Summary
lesiones hepáticas están acompañados por la expansión de células progenitoras que representa una población heterogénea de células. clasificación Novel de este compartimento celular permite la distinción de varios subconjuntos. El método descrito aquí ilustra el flujo de análisis de citometría de alto aislamiento y pureza de varios subconjuntos que se pueden utilizar para más ensayos.
Abstract
Durante lesiones crónicas del hígado, las células progenitoras se expanden en un proceso denominado reacción ductular, que también implica la aparición de infiltrado celular inflamatorio y la activación de las células epiteliales. La población de células progenitoras durante tales reacciones inflamatorias principalmente se ha investigado el uso de marcadores de superficie individuales, ya sea por análisis histológico o por técnicas basadas en citometría de flujo. Sin embargo, nuevos marcadores de superficie identificaron varios subconjuntos funcionalmente distintos dentro de la progenitora de hígado compartimento celular / vástago. El método presentado aquí describe el aislamiento y flujo detallado análisis de citometría de subconjuntos progenitoras utilizando combinaciones de marcadores de superficie novedoso. Por otra parte, se demuestra cómo los diferentes subconjuntos de células progenitoras pueden aislarse con los métodos basados en la clasificación de alta pureza utilizando automatizado magnético y FACS. Es importante destacar que, novedosos y enzimática simplificada disociación del hígado permite el aislamiento de estas poblaciones de células raras con una alta viabilidadque es superior en comparación con otros métodos existentes. Esto es especialmente relevante para el estudio de más células progenitoras in vitro o para el aislamiento de ARN de alta calidad para analizar el perfil de expresión génica.
Introduction
La regeneración hepática se asocia sobre todo con la capacidad de auto-renovación de los hepatocitos. Sin embargo, las lesiones crónicas del hígado se producen con la activación de células progenitoras y de expansión, que se han asociado con su capacidad de diferenciarse en hepatocitos y cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Esto es especialmente relevante porque, durante las lesiones crónicas, la proliferación de hepatocitos no es eficaz. A pesar de múltiples estudios de rastreo genético dirigidas a células progenitoras, su papel en la regeneración del hígado sigue siendo controvertido 5, 6, 7, 8. Por otra parte, la activación de las células progenitoras se ha relacionado con una mayor respuesta fibrótica en el hígado, lo que plantea dudas sobre su papel exacto en lesiones 9, 10.
La naturaleza heterogénea del compartimento de células progenitoras durante mucho tiempo ha sido sugerido por estudios de expresión génica que aislaron células progenitoras que expresan un solo marcador de la superficie celular mediante microdisección o métodos basados en la clasificación 1, 11. De hecho, recientemente, una nueva combinación de marcadores de superficie utilizando GP38 (podoplanin) inequívocamente vinculada marcadores individuales anteriores de células progenitoras a diversos subconjuntos 12. Es importante destacar que estos subconjuntos no sólo diferían en su expresión de marcadores de superficie, pero también mostraron alteraciones funcionales durante 12 lesiones.
Múltiples modelos animales se han utilizado para investigar la activación de células progenitoras y la regeneración del hígado. Parece que los distintos tipos de lesiones promueven la activación de diferentes subconjuntos de células progenitoras 12. Esto podría explicar la phenotypic divergencia de la reacción ductular observada en humanos 4. Por lo tanto, los complejos análisis fenotípicos y funcionales de las células progenitoras son fundamentales para entender su papel en las lesiones y el verdadero significado de la reacción ductular en las enfermedades hepáticas.
Además de combinaciones de marcadores de superficie, las diferencias cruciales en protocolos de aislamiento de células complican aún más las conclusiones basadas en estudios anteriores 2. Una cantidad sustancial de estudios abordaron el papel de las células progenitoras que difieren mucho en su protocolo de aislamiento (por ejemplo, la disociación de hígado (combinación de enzimas y la duración del proceso), de densidad media, y la velocidad de centrifugación) 2. Una técnica de aislamiento optimizado, proporcionando una mejor viabilidad de las poblaciones de células raras y reflexiva de la composición subconjunto, se ha desarrollado y publicado recientemente 12. El objetivo de este artículo es proporcionar una más detprotocolo ailed de este procedimiento de aislamiento de células del hígado y el análisis de subconjunto para permitir la reproducción correcta de la técnica. Además, el protocolo incluye una comparación con el método de aislamiento anterior para demostrar las diferencias en comparación con el nuevo protocolo.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo con la aprobación de los comités de ética y cuidado de los animales de la Universidad de Homburg Medical Center.
1. Preparación de Materiales y búferes
- Recién preparar todos los tampones necesarios para la digestión del hígado utilizando componentes estériles y una campana laminar para evitar la contaminación bacteriana.
- Preparar el tampón de colección (CB) mediante la mezcla de 49,5 ml de medio RPMI y 0,5 ml de suero bovino fetal (FBS; baja endotoxina, inactivado por calor) para lograr una solución al 1% (v / v). Almacenar la solución en hielo hasta su uso posterior.
NOTA: Aproximadamente 25 ml de CB es necesaria para digerir un hígado entero. - Preparar el tampón de digestión (DB) utilizando los siguientes ingredientes: medio RPMI, 1% (v / v) de FBS (baja endotoxina, inactivado por calor), colagenasa P (0,2 mg / ml), DNasa I (0,1 mg / ml) y dispasa (0,8 mg / ml).
NOTA: Aproximadamente 25 ml de DB es necesario para digerir un hígado conjunto. Pre-calentar el PP en tque 37 ° C baño de agua antes de su uso. - Reconstituir las enzimas a la llegada en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS; collagense P y dispasa) o en DNasa I buffer (50% (v / v) de glicerol, 1 mM MgCl 2, y Tris-HCl 20 mM; pH 7,5) , alícuotas, y almacenarlo a -20 ° C. Almacenar la DNasa I buffer a 4 ° C y usarla dentro de dos meses.
2. Preparación de hígado sola suspensión celular
- La eutanasia a los ratones de tipo salvaje no tratados por dislocación cervical, de acuerdo con la ética locales y los comités de cuidado animal.
- Coloque los ratones en una tabla de disección y humedecer la piel con el 70% de etanol. Con unas tijeras, abrir el abdomen con una incisión en la línea media de la piel, seguido de un Y-incisión hacia las extremidades. Abrir el peritoneo hasta el esternón con las tijeras. Con el fin de descubrir el hígado, el intestino desplazar suavemente hacia el lado derecho con un bastoncillo de algodón.
- Con la ayuda de tijeras y pinzas, retire los lóbulos del hígado,dejando la vesícula biliar atrás, y evitar la contaminación con el tejido conectivo. Pesar el hígado y colocarlo sobre hielo en una placa de Petri que contiene HBSS.
- Coloque los lóbulos del hígado en un plato Petri secar y cortar el tejido hepático en cubos homogéneos aproximadamente 2 mm de un lado usando un bisturí. Transferir las piezas en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
- Añadir 2,5 ml de DB al tubo cónico de centrífuga de 15 ml que contenía las piezas del hígado y lo coloca en un baño de agua a 37 ° C para iniciar el proceso de digestión (un hígado sano tarda 60-70 minutos y un hígado cirrótico tarda 80-90 minutos ).
NOTA: Si uno toda hígado son digeridos, el hígado debe ser separado en dos tubos de 15 ml de centrífuga cónico para asegurar una buena viabilidad de las células. - Preparar un nuevo tubo de centrífuga cónico de 15 ml para recoger las células del hígado liberados. Colocar una poliamida 100-m de malla de filtro en la parte superior del tubo y mojar la malla con 800 l de CB. Se coloca el tubo de centrífuga cónico en hielo.
- Mezclar el samples en el baño de agua a 37 ° C después de 5 y 10 minutos con el fin de apoyar el proceso de digestión agitando el tubo de centrífuga cónico de 15 ml que contenía las piezas del hígado.
- 15 minutos después de comenzar la digestión, mezclar suavemente los pedazos de hígado usando una pipeta de 1.000 l con una punta de corte que permite a los pedazos de hígado para pasar a través fácilmente. Colocar los tubos de nuevo en el baño de agua y permitir que las piezas se asienten durante 2 min.
- Eliminar el sobrenadante que contiene las células diseminadas (típicamente 2x 700 l) y añadirlo al tubo preparado en la etapa 2.6. Vuelva a colocar el sobrenadante se retiró con DB (2x 700 l) y colocarlo de nuevo en el 37 ° C baño de agua.
- Repetir el procedimiento descrito en el paso 2.8 (típicamente a 30, 40, 50, 55, y 60 min) hasta que aproximadamente 60 a 70 min han pasado desde el inicio de la digestión. De 40 min en adelante, las piezas restantes del hígado deben ser lo suficientemente pequeños para pasar a través de una punta de pipeta de 1000-l sin cortar.
NOTA: hígado sano es digested totalmente dentro de 60 a 70 min, mientras que el hígado fibrótico necesita típicamente 80 a 90 min. En este punto del tiempo, el tejido hepático no debe ser visible en el tubo de centrífuga cónico de 15 ml que contenía las piezas del hígado, y todas las células liberadas debe ser transferido en el tubo preparado en la etapa 2.6. - Al final del proceso de digestión, recoger las células y centrifugar ellos durante 8 minutos a 180 xg y 4 ° C (usando reducida aceleración / 4 y desaceleración / 2).
- Resuspender el sedimento celular en 1 ml de cloruro de amonio-potasio (ACK) de tampón de lisis y se incuba durante 1 min a temperatura ambiente con el fin de lisar las células rojas de la sangre. Se detiene la reacción mediante la adición de 5 ml de CB, y centrifugar las células durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2). Resuspender las células en 4 ml de CB y almacenarlos en el hielo. Contar las células, como se describe en el paso 3.
NOTA: El sedimento celular se suelta, y por lo tanto el sobrenadante se pipetea de distancia en vez de ser decantado.3. Determinación del recuento de células mediante citometría de flujo
NOTA: para determinar los recuentos de células, un contador de células automatizado o, idealmente, el flujo de la cuantificación de células basado citometría-se describe a continuación se sugiere en lugar del método basado en cámara de Neubauer clásica. La suspensión de hígado de una sola célula se describe en el paso 2 contiene células parenquimatosas y no parenquimatosas (APN) con diferentes tamaños y en gran medida los niveles de detalle. La exclusión adecuada de los desechos celulares junto con el sobre-gating dispersión frontal, dispersión lateral (FSC-SSC) característico de CPN cuando usando citometría de flujo asegura el éxito del protocolo descrito 12.
- Preparar una alícuota de la suspensión de células del hígado (20 l) y añadir 174 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 6 l de yoduro de propidio (PI; concentración final 0,375 mg / ml). Añadir contar bolas que permiten la cuantificación de las células.
- Puerta de SSC-A-FSC-A para evitar escombros y excluir aún más dobletes utilizando FSC-H y FCS-A.
NOTA: Es importante seguir la estrategia de compuerta representado en la figura 2. - Puerta de las células muertas PI-positivo, miden 30 l a partir de sus muestras, y registrar los eventos. Siga directriz del fabricante para calcular el recuento de células.
NOTA: Siga los pasos 4 para citometría de flujo de medición, los pasos 5 y 6 para el aislamiento de células progenitoras con base magnética, y los pasos 7 para citometría de flujo especie de sub-poblaciones progenitoras.
4. La tinción de la sola suspensión celular de hígado para el análisis de citometría de Fow Progenitor subconjuntos
Anticuerpo Clon Anfitrión / isotipo De la Concentración [mg / ml] Dilución CD64 X54-5 / 7.1 IgG1 de ratón, κ 0,5 1: 100 CD16 / 32 93 Rat IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD45 30-F11 IgG2b de rata, κ 0,2 1: 200 CD31 MEC13.3 Rat IgG2a, κ 0,5 1: 200 ASGPR1 Policlonal IgG de cabra 0,2 1: 100 podoplanin 1/8/2001 Hámster sirio IgG 0,2 1: 1.400 podoplanin 1/8/2001 Hámster sirio IgG 0,5 1: 1.400 CD133 Mb9-3G8 IgG1 de rata 0.03 3 l CD133 315-2C11 Rat IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD34 RAM34 Rat IgG2a, κ 0,5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Rat IgG2, κ 0,5 1: 800 CD157 BP-3 IgG2b de ratón, κ 0,2 1: 600 EpCAM G8.8 Rat IgG2a, κ 0,2 1: 100 Sca-1 D7 Rat IgG2a, κ 0.03 10 l IgG2b de ratón, κ MPC-11 0,2 IgG1 de rata RTK2071 0,2 IgG2b de rata, κ RTK4530 0,2 Rat IgG2a, κ RTK2758 0,5 Rat IgG2a, κ RTK2758 0,2 Hámster sirio IgG SHG-1 0,2 Hámster sirio IgG SHG-1 0,5 Normales de control de IgG de cabra Policlonal IgG de cabra 1 Burro anti-IgG de cabra burro IgG 2 1: 800 estreptavidina 1 1: 400 Tabla 1.
Anticuerpo 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 IgG2b de rata, κ
0,5 l+ + + + CD31 biotina + Rat IgG2a, κ
0,5 l+ + + ASGPR1 purificado + + Normales de control de IgG de cabra
0.2 l+ + podoplanin APC + + + Hámster sirio IgG
1 l de una dilución 1:14+ CD133 PE + + </ Td> + + IgG1 de rata
0,45 lBurro anti-cabra
Alexa Fluor 488+ + + + + estreptavidina
Alexa Fluor 405+ + + + + Tabla 2.
- Colocar una alícuota de la suspensión celular de la etapa 2.11 en un tubo de reacción (1,5 ml) que contiene 2,5 x 10 5 células, determinadas como se describe en el paso 3.
- Centrifugar las células durante 3 minutos a 300 xg y 4 ° C utilizando una microcentrífuga.
NOTA: En este punto, una bomba de vacío se puede utilizar para eliminar cuidadosamente el sobrenadante. - Resuspender el sedimento celular en la mezcla de Fc-bloque y se incuba durante 5 minutos en hielo. Preparar la mezcla Fc-bloque con un volumen total de 50 l por mancha. Añadir 10 l de reactivo de FcR-bloqueo, 1 l de purificado anti-CD64 (1: 100; 0,5 mg / mancha), y 40 l de tampón de tinción (tampón ST: HBSS, 1% (v / v) FBS, y 0,01% azida de sodio) por mancha.
NOTA: La azida de sodio es altamente tóxico. Utilice equipo de protección personal adecuado, como guantes de nitrilo, una bata de laboratorio, y una mascarilla. - Añadir 50 l de la tinción de la mezcla a las células (el volumen total de las células es ahora 100 l) e incubar las células con la mezcla de anticuerpos, protegido de la luz y de 20 min en hielo.
- Preparar la mezcla de anticuerpo con un volumen total de 50 l por mancha. Por 50 l de ST tampón, añadir los siguientes anticuerpos conjugados para la tinción básica: CD45 (0,5 mu l; 1: 200; 0,1 mg / mancha), CD31 (0,5 mu l; 1: 200; 0,25 mg / mancha), ASGPR1 (1 l ; 1: 100; 0,2 mg / mancha), podoplanin (1 l de una dilución 1:14; dilución 1: 1.400 extremo; 0,014 g / mancha) y CD133 (3 l; 0,09 mg / mancha).
NOTA: La tabla1 resume los clones de anticuerpos y diluciones utilizadas para las manchas de base y para los marcadores de superficie adicionales de los distintos subconjuntos. Preparar suspensiones de células adicionales para la mezcla de anticuerpos que contiene los controles de isotipo correspondientes y / o de fluorescencia menos uno controles (FMOs), como se muestra en la Tabla 2. - Añadir 400 l de tampón de ST a cada muestra y centrifugar las células durante 4 min a 300 xg y 4 ° C.Discard el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de mezcla de anticuerpo secundario que contiene 0.125 l de burro anti-IgG de cabra (1: 800; 0,25 mg / mancha) y 0,25 l de estreptavidina fluorescente conjugado (1: 400; 0,25 mg / mancha) en 100 l de tampón de ST.
- Se incuban las células mientras que está protegido de la luz y con la mezcla de anticuerpos durante 20 min en hielo. Añadir 400 l de tampón de ST a cada muestra y centrifugar las células durante 4 min a 300 xg y 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 300 l de ST aficionadoer que contiene 0,25 mg / ml PI.
NOTA: La viabilidad celular de las células progenitoras disminuye con el tiempo; por lo tanto, se sugiere para medir muestras frescas tan pronto como sea posible.
5. magnética enriquecimiento por Microbead de Células Progenitoras
- Transferir una alícuota de la suspensión del hígado de una sola célula que contiene 1,5-2 x 10 6 células, basados en el recuento de células determinado como se describe en el paso 3, en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
- Centrifugar las células durante 8 min a 180 xg y 4 ° C (usando reducida aceleración / 4 y desaceleración / 2).
NOTA: Por lo general, tendrá que ser separada en tres tubo de centrífuga cónico de 15 ml uno C57Bl / 6 de hígado de ratón sano (o 1 g de tejido de hígado). - Resuspender las células en 400 l de HBSS 0,5% (v / v) de albúmina de suero bovino (BSA) y añadir 40 l de microperlas anti-CD31-y 30 l de microperlas anti-CD45. Se incuban las células durante 15 min a 4 ° C.
NOTA: No exceda tque el tiempo de incubación, ya que la pureza de la separación se reduce de manera significativa. - Añadir 5 ml de HBSS 0,5% (v / v) de BSA a las células y centrifugar ellos durante 8 minutos a 180 xg y 4 ° C (usando reducida aceleración / 4 y desaceleración / 2).
- Resuspender el sedimento celular en 100 l de perlas de eliminación de células muertas y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. Mientras tanto, preparar una columna de separación LS y calibrarlo con 3 ml de HBSS 0,5% (v / v) de BSA.
NOTA: No exceda el tiempo de incubación, ya que la pureza de la separación se reducirá significativamente. - Añadir 900 l de HBSS 0,5% (v / v) de BSA a las células, filtrar utilizando 100-m de malla de filtro de poliamida, y cargarlos en la columna de separación LS.
NOTA: Cargar un hígado entero en una sola columna de separación LS. - Lavar la columna tres veces con 3 ml de HBSS 0,5% (v / v) BSA y recoger el flujo a través.
- Centrifugar el flujo a través de 8 min a 180 xg y 4 ° C (usando reducida acceleration / 4 y desaceleración / 2).
- Resuspender el sedimento celular o bien en tampón (RB) (PBS y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)) que contienen 0,5% (v / v) BSA o tampón ST, dependiendo del procedimiento experimental adicional de aclarado.
La purificación a base de Microbead 6. magnético automático de células progenitoras de los subconjuntos de células combinado a partir de hígados Múltiples
NOTA: Dado que los subconjuntos de células progenitoras representan las poblaciones de células raras, a menudo es necesaria la combinación de células de varios hígados para conseguir el número de células suficientes para experimentos adicionales. Como un ejemplo, CD133 + y + GP38 separación de células se describe a continuación.
- El aislamiento de progenitores + CD133
- Después del paso 5.9, contar las células, tal como se describe en el paso 3, y volver a suspender hasta 10 6 células (típicamente 4-6 puesta en común de muestras de hígado sanos) en 100 l de RB.
- Añadir anti-CD64 1: 100 y anti-CD16 / 32 1: 100 a las células y incublos comió en hielo durante 5 min. Añadir 1: 100 anti-CD133 anticuerpo biotinilado a las células y se incuba en hielo durante otros 10 min.
- Añadir 5 ml de RB y centrifugar durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2).
- Resuspender las células en 400 l de RB y añadir 10 l de microperlas anti-biotina. Incubar la muestra durante 15 min a 4 ° C. No exceda el tiempo de incubación, ya que esto reduce la pureza de las muestras.
- Añadir 5 ml de RB y centrifugar durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2). Resuspender el precipitado en 1 ml de RB.
- Aislamiento de GP38 + progenitores
- Después del paso 5.9, contar las células, tal como se describe en el paso 3, y volver a suspender hasta 10 6 células (típicamente 4-6 puesta en común de muestras de hígado sanos) en 100 l de RB.
- Añadir anti-CD64 1: 100 y anti-CD16 / 32 1: 100 a las células y se incuba en hielo durante 5 min. A continuación, añadir al menos 1:100 anti-GP38 biotinilado anticuerpo a las células y se incuba en hielo durante otros 10 min.
- Añadir 5 ml de RB y centrifugar durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2).
- Resuspender las células en 400 l de RB y añadir 5 l de microperlas anti-biotina. Incubar la muestra durante 15 min a 4 ° C. No exceda el tiempo de incubación, ya que esto reduce la pureza de las muestras.
- Añadir 5 ml de RB y centrifugar durante 8 minutos a 180 x g y 4 ° C (con reducción de la aceleración / deceleración 4 y / 2).
- Resuspender el sedimento celular en 1 ml de RB.
- Pasos comunes después de la etapa 6.1 o 6.2
- Se coloca el tubo de centrífuga cónico de 15 ml que contiene las suspensiones de células marcadas magnéticamente en un enfriamiento del bastidor 5 con dos tubos vacíos adicionales para la recogida de las fracciones positivas y negativas. Coloque la parrilla frío en la plataforma de separación del separador.
- Utilice el programa de selección positiva(Possel_d2) con una extensa etapa de lavado entre cada muestra (opción de enjuague).
NOTA: El uso de la columna basado en la separación manual de células en lugar del separador automático reducirá la pureza de la muestra. - Recoger la fracción positiva y centrifugar durante 8 min a 180 xg y 4 ° C (usando reducida aceleración / 4 y desaceleración / 2).
- Resuspender el sedimento celular ya sea en RB o tampón ST, dependiendo del procedimiento experimental.
- Para un control de pureza, tomar una alícuota de las células y manchar como se describe en el paso 4.
7. clasificación de células Citometría de Flujo
NOTA: A de alta pureza tipo de cualquier subconjunto de células progenitoras se puede lograr con el protocolo descrito a continuación. El rendimiento global de las células es mucho menor que el que se describe en el paso 6 y es mejor para el análisis de la expresión génica.
Parámetro Ajuste Boquilla Tamaño 85 micras Frecuencia 46.00 - 46.20 Amplitud 38.30 - 55.20 Fase 0 retardo 28.68 - 28.84 Atenuación Apagado primer ensayo 284-297 objetivo Gap 9.-14 Presión 45 psi Tabla 3.
- Adquirir células del enriquecimiento basado en magnética (descrito en la etapa 5); contarlos, como se describe en el paso 3; y teñirlos de marcadores progenitoras (CD133, GP38), CD31, CD45 y ASGPR1, tal como se explica en el paso 4.
- Para preparar el medio de clasificación (SM): libre de rojo fenol DulbecModificado Medio co de Eagle (DMEM) que contiene 0,5% (v / v) de BSA y 0,01% (v / v) de azida de sodio. Resuspender las células teñidas en SM, transferirlos a un tubo de fondo redondo de polipropileno, y colocarlos en hielo.
NOTA: La azida de sodio es altamente tóxico. Utilice equipo de protección personal adecuado, como guantes de nitrilo, una bata de laboratorio, y una mascarilla. No utilice azida de sodio si se utilizan las células clasificadas para los ensayos funcionales. - Utilice el software apropiado para el tipo de clasificador utilizado para el aislamiento de células. Abra el software y siga las instrucciones del fabricante para configurar los parámetros de clasificación y especificaciones de la máquina.
NOTA: Las especificaciones de la máquina se resumen en la Tabla 3. Mientras especificaciones de la máquina podría ser diferente en diversas instituciones, es importante señalar que la reducción de la presión de clasificación y un tamaño de boquilla más grande es necesario (45 psi y la boquilla 85-micras) para aumentar la viabilidad de la célula progenitora population y la calidad del ARN preparado a partir de las células clasificadas. Es importante utilizar las células progenitoras del hígado enriquecido para el establecimiento de la compensación. Otras poblaciones de hígado o leucocitos tienen diferentes autofluorescencia y conducir a una solución subóptima de la población del estroma y en una estrategia falsa compuerta. - Calibrar la máquina y colocar un tubo de fondo redondo de 5 ml de polipropileno que contiene 350 l de SM en el dispositivo de recogida de tipo. Iniciar la adquisición de la muestra y tipo. Suma 1.000 eventos de la subpoblación y detener el flujo de la muestra.
- Tome el tubo del dispositivo de clasificación y medir las células clasificadas en el citómetro de flujo. Identificar el porcentaje de la población celular clasificada presente entre las células vivas. Este porcentaje da la pureza de las células clasificadas.
- Si la pureza especie supera el 95%, colocar un tubo de fondo redondo de 5 ml de polipropileno que contiene 350 l de tampón de lisis RLT en el dispositivo de recogida de tipo.
- Comience la clase y recoger 7,000-10.000 eventos por subpoblación del estroma.
- Transferir el tampón de lisis RLT que contiene las células clasificadas en un tubo de reacción y DNasa libre de RNasa y almacenar las muestras a -80 ° C hasta su posterior análisis.
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Representative Results
El procedimiento que aquí se presenta para la digestión del hígado usando una nueva mezcla de los resultados de las enzimas en una suspensión de una sola célula que contiene parénquima y células hepáticas no parenquimatosas (Figuras 1 y 2a). Después de la lisis ACK-de las células rojas de la sangre, el flujo directo análisis de citometría de la suspensión de célula única es posible (Figuras 1 y 2). La estrategia gating implica la exclusión de dobletes y células muertas (Figura 2a). Las células que son negativas para CD45, CD31, y ASGPR1 son cerradas. Esta población incluye las células progenitoras del hígado y puede ser agrupado en base a su GP38 y la expresión CD133 (figura 2a). Los GP38 + CD133 + y el GP38 - células CD133 + representan las poblaciones de células más abundantes entre CD45 - CD31 - ASGPR1 - células en el liv ratón adulto sanoer (Figura 2a, b). Estos subconjuntos difieren en la expresión de marcadores de superficie adicionales previamente asociados con células progenitoras, tales como EpCAM, Sca-1, y CD34 (Figura 2c).
Las células progenitoras podrían agotarse a partir de células hematopoyéticas y del parénquima, tales como los hepatocitos y las células endoteliales hepáticas sinusoidal (LSECs) (Figuras 1 y 3), y células progenitoras podrían ser purificado adicionalmente con aislamiento basado en microbead magnético (Figura 3a, b) o con clasificación de alta pureza (figuras 1 y 4). El magnético aislamiento a base de microperlas de CD133 + o GP38 + células resultados en más del 90% de pureza (Figura 3a, b) con respecto a cualquier células contaminantes CD45, CD31, o ASGPR1 +, y las células siguen siendo muy viable (Figura 3a, b).
2. Esto es especialmente relevante para la elección de la mezcla de enzimas utilizadas para la disociación de tejido. Aquí, se usó colagenasa P en lugar de colagenasa D para el hígado 1, 2, 8. Es importante destacar que, el nivel de expresión de CD133 en células progenitoras y el rendimiento de las poblaciones de células aisladas se redujeron en gran medida en la presencia de colagenasa D (Figura 5a, b). Además de esto, nuestra mezcla contenía dispasa, que es muy adecuado para la disgregación suave y subcultivo de diversos tipos de células 13. Colagenasa P junto con dispasa representauna combinación ideal para la disociación de células del hígado para el análisis de células progenitoras. Esta combinación también fue superior a la tripsina o la digestión a base de pronasa del hígado (datos no mostrados). Es igualmente importante tener en cuenta que la densidad de centrifugación, como el enriquecimiento a base de Percoll 2, 14, no era necesario que el progenitor análisis presentados en este protocolo.
Figura 1: Flujo de trabajo del protocolo descrito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Clasificación novela de subconjuntos progenitoras hepáticas. Una sola célulasuspensión se preparó a partir de hígados sanos y posteriormente se tiñeron con un panel de marcadores de superficie: CD45, CD31, CD133 y GP38 (A). Para la exclusión de células muertas, se utilizó yoduro de propidio (PI). gráficos de puntos representativos con la estrategia de compuerta se representan. Las puertas se utilizan para citometría de flujo determinación del recuento de células también están marcadas. (B) Los porcentajes y el número absoluto de células presentes por gramo de tejido hepático de los diferentes subconjuntos de células del estroma entre las células CD45-negativas en de tipo salvaje animales no tratados se muestran. (C) Los histogramas muestran características distintivas de marcadores subconjuntos de células del estroma en un hígado sano. La expresión alta de CD90.2 y la presencia de CD157 son específicos para A, mientras que CD34 es específico para subpoblación B. Sca-1 está presente en B, C, D y EpCAM sólo está presente en la población C y D. Media ± SEM; los datos (AC) representan 2-3 experimentos independientes con n = 3-4 por experimento. El wer de datose comparó el uso de un no apareado, de dos colas prueba T * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Magnetic enriquecimiento basado en microbead y purificación de células automatizado. (A) magnética basada en el enriquecimiento microbead de CD45 -, CD31 - y ASGPR1 - células se representan antes y después del mismo. (B) representativos gráficos de puntos de los aislamientos de células basados en microesferas automatizados se representan para CD133 + y células GP38 +, a la izquierda. A la derecha, la viabilidad de las poblaciones de células antes y después de enriquecimiento se muestran como el porcentaje deyoduro de propidio (PI) las células gramnegativas. La media ± SEM; los datos (AB) representan 3 experimentos independientes con n = 3 por experimento. Los datos se compararon mediante un desapareado, de dos colas prueba T * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La citometría de flujo tipo de subconjuntos progenitoras con alta pureza. Las gráficas de puntos representan la pureza de las poblaciones de células en las muestras post-ordenados (ordenar). Los datos representan 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5: Comparación de las enzimas de digestión. La suspensión de una sola célula se preparó usando colagenasa P (como se describe en el paso 2) o colagenasa D (1 mg / ml + DNasa-I 0,1 mg / ml) a partir de hígados sanos y se tiñó posteriormente con un panel de marcadores de superficie: CD45, CD31, CD133, y GP38 (A). Se muestran los porcentajes de células presentes por gramo de tejido hepático de los diferentes subconjuntos de células del estroma entre las células CD45-negativas en de tipo salvaje animales no tratados. (B) La mediana de intensidad de fluorescencia de CD133 se representa para la población de células CD133 +. La media ± SEM; los datos (AB) representan 2 experimentos independientes con n = 3 por experimento. Los datos se compararon mediante un desapareado, de dos colas prueba T * P <0,05, ** P <0,005, *** P <0,0001.target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Inflamación del hígado y lesiones de diferentes orígenes desencadenan procesos regenerativos en el hígado que se acompañan de la expansión de células progenitoras y la activación 2, 3. Estas células progenitoras del hígado poseen características de las células madre y probablemente juegan un papel importante en el mecanismo patológico de varias enfermedades del hígado.
La heterogeneidad de las células progenitoras hepáticas tiempo se ha sugerido. La reevaluación de los subconjuntos progenitoras del hígado utilizando una novedosa combinación de marcadores de superficie de CD133 y GP38 podría identificar subconjuntos que llevan diferentes marcadores de superficie y expresar un conjunto único de genes relacionados con la inflamación del hígado durante la lesión 12. El método aquí descrito permite el flujo directo análisis de citometría de células raras y su comparación directa en varios modelos de lesión hepática. Esto es especialmente relevante, ya que diversas lesiones desencadenan la activación de múltiples progenitora subsets que podría ser el reflejo de la heterogeneidad celular observada en las reacciones ductular 3, 4, 11, 12. En particular, una pequeña fracción de tejido hepático murino (0,2 g) es suficiente para aislar células suficientes para la citometría de flujo análisis de progenitores utilizando el método descrito.
La citometría de flujo clasificación proporcionar poblaciones de alta pureza de los subconjuntos es necesario explorar sus singulares perfiles de expresión génica. En informes anteriores se ha descrito el flujo de aislamiento de células progenitoras basado citometría-15, 16. Sin embargo, el protocolo presentado aquí proporciona un método optimizado que asegura la alta pureza y la viabilidad de estas células. En particular, en técnicas de cultivo in vitro y expansión descritos anteriormente se pueden combinar muy bien con el protocolo presentado aquí 15
Muchos tipos de clasificadores de citometría de flujo están disponibles en varias instituciones, y sus instrumentaciones particulares podrían ser ligeramente diferentes. Sin embargo, los principios generales para la clasificación de células se presentan en el protocolo descrito. Generalmente, son absolutamente necesarias una presión más baja y más grande tamaño de la boquilla, independientemente de los tipos y las especificaciones de la máquina. Por otra parte, la utilización de un medio de clasificación adecuado puede aumentar significativamente la viabilidad y la calidad del ARN de las células clasificadas, que es un factor importante, especialmente para estudios de expresión génica. La clasificación de las células progenitoras, sin embargo, reduce en gran medida la viabilidad celular, y el rendimiento de las células después de la clasificación es relativamente bajo (para alta pureza tipo de 7-10,000 eventos / subpoblación, 4-5 hígados sanos necesitan para su agrupación). Esto podría ser un factor limitante para su posterior análisis in vitro. Sugerimos aislamiento basado en microbead magnética en elensayos in vitro, debido a su mayor rendimiento y la viabilidad celular, y citometría de flujo de clasificación para el análisis de la expresión génica, especialmente cuando se analiza más subconjunto especificado y se necesitan aislamientos.
Basado en el hecho de que la viabilidad de las células se reduce en gran medida después de citometría de flujo de clasificación, un aislamiento basado en microbead magnético automatizado de las células progenitoras se ha desarrollado y se presenta aquí. Permite para el aislamiento de un mayor número de células progenitoras con alta pureza (la combinación de múltiples hígados). Además, la viabilidad de las células se mantiene, ya que el tiempo necesario para el proceso de aislamiento se reduce considerablemente. Mientras que los números más bajos de células progenitoras se pueden expandir in vitro 1, 2, 15, 16, se recomienda considerar cómo estas manipulaciones in vitro podrían alterar las características celulares de células madre / Progentrole los células descritas para otras poblaciones mesenquimales y células del estroma 17, 18.
La principal limitación del aislamiento basado en microbead magnética que se presenta es que el CD133 + y las poblaciones de células GP38 + representan células heterogéneas. marcadores de superficie adicionales podrían ser necesarias para identificar las poblaciones de células más pequeñas.
La comprensión de cómo las células madre hepáticas y progenitores se relacionan entre sí está lejos de ser completa, a pesar de excelentes estudios de Lola Reid y otros 1, 8, 19. Por lo tanto, la consideración cuidadosa de técnicas que resultan en mayores rendimientos y la viabilidad, tales como el sugerido aquí, podría ayudar a extender los análisis de subconjuntos progenitoras y la comprensión de sus relaciones interconectadas.
t En general, hemos descritodetalló aislamiento y análisis de subconjuntos progenitoras del hígado que recientemente se distinguían 12. Por otra parte, mediante el empleo de una combinación nueva enzima, progenitores raras podrían ser analizados por mediciones directas citometría de flujo. Además, el protocolo se muestra cómo para enriquecer células progenitoras con una alta pureza, utilizando la clasificación de células o una técnica basada en microbead automatizado.
Solución de problemas:
Los porcentajes de los desechos celulares y células que mueren son altos
Si, durante la digestión (etapa 2), el pipeteado de las muestras de hígado es demasiado duro, el porcentaje de células moribundas en los incrementos de suspensión de una sola célula. Si el hígado se corta en pedazos más grandes de lo sugerido, la digestión es menos eficiente y da como resultado más muerte celular durante la preparación.
Después de completar el procedimiento en el paso 5, la pureza de las muestras no es suficiente
Si los percentages de restos de células y las células que mueren en la suspensión de una sola célula preparados en la etapa 2 son demasiado altos, las microperlas se unen inespecíficamente, y por lo tanto, la pureza del aislamiento se reduce considerablemente.
bajo el número de células después de la purificación a base de microbead
Para el éxito del protocolo descrito, es importante que la relación de las células a microperlas es óptimo, como se sugiere en el protocolo. Utilizando más microperlas reduce la pureza y disminuye el rendimiento y la viabilidad de las células aisladas. Si se utilizan marcadores de superficie distintas de las presentadas en el protocolo para el aislamiento de progenitores subconjunto, la proporción óptima de las células para microperlas debe ser determinado.
Basada aislamiento microbead magnético del GP38 + CD133 - población
Siga los pasos en la sección 5. En el paso 5.3, añada además 10 l anti-CD133 + microperlas, a continuación, siga los pasos 5, 6.2 y 6.3 como se describere.
El cálculo de número absoluto de células
El peso del hígado se utiliza para calcular cómo están presentes por gramo de tejido hepático muchas células de un cierto subconjunto.
(% De la subpoblación de células vivas (basado en citometría de flujo) / 100) x número total de células de estar aislado de la pieza del hígado = Z
(1 / peso de la pieza de hígado) x Z = número de células / g de tejido hepático
Otras poblaciones de células que se pueden aislar con este método
Es posible aislar las siguientes células del hígado que utilizan este protocolo digestión: células CD45 + (o subpoblaciones de células hematopoyéticas, por ejemplo, células de Kupffer, células dendríticas, células T, células NK, etc.) y LSECs. El protocolo de la digestión no es adecuado para el aislamiento de hepatocitos o células estrelladas hepáticas. Estas células están presentes en el número de células relativamente bajas y demuestran la viabilidad reducida en comparación con other métodos disponibles.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Premio Fundación Kovalevskaja Sofja Alexander von Humboldt para VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
