito describe los procedimientos utilizados para recolectar ovocitos inmaduros y maduros de ovarios de caballo utilizando la recolección de óvulos (OPU). Estos ovocitos se utilizaron entonces para investigar la incidencia de aneuploidia mediante la adaptación de un protocolo previamente desarrollado en ratones. Específicamente, los cromosomas y los centrómeros de los ovocitos de la metafase II (MII) se marcaron fluorescentemente y se contaron en planos focales secuenciales después de un escaneado con microscopio láser confocal. Este análisis reveló una mayor incidencia en la tasa de aneuploidía cuando ovocitos inmaduros fueron recogidos de los folículos y madurado in vitro en comparación conIn vivo. La inmunotinción para la tubulina y la forma acetilada de la histona cuatro en residuos de lisina específicos también reveló diferencias en la morfología del huso meiótico y en el patrón global de acetilación de las histonas. Por último, la expresión de mRNAs que codifican histonas deacetilasas (HDAC) y acetil-transferasas (HATs) se investigó mediante transcripción inversa y PCR cuantitativa (q-PCR). No se observaron diferencias en la expresión relativa de los transcritos entre ovocitos madurados in vitro e in vivo . De acuerdo con un silenciamiento general de la actividad transcripcional durante la maduración de ovocitos, el análisis de la cantidad total de transcripción sólo puede revelar la estabilidad del ARNm o la degradación. Por lo tanto, estos hallazgos indican que otras regulaciones traslacionales y postraduccionales podrían verse afectadas.

En general, el presente estudio describe un enfoque experimental para caracterizar morfológicamente y bioquímicamente el ovocito de caballo, ceLl tipo que es extremadamente difícil de estudiar debido a la baja disponibilidad de la muestra. Sin embargo, puede ampliar nuestro conocimiento sobre la biología reproductiva y la infertilidad en las especies monovulatorias.

Introducción

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Se ha desarrollado una amplia gama de técnicas de reproducción asistida para tratar la infertilidad en mujeres, animales de compañía y especies en peligro de extinción. Uno de los procedimientos más comunes en los contextos clínicos es la recuperación de ovocitos de la fase metafásica II (MII) de los folículos ováricos por aspiración transvaginal guiada por ultrasonido, recolección de óvulos (OPU) 1 . Estos ovocitos son entonces fertilizados in vitro (FIV), con el (los) embrión (es) resultante (s) implantado (s) en un útero receptor. Los ovocitos de fase MII (maduros) se recuperan después de la administración de gonadotropinas exógena....

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Protocolo

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Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales CEEA Val de Loire Número 19 y se realizaron de acuerdo con los Principios Rectores para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Recolección de ovocitos y maduración in vitro

  1. Recolección de óvulos
    1. Evaluar diariamente por ultrasonido el diámetro de los folículos ováricos en una cohorte de yeguas adultas. En la aparición de un folículo ≥ 33 mm (folículo dominante), inyectar a la yegua 1.500 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG) en la parte superior de la vena yugular (iv).
      1. Antes de realizar ....

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Resultados

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Los hallazgos originales de estos experimentos se describieron en profundidad anteriormente 7 y se describen aquí como un ejemplo de resultados que se pueden obtener usando los protocolos descritos.

Tasa de maduración

De los 32 COC recuperados por OPU de los folículos dominantes, 28 (88%) estaban en la etapa MII. Catorce de los 58 AOC recogidos .......

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Discusión

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A pesar de que la IVM se ha realizado en caballos durante más de 20 años 16 , todavía no sabemos si el ovocito puede ser el origen de la aneuploidía embrionaria, como se ha propuesto para los seres humanos [ 17] . La razón es, probablemente, que la preparación de los diferenciales de oocitos para el conteo de cromosomas da lugar a una pérdida considerable de muestras. Con esto en mente, una encuesta de los métodos utilizados para investigar errores en la segregación cromos.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer a Fabrice Vincent por el soporte con microscopía confocal de barrido láser (LSCM) , y Philippe Barrière y Thierry Blard por realizar el ultrasonido de exploración ovárica diaria y la inyección de hCG. Este trabajo fue apoyado en parte por el proyecto "Regione Sardegna y Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (Subvención 26096200 a AML); La beca "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" (Contrato 2012 a FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agencia Ejecutiva de Investigación (REA) "Pro-Ovum" (Subvención 303640 a VL); Y por la Escuela Postdoctoral de Agricultura y Medicina Veterinaria, cofinanciada por el Fondo Social Europeo, Pr....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
sonda de ultrasonidoAlokaUST-5820-7,5
gonadotropina coriónica humanacentravetCHO0041.500 unidad/animal IV
detomidinacentravetMED0109 - 15 µ g/kg
butilescopolamina bromurecentravetEST0010,2 mg/kg
microscopio estereoscópicoNIKONSMZ-2B
butorfanolcentravetDOL00310µ g/kg IV
bencil-penicilinacentravetDEP203 IM15.000 UI/animal
TCM199Sigma-AldrichM3769 10X1Lpolvo para hepes tamponado TCM199
Hepes sal sódicaSigma-AldrichH3784-100G
albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA8806
heparina Sigma-AldrichH3149-10KU
NaHCO3-buffered TCM199Sigma-AldrichM2154-500MLlíquido para IVM factor
crecimiento epidérmicoSigma-AldrichE4127
suero para terneros recién nacidosSigma-AldrichN4762-500ML
Platos de 4 pocillosIncubadora de144444
HeraeusBB6060
monastrolSigma-AldrichM8515
hialuronidasaSigma-AldrichH3506
pronaseSigma-AldrichP5147
paraformaldehídoSigma-AldrichP6148
polivinílicoSigma-Aldrich341584
triton-X 100Sigma-AldrichT8787
suero de burro normalSigma-AldrichD9663
conejo anti-Aurora B phospho-Thr232BioLegend636102
burro conjugado TRITC anti-conejo IgGVector Laboratories711-025-152
Vecta-ShieldVector LaboratoriesH-1000
YOPRO1Thermofisher ScientificY3603
microscopio de barrido láser confocalLSM 780Zeiss
microscopio de barrido láser confocalLSM 700Zeiss
ImageJrsb.info. nih.gov/ij/download.htmlrecurso
ratón anti-alfa-tubulinaSigma-AldrichT8203
conejo anti-acH4K16Upstate Biotecnología07-329
AlexaFluor 488-coniugated burro anti-ratón IgGLife TechnologiesA21202
4',6-diamidino-2-fenilindolSigma-AldrichD8417Centrífuga DAPI
Eppendorf5417R
RNALaterInvitrogenAM7020
Luciferasa ARNPromegaL4561
Kit de aislamiento de ARN PicoPureApplied Biosystems12204-01
hexámeros aleatoriosThermofisher ScientificN8080127
Moloney virus de la leucemia transcriptasa inversaThermofisher Scientific28025013
SYBR supermix verde BioRad1708880
imprimaciones específicasSigma-AldrichLos cebadores específicos se diseñaron utilizando el software Primer3Plus (recurso gratuito)
termocicladorBioRadMyiQ
monoclonal anti-CENPAAbcamab13939
ratón monoclonal anti-Aurora BAbcamab3609
IV de medio NUNCLON alcohol Software gratuito ratón ratón

Referencias

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  1. Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467(1984).
  2. Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting....

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