Abstract
胎盤は、胚発生の間に開発した最初の臓器であり、発達中の胚の生存のために必要とされます。胎盤は、着床前胚盤胞の胚体外栄養外胚葉細胞から分化する様々な栄養膜細胞から構成されています。このように、ヒト胎盤の早期分化事象の理解があるため、人間の胚発生の単離および操作上の倫理的および法的制約のために制限されています。ヒト多能性幹細胞（hPSCs）人間開発を研究するための強力なモデル系であり、また、種々の栄養膜細胞型のマーカーを発現する栄養膜細胞にインビトロで分化させることができます。ここでは、骨形成タンパク質4及びアクチビン/ノダルシグナル伝達経路の阻害剤を使用して、栄養膜細胞にhPSCsを区別するための詳細なプロトコルを提示します。このプロトコルは、siRNAでトランスフェクトすることができる種々の栄養膜細胞型を生成します機能喪失表現型を調査するため、または病原体に感染させることができます。さらに、hPSCsは、遺伝的に変更することができ、その後の機能獲得分析のための栄養膜の前駆細胞に分化しました。 hPSCsから始まる人間栄養芽細胞を生成するためのこのインビトロ分化方法は、ヒト初期胚での作業の倫理的、法的な制限を克服し、このシステムは、創薬・幹細胞研究を含め、様々な用途に使用することができます。
Introduction
胎盤は、妊娠中の胎児の成長と生存のために必要と母体と胎児循環の間の気体、栄養素、老廃物、およびホルモンの交換を容易にされています。哺乳類の胚発生の間に形成された第一の臓器は、ヒトおよびマウスの1で3.5から4.5日で6-7日後受胎の開発から始まり、胎盤、2、3、4です。栄養膜細胞が胎盤の最も重要な細胞であり、これらの細胞は、哺乳動物の胚の初期の系統分化のイベントのいずれかを表します。彼らは、着床前胚盤胞の外胚体外栄養外胚葉細胞から生じます。胎盤の開発の初期段階の私たちの知識は、早期人間開発のモデリング上の倫理や物流の制限によって制限されています。
胚移植時には、トロホブラスト母性上皮に侵入し、専門の前駆細胞5に分化します。細胞栄養芽層（のCTB）が融合し、子宮にアンカー胎盤合胞体（のSYN）とextravillous侵襲性栄養膜（EVTs）に分化単核、未分化前駆細胞です。 SYNは、妊娠を維持するために必要なホルモンを合成する多核、最終分化細胞です。絨毛細胞での障害は流産、子癇前症、および子宮内発育制限1になるようEVTsとのSYNを生成する初期分化事象は、胎盤形成に必須です。開発されてきた人間の栄養膜細胞株の種類は胎盤ホルモンを産生のCTBと絨毛を、不死化および浸潤特性6を表示することを含みます。人間の妊娠第一期の胎盤を単離することができるが、細胞はすぐにDIFから初代栄養膜細胞ferentiateおよびin vitroで増殖して停止します。重要なことには、形質転換された、一次細胞株は、腫瘍形成および不死化栄養膜細胞株は、正確に一次栄養膜7を表していない可能性があることを示し、異なる遺伝子発現プロファイルを有します。さらに、これらの行は、それらが三学期を介して第1の後段に由来しているため、胎盤トロホブラスト幹細胞前駆体に似ている可能性は低いです。
胎盤の形成と機能の初期事象を研究するために、初期段階のヒト栄養芽細胞の体外培養系における堅牢なの必要性があります。着床前胚の内部細胞塊と特性を共有するヒト胚性幹細胞（hESC）は、しばしば早期胎盤の形成を含む、初期のヒトの発生をモデル化するために使用されます。ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）およびヒトES細胞の両方は、骨モルを用いてインビトロで栄養芽細胞に分化させることができますphogenicタンパク質4（BMP4）8、9、10、11、12、13、14、15。 BMP4を使用して栄養膜細胞への多能性細胞のこの変換は、人間の細胞に特異的であり、それは初期ヒト胚9、16へのアクセスを必要としないため、広く初期のヒト胎盤の発達を研究するために使用されます。最近、SMAD2 / 3及びMEK1 / 2シグナル伝達経路を遮断する阻害剤A83-01（A）およびPD173074（P）の添加は、栄養外胚葉様前駆細胞、主にSYNのにHPSCの分化の効率を高めることが発見されました中胚葉、内胚葉、または外胚葉細胞9の大規模な発生がなく、EVTs、17 、in vitroモデル系9、11本の妥当性を支持します。ここでは、BMP4 / A / P培地を用いて、ヒト栄養芽前駆細胞へのhPSCsのインビトロ分化のための詳細なプロトコルを提示します。これらの条件は、リポフェクション媒介性トランスフェクションを用いたRNA配列、siRNAを用いた遺伝子破壊、病原体感染、遺伝的改変を含む、多種多様な用途のための細胞の過剰数を生成します。
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Protocol
注：栄養膜前駆細胞へのhESCまたはhiPSCsのいずれかの分化のために、マウス胚繊維芽細胞（MEF）上に成長したhPSCsをフィーダーを含まないために、2つの通路のための条件をBMP4 / A / Pと分化を開始する前に遷移されます。このプロセスは、分化した細胞のMEF汚染を排除します。ここでは、hESCの分化のためのプロトコルを提供し、同じプロトコルをhiPSCsに適用することができます。
1.照射マウス胚線維芽細胞上のhESCの文化と回復（のMEF）（準備）
- MEFののガンマ線照射
- 10％FBS、2mM L-グルタミン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を含むDMEM、及び0.1mMの非必須アミノ酸（NEAA）のMEFを培養するための培地500mlを加えます。
- 一次のMEFの1つのバイアルを解凍し、細胞を培養するためのMEF培地を使用します。 MEF培地を用いて30プレートに一次のMEFを展開します。
注：酸素濃度はそう、このステップのために重要ではありませんインキュベータ内の生理学的（4％）または周囲（20％）の条件のいずれかを使用することができます。 - MEFSを収穫。プレートからのMEFを削除し、コニカルチューブに細胞を転送するために0.25％トリプシンを使用してください。照射機器にのMEFを置き、3500グレーに細胞をさらします。
注：時間の量は、照射ユニットの内部ソースの活性に依存します。 - MEF培地を照射したMEFを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。
- 遠心分離機を使用したMEFをペレット化し、50％のMEF培地と培地を凍結50％の細胞（80％FBS、20％MEF培地）を加えます。アリコート1バイアルあたり1×10 6個の細胞。
- 一晩-80℃の冷凍庫で照射MEFバイアルを置き、その後、長期保存のために液体窒素に転送します。
- 文化のために凍結したMEFおよびヒトES細胞を解凍
- 20％血清REPLACを含むDMEM / F-12：hESCの培地500mlを作りますement、0.1mMのNEAA、2mMのL-グルタミン、10ng / mLのbFGFを、0.1 mMのSSメルカプトエタノール、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン。
- ヒトES細胞を解凍する前に、MEFを1日1バイアルを解凍します。各ウェルは1 mlで使用し、0.1％ゼラチンでコート6ウェルプレートを、。室温で少なくとも20分間インキュベートし、その後、ゼラチンを削除します。
- 液体窒素中で貯蔵からのMEFのバイアルを取り外し、37℃の水浴中でバイアルを浸します。唯一の小さな氷の結晶が残るまで断続的にバイアルをご覧ください。迅速に15ミリリットルコニカルチューブ内のMEF培地の9ミリリットルにバイアルの内容を転送します。
- 5分間、200×gで遠心分離して細胞をペレット化。上清を吸引除去し、MEF培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 6ウェルプレート上に均等にしたMEFを等分。一晩37℃の低酸素（4％）インキュベーターにプレートを置きます。
- MEFの上のhESCのルーチンの文化
- 液体窒素からのhESCバイアルを取り外し、すぐに3を使用して、バイアルを解凍7℃の水浴。ゆっくりのhESC媒体の9ミリリットルを含む15ミリリットルコニカルチューブにヒトES細胞をピペットし、5分間、200×gでスピンダウン。培地を除去し、ヒトES細胞培地1mlで細胞を懸濁します。
- ステップ1.2.4で製造したプレートからMEF培地を吸引し、ヒトES細胞培地の1ミリリットルを追加します。ヒトES細胞培地にROCK阻害剤Y-27632（10μM）を追加します。 MEFの上にヒトES細胞を転送します。
- 一晩37℃で低酸素（4％）インキュベーターにセルを配置します。毎日のhESC媒体を交換してください。 4Xで正立顕微鏡下で可視化パスツールピペットを用いて分化した細胞を削り取ります。
- パサージュヒトES細胞ごとに4-6日、細胞集密度とhESCコロニーの大きさに応じて。継代前日のMEFのプレートを準備します。細胞は継代に準備ができているときは、hESCの培地を除去し、1mlのPBSでよく洗います。
- 1mg / mlのコラゲナーゼを追加します（37℃に予熱した）、37℃で5分間インキュベートし、コラゲナーゼを除去します。 WPBSで細胞をアッシング、ウェル当たりのhESC培地の1ミリリットルを追加し、手動で5ミリリットルピペットの先端を使用して小さな塊に細胞をこすり取ります。新しいMEF-コーティングされたウェル（複数可）に懸濁細胞塊を転送します。
フィーダーなしに条件を細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上のMEFからのhESCの2推移
- 準備MEF馴化培地（CM）
- 百分の90から100までの集密度でT75フラスコ中で照射したMEFをプレート。のMEFが密にメッキされることが重要です。彼らは、フラスコの底部に取り付けられているかどうかを判断するために顕微鏡を用いて細胞を観察し（MEFをメッキまたは翌日以降、約6時間を添付します）。
注：顕微鏡を用いて観察したときに未結合細胞が培地中に浮遊します。翌日、MEF培地を除去し、B-FGFを欠くのhESC培地25mlを追加します。 - インキュベーションの24時間後に馴化培地を収集します。 12日の最大のために毎日新鮮な培地と交換してください。 0.22μmのフィルターを用いて収集したCMをフィルタリングします。使用前に、CMに新鮮なB-FGFを追加します。
注：CMは、-80℃で凍結し、最長1年間保存することができます。また、4℃で2週間CMを格納します。
- 百分の90から100までの集密度でT75フラスコ中で照射したMEFをプレート。のMEFが密にメッキされることが重要です。彼らは、フラスコの底部に取り付けられているかどうかを判断するために顕微鏡を用いて細胞を観察し（MEFをメッキまたは翌日以降、約6時間を添付します）。
- トランジションのMEF上で培養物からヒトES細胞は、無フィーダーする細胞外マトリックスでコーティングされたプレートを。
- 被覆組織培養プレートのための細胞外マトリックスの調製
- 氷（約3-4時間）に、細胞外マトリックスのアリコートを解凍します。氷冷DMEM / F-12の24ミリリットル中に氷のように冷たいヒント、1冷たい、50ミリリットルコニカルチューブ、およびDMEM / F12培地、細胞外マトリックスの転送に2mgを使用した（希釈は、サプライヤーからの細胞外マトリックスの濃度に依存します）。
- 直ちに氷上に50ミリリットルを円錐管に移し、4℃で保存。被覆組織培養プレートのために、ウェルに希釈し、細胞外マトリックスの適切な量を追加する（例えば、6ウェルプレート中のウェルあたり1ml）中。プレートをコーティングするために旋回し、少なくとも1時間室温でインキュベートします。
- B-FGF（10 ngの/ ml）を含むCMを使用して（ステップ1.3のように）のMEFからの通路のhESC。
- 吸引し、新しいプレートから細胞外マトリックスを削除して、B-FGFを含むCMを追加します。ピペットを用いて、MEFプレートから掻き取り、携帯塊を移し、細胞外マトリックスでコーティングされたプレートに、それを分取。一晩37℃での低酸素インキュベーターでインキュベートします。
- 毎日のB-FGF媒体とCMを交換してください。培地の量は、培養フラスコの大きさに依存するであろう。 6ウェル1のために2mlの培地を使用してください。パスツールピペットで分化した細胞を削り取ります。
- 通路hESCを顕微鏡で見たときにコロニーが明るいごとに6-7日、。
注：細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上で増殖したhESCコロニーは、MEF培養細胞よりも大きくなります。 - 無フィーダー細胞が通過に準備ができたら、培地を除去し、広告によって洗いますPBSを除去するために、ピペット、吸引を使用してPBSの丁1mlを、追加の0.5mg / mlのディスパーゼピペットを用いて（37℃に予熱）、5分間37℃でインキュベートします。
- ウェルあたり2mlのPBSを添加し、その後吸引することにより、PBSで細胞を洗浄。ウェルあたりのCMの1ミリリットルを追加し、手動で5ミリリットルピペットの先端を使用して小さな塊に細胞をこすり取ります。
- プレートの新しい細胞外マトリックスでコーティングされたプレートに中断し、細胞塊。細胞は24時間後に接着する必要があります。
- 被覆組織培養プレートのための細胞外マトリックスの調製
BMP4 / A / Pを使用したhESCの3分化
- 分化培地を準備します。利用CM（欠けているB-FGF）と（新鮮）BMP4（50 ngの/ ml）を、A83-01（1μM）、およびPD173074（0.1μM）を追加します。使用前にCMにこれらの阻害剤を追加します。
- 4％の酸素で設定したインキュベーター内部の培養1通過のための細胞外マトリックス被覆プレート上で増殖するフィーダーなしのhESCを、使用してください。細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上に最初に通過した後、細胞は24時間添付してみましょう。次の日、分化を開始。 （B-FGFを含む）のCMを削除し、BMP4 / A / P（6ウェルプレート中のウェル当たり2ミリリットル）を含むCMと交換してください。 4％の酸素濃度を用いて細胞を培養することを続けます。
- BMP4 / A / Pを含むCM（2ミリリットル/ウェルのための6ウェルプレート）2日毎に交換してください。吸引し古い培地を除去し、ピペットを用いて、新しいCMを追加します。 B-FGF（考え分化2日目）のBMP4の追加や削除後の第2日目に、細胞の形態は顕微鏡を用いて観察したときに大きく表示されて、変更されます。
注：明るい丸い縁を呈する未分化細胞は、存在しません。 - 希望の時点で細胞を収集します。分化した細胞は、約2週間後に分裂を停止します。この期間中にトランスフェクト細胞（次のセクションを参照）。
siRNAまたはプラスミドDNAと絨毛細胞の4トランスフェクション
- トランスフェクションのための栄養膜細胞を準備します
- MEFのからそれらを転送した後、細胞外マトリックス上の2つの通路のための培養ヒトES細胞（ステップ2.2参照）。 B-FGFを含むhESCの培地を使用してください。
- 1日の分化する前に、新しい細胞外マトリックスプレート上にヒトES細胞を分割します。次の日、少なくとも50％の密集度を確保する新しいプレート/ウェル、上に1：高い細胞集密度はそれほど細胞1を分割し、重要です。低酸素インキュベーター中で一晩細胞をインキュベートします。
注：ヒトES細胞は、このステップ中にカウントする必要はありません。 - 次の日は、分化培地で培地を交換してください（CM 6ウェルプレートのためミリリットル/ウェルBMP4 / A / Pを含有し、B-FGFを欠く、2を使用して）。吸引によって古い培地を除去し、ピペットを使用して、新しい培地（2ml）に移します。一晩低酸素インキュベーター（4％酸素）で細胞を置きます。
- 希望のタイムまで、細胞を分化（1日目と14の間）のポイント。トランスフェクションの前日に、5分間、0.05％トリプシンを用いて細胞をトリプシン処理します。ゼラチンコートプレート上に所望の密集度（トランスフェクション試薬プロトコルに応じて）にそれらをプレート（除去するために20分を吸引するための組織培養プレートに0.1％のゼラチンを追加します）。 （B-FGFを欠く）BMP4 / A / Pを含むCMを追加し、一晩インキュベートします。
- 翌日、細胞に新鮮な分化培地を追加します。 siRNAトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトするsiRNA。プラスミドDNAの場合は、適切なリポフェクタミン試薬を使用しています。
- 各トランスフェクション試薬について説明したように、製品のプロトコルに従ってください。低酸素インキュベーターで一晩細胞を、各ウェルの細胞/プレートにsiRNAをリポフェクタミン複合体を移し穏やかに混合し、文化。
注：一部のトランスフェクション試薬は、CMがペニシリン/ストレプトマイシンを欠いている必要が抗生物質によって阻害されています。 - 翌日、新鮮な分化培地と交換してください。
- 願望で細胞を収穫Dの時点（ 例えば、24時間、48時間、および72時間）定量的RT-PCRを用いて遺伝子破壊効率を確認します。収穫細胞については、ウェル当たり1ミリリットルを添加し、37℃で5分間インキュベートし、0.05％トリプシンを使用します。トリプシンを中和するためにウェルあたりMEF培地の5ミリリットルを追加します。 5分間、200×gで細胞をスピンダウンし、RNA単離のために細胞ペレットを使用します。
絨毛細胞の5病原体感染：仙台ウイルス感染
- 分化のためにヒトES細胞を準備します
- MEFのからの転送後の細胞外マトリックス上の2つの通路のための培養ヒトES細胞（ステップ2.2参照）。 B-FGFを含むhESCの培地を使用してください。
- 1日の分化する前に、新しい細胞外マトリックスプレート上にヒトES細胞を分割します。次の日、少なくとも50％の密集度を確保する新しいプレート/ウェル、上に1：高い細胞集密度は、そのように分割セル1が重要です。低酸素インキュベーター（4％酸素）で一晩細胞をインキュベートします。<BR />注：ヒトES細胞は、このステップ中にカウントする必要はありません。
- 翌日、一晩低酸素インキュベーター（4％酸素）に分化培地（CM BMP4 / A / Pを含有し、B-FGFを欠く）と文化で培地を交換してください。
- 栄養膜細胞の仙台ウイルス感染
- ある日、希望分化日の前に、5分間、0.05％トリプシンを用いて、（単一細胞）に分化する細胞をトリプシン処理し、ゼラチンコートプレートに移します。分化培地を追加し、低酸素インキュベーターで一晩インキュベートします。
- 翌日、感染のための培地を追加（これは、ウイルスによって異なります）。 6ウェルプレートの1ウェル0.5 mlで使用し、BMP4 / A / Pを含むペニシリン/ストレプトマイシンを欠く使用CM。 MOIは、低酸素インキュベーター中で8時間、1インキュベートを=のためにセンダイウイルスを追加します。
- 追加の時点が必要な場合は、4時間後にウイルス含有培地を除去し、BMP4 / A / P CMと交換してください。細胞を回収RNA単離のために細胞スクレーパーを使用して。
- ウイルス応答18に関与する遺伝子のための定量RT-PCRを行うことにより、ウイルス感染の効率を決定します。
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Representative Results
hPSCsのインビトロ分化の概要
このインビトロ分化プロトコルは、1の通路（ 図1A）のための無フィーダー条件に移行されたMEF上で増殖させた未分化ヒトES細胞から始まります。私たちはこのプロトコルでhESCの分化を説明したが、我々が正常絨毛細胞にhiPSCsを区別するために、このプロトコルを使用していました。細胞外マトリックスへの移行は、ヒト絨毛細胞の純粋な集団を必要とする分析のために望ましくない照射したMEFの大部分を削除します。未分化のhPSCsは、細胞外マトリックス上で増殖させ、コロニーが継代（約1週間）のための準備が整うまでCMがB-FGFを含むと一緒に培養されています。これは、BMP4 / A / P媒介分化を誘導する前に多能性状態を維持します。コロニーは〜50-100細胞の塊に破壊されますディスパーゼを使用し、細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上に二度目の継代しました。継代翌日、接着細胞は、分化を誘導するのに準備ができている、そして培地をB-FGFを欠くBMP4 / A / Pを含有するように切り替えられます。分化した細胞は、細胞をRNA単離のために収集されまたはトランスフェクション実験のために使用することができ、その間、約2週間のために増殖します。形態学的変化は、分化が開始された、一つの代表的な実験からの結果は、 図1Bに示されている1~2日後に現れます。分化日1-2上の細胞は、0日目（ 図1B）からの細胞よりもサイズが大きいことに注意してください。分化した細胞のコロニーは、急速に成長し、この変更は、毎日顕著です。分化が進むと、細胞は分裂し、外側方向に成長し、コロニーの中心から外に展開する（; 図1Bの日3-5）。コロニーの外側部分は、トンに比べ、より大きな細胞が含まれていますコロニーの中心に彼の細胞。分化した細胞は、細胞外マトリックス上で培養した多能性幹細胞よりも暗いと平坦になります。ルーチン細胞培養に使用される正立顕微鏡で細胞を観察するとき、セルの輝度の変化は、より明らかです。個々のコロニーは、細胞が互いの上に成長して、分化5日目（ 図1B）で合流します。分化日4-5後、複数の核を含む細胞が存在する（図示せず）（ 図1B）。
BMP4 / A / Pは栄養膜マーカーの分化および発現を誘導します
我々は、定量的RT-PCR（QRT-PCR）を用いて、BMP4 / A / P分化の最初の3日間の遺伝子発現の変化を調べました。 RNAは、分化の1日目、2で単離し、3 cDNAに変換しました。多能性幹細胞の消失は、両方のBを評価することができます視覚的に多能性遺伝子のためのプライマーを用いて、顕微鏡を用いて、定量RT-PCRによりY形態。 （細胞はBMP4で培養した場合NANOG、多能性幹細胞のマーカーの相対的発現レベルは、分化の1日後〜75％で減少され、レベルがBMP4 / A / Pの存在下で約90％減少しています図2）。分化2日目までに、NANOGのレベルは、（B-FGFを含む）のhESC CM培地中のものと比較して、BMP4単独で、またはBMP4 / A / P内で培養された細胞のための非常に低いです。私たちは明るく、分化した細胞に比べてサイズが小さく、分化の2日間（ 図1B）、後に未分化細胞を観察していないので、これは、予想される結果です。 KRT7およびCDX2：栄養膜細胞のBMP4媒介分化の効率は、直接2トロホブラストのマーカーに特異的なプライマーを用いた定量RT-PCRにより評価することができます。これらの遺伝子の両方が、ヒト多能性幹に発現されませんBMP4処理の2~3日後に細胞を、それらの発現が増加する（ 図2）。ここに記載した条件を用いて、KRT7転写レベル（ 図2）BMP4 / A / P培地中で分化1日目に増加し、分化の最初の3日間、一定のままです。単独でBMP4を使用してKRT7式はアクチビン/ノーダル阻害剤はヒトES細胞9の分化率を高めることを以前の観察と一致して、2日目によって遅延が増加しています。これらの阻害剤の利用効率を評価する別の方法は、単独で、BMP4で処理した細胞でCDX2およびKRT7転写物の定常状態の存在量を決定することです。アクチビン/ Nodalの阻害剤と一緒に単独で、BMP4またはBMP4のいずれかを使用している場合CDX2レベルは分化1-3日のために類似しています。しかし、KRT7転写物は、より多くのことを示唆しているこれらの阻害剤の存在下で分化の1日後に、より豊富です急速な分化（ 図2）。 CDX2の発現は、典型的には、両方の条件のための分化2日目にピークと3日目（ 図2）の後に減少します。予想通り、未分化hESCを、KRT7またはCDX2（ 図2）のいずれかを発現しません。結論として、BMP4 / A / P条件が急速にヒトES細胞を区別し、胎盤のマーカーの発現が早くも分化3日目として検出することができます。
インビトロで使用してsiRNAおよびプラスミドDNAのトランスフェクションおよびウイルス感染は、絨毛細胞の由来しました
in vitroで誘導されたヒト絨毛細胞は、コードまたは非コードRNAのいずれかの遺伝子の発現を破壊するsiRNAでトランスフェクトすることができます。我々は、分化の1日目および2日目に（siRNAの75ピコモルを使用して）のsiRNAトランスフェクションの2ラウンドを行って、BMP4 / A / Pを使用して、ヒトES細胞の分化を開始しましたそしてRNA単離のために細胞を収集しました。定量的RT-PCRは、コードまたは非コード遺伝子のいずれかのためのノックダウン効率を決定するための有効な方法です。 RNA lncRHOXF1 19の非コードの長の異なる領域に相補的な2 siRNAを、使用して、我々はlncRHOXF1転写物（ 図3A）の80％のノックダウンを得ました。次に、我々はまた、分化日1及び2に我々は、2つの連続したトランスフェクション以下のhnRNP U転写産物で80％の減少を観察し、タンパク質をコードする遺伝子のhnRNP Uのための1のsiRNA（25ピコモル）をトランスフェクトしました。 インビトロで分化した栄養膜前駆細胞は、自然免疫応答を調べるために使用することができます。私たちは、センダイウイルスを使用して2細胞1のMOIで分化日の感染を行い、ウイルスのインキュベーションの8時間後に細胞を収集しました。定量RT-PCRを用いて、活性なウイルスプロの指標で、（ 図3B）感染細胞に豊富なウイルスタンパク質の転写産物（重大度-NP）を検出し栄養膜細胞でpagation。重要なことには、感染した細胞（MOIを使用= 1）外観変化及び生存可能でない（データ示さず）。 インビトロで誘導された栄養膜細胞は、プラスミドDNAでトランスフェクトすることができます。我々は、GFPプラスミドを用いてトランスフェクションを行い、これは分化1日目と3日目にBMP4 / A / P-処理された構築物の細胞へ導入し、GFPのために次の日（ 図4）を画像化しました。当社は通常24時間トランスフェクション後に30〜50％のトランスフェクション効率を得ました。結論として、in vitroで誘導された栄養膜細胞はgain-および機能喪失実験のために利用することができます。
図1：BMP4 / A / Pを使用して、初期の栄養膜細胞のヒト多能性幹細胞の インビトロ 分化。 BMP4分化の（A）概略 BMP4 / A / Pを使用して、栄養膜細胞にhPSCsの。 （B）BMP4 / A / P分化のD0、D2およびD6中HUES9細胞の代表的な明視野像。スケールバー= 50μM。矢頭は区別されていないシングルセルのhESCを表します。矢印は、分化の間に形態学的特徴を強調表示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：BMP4 / A / Pの分化はすぐに多能性マーカーNANOGをダウンレギュレートし、栄養膜遺伝子CDX2とKRT7を上方制御します。 NANOG（多能性マーカー）、CDX2、とKRT7（栄養膜マーカー）のためのqRT-PCR分析。値は、三重の対策から平均です。 //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 遺伝子破壊および in vitro 分化したヒト絨毛細胞 内で 使用してウイルス感染 。 hESCの（A）定量RT-PCR分析（HUES9）が分化し、その後長期に特異的なsiRNAをトランスフェクトし、2日間連続RNA lncRHOXF1（左）またはタンパク質をコードする遺伝子のhnRNP U（右）非コード。ノックダウン効率（KD）は、典型的には70〜80％であり、1トランスフェクション実験の結果を示します。 （B）8時間分化日のセンダイウイルスタンパク質の転写センダイウイルスを感染させた2絨毛細胞（MOI = 1）の定量RT-PCR分析。エラーバーはSEMを示します。「http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 4：in vitroで 分化したヒト絨毛細胞 へ の 導入プラスミドのDNA。分化1日目と3日目栄養外胚葉前駆細胞へのGFPプラスミドDNAのトランスフェクションは、次の日に視覚化しました。スケールバー= 50μM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちは、栄養膜の前駆細胞にヒトES細胞を区別するための基本的な手順を提示しました。このプロトコルは、最近栄養膜細胞への分化を増加させ、典型的には単独のBMP4処理で観察された中胚葉前駆細胞の発生を回避すること、急速にアクチビン/ノーダルシグナル伝達阻害剤を添加してヒトES細胞を区別するために最適化されています。 BMP4のモデルシステムは、人間の栄養膜細胞系譜の仕様および拡張の初期段階の調査を可能にします。また、このBMP4モデルシステムは、絨毛癌細胞株および絨毛外栄養膜細胞株を使用して可能でない特定のサブ系統への栄養膜細胞の分化を調査するために有用です。 インビトロで誘導された栄養膜細胞は、siRNAは19を使用して機能喪失実験のために使用することができます。さらに、ヒトES細胞またはhiPSCsは、遺伝的にトランスジーンの誘導性発現のために改変することができます ES 19または内因性遺伝子座20におけるレポーター遺伝子の挿入のために、これらの細胞を、ここに記載した条件を用いて、栄養膜細胞に分化することができます。
プロトコル内の重要なステップ
ヒトES細胞から栄養膜前駆細胞を得るために、CM分化培地からB-FGF（FGF2）を省略することが不可欠です。培養液中のBMP4と一緒にB-FGFの存在は、中胚葉及び内胚葉前駆細胞16の発現を増強します。栄養膜分化培地中のB-FGFを含めることが最近の研究は、BMP4媒介分化ではなく栄養膜21の中胚葉及び内胚葉細胞を生成することがわかった理由を説明すると考えられています。これは、用量依存様式22に内胚葉および中胚葉分化を促進するアクチビンA及びBMP4とともにB-FGFことはよく確立されていますS = "外部参照"> 23。マウスでは、胚盤葉上層、栄養外胚葉の開発、および原始内胚葉系統は、FGFシグナル伝達経路24に依存しています。 BMP4は、分化21、25を誘導するために使用されたときにヒトES細胞の分化において、B-FGF誘発性シグナル伝達は、中胚葉形成に必要とされます。これとは対照的に、BMP4と一緒に両方のFGF及びアクチビン/ノダルシグナル伝達経路の阻害は、hESC由来栄養膜前駆細胞にSYNの形成を促進し、中胚葉及び原始内胚葉前駆細胞26の形成を防止します。
テクニックの制限事項
栄養膜の前駆細胞にHPSC分化のこのプロトコルで最も一般的な問題は、MEFの上のhESCまたはhiPSCsの大部分が未分化の人口で始まると関連しています。 hPSCsは、両方の内側と外側のエッジに分化した細胞を蓄積するのでコロニーは、毎日の分化の量を監視し、分化したコロニー（またはコロニーの一部）を除去することが重要です。分化した細胞の存在は、細胞が細胞外マトリックスに転送される場合は特に、分化プロセスを複雑にすることができます。分化した細胞はすぐにCMの存在下で細胞外マトリックス上で増殖し、これらの細胞は急速に文化を越えて外競うhPSCsがかかります。したがって、細胞外マトリックスに細胞を転送する前に、MEFの上に成長したhPSCsの健全な、未分化コロニーを開始する理想的です。
既存の/代替方法に関して技術の意義
この分化プロトコルを使用する場合、得られた栄養膜前駆体は、細胞型の不均一混合物です。栄養芽細胞は絨毛細胞栄養層、合胞体（SYNの）、およびextravillous細胞栄養芽層から構成されています（EVTs）27。絨毛細胞栄養芽層はEVTsとのSYNを生成する前駆細胞です。 BMP4分化hPSCsは、胎盤特異的マーカーの遺伝子またはタンパク質の発現によって定義されている絨毛細胞栄養層、SYNの、およびEVTs 9、15、の混合物を生成します。異なる分化経路は、HLA-G（EVTsの特性）または（のSYNからの）ヒト絨毛性ゴナドトロピン28,29の分泌によって区別することができます。最近では、ノーダル、アクチビン/シグナル伝達の阻害は、ヒトES細胞からEVT分化に有利であり、この阻害の除去はSYN 17への分化に有利に働くことが示されています。確かに、以前の出版物は、ヒトES細胞を区別するために単独でBMP4を使用すると、ほとんどがSYN細胞26を生成することがわかりました。 BMP4 / A / Pおよび馴化培地を（B-FGFを欠く）を使用してのデータは存在純粋なEVTまたはSYN集団が所望される場合EVTと分化5日目により本SYN細胞の両方であり、EVTsの単離のためのビーズに結合させ、このようなHLA-Gのような細胞表面マーカーを使用して、追加の精製は、29可能です。結論として、ここに記載の培養方法は、様々な用途に使用することができるhPSCsから栄養膜細胞の有意な量を生成するための効率的な方法です。このプロトコルのSYNとEVTsの両方を生成するので、それは初期のヒト胎盤を検査するのに適したモデル系です。これらの細胞は、創薬および遺伝子工学などの様々な用途に使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
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