We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
השכפול של הדנ"א הוא תכונה נשמרת כל החיים התאיים. בעוד הזהות ומספר הרכיבים שכפולים להשתנות משמעותית, המנגנונים הכלליים משותפים בין אבולוצית 1. כאן אנו מתארים מבוססים-ג'ל, ניסויים קינטיים רציפים, באמצעות מצעים רדיואקטיבי, להבנת קינטיקה של סינתזת DNA גדיל מפגר במבחנה על ידי רכיבים של replisome T7. המנגנון שכפול של T7 bacteriophage הוא פשוט מאוד, המורכב רק ארבעה חלבונים (פולימראז DNA, gp5, והגורם שלה processivity, thioredoxin החיידק, את gp4 primase-helicase bifunctional, ואת החלבון חד גדילי הדנ"א מחייב, GP2. 5) 2. תכונה זו עושה את זה מערכת מודל אטרקטיבית כדי לחקור את המנגנונים הביוכימיים המשומרים מעורבים שכפול הדנ"א.
דגש מיוחד מושם על היווצרות של פריימרים ribonucleotide ידי DNA T7 primase, critical צעד בייזום של סינתזה של DNA. בנוסף, אפשר גם לבחון את השימוש של פריימרים אלה על ידי פולימראז T7 DNA או חלבונים שכפולים אחרים על ידי כולל אותם לתערובת התגובה. T7 primase-helicase, gp4, מזרז היווצרות של פריימרים עבור סינתזה של DNA על רצפי DNA ספציפי הנקרא אתרי הכרה primase, או PRS, (5'-GTC-3 '). ציטוזין ב PRS הוא נסתר, זה הכרחי להכרה של האתר, אבל זה לא מועתק לתוך המוצר 3. הצעד הראשון סינתזה פריימר ידי gp4 כרוך היווצרות של dinucleotide pppAC, אשר ניתנת להארכה אז אל trimer, ובסופו של דבר פריימרים tetranucleotide פונקציונלי pppACCC, pppACCA, או pppACAC תלוי רצף בתבנית 4. פריימרים אלו לאחר מכן ניתן להשתמש על ידי פולימראז T7 DNA ליזום סינתזת ה- DNA, שהוא גם תהליך 5 בסיוע gp4, 6. בהקשר זה, primaseתחום מייצב את tetraribonucleotides הקצר מאוד עם התבנית, מניעת דיסוציאציה שלהם, עוסק DNA פולימרז באופן הדרך להבטיח פריימר / תבנית לתוך פולימראז האתר פעיל 7. צעדים אלה (סינתזת פריימר RNA, handoff פריימר כדי פולימראז, ורחבה) חוזרים מחזורים רבים לשכפל הגדיל המפגר חייבים להיות מתואם עם השכפול של הגדיל המוביל.
המבחנים המתוארים כאן הם רגישים מאוד והוא יכול להתבצע בתוך מסגרת זמן מתונה. עם זאת, הם נמוכים יחסית תפוקה ו בזהירות רבה יש מבוצעת השימוש וסילוק חומרים רדיואקטיביים. תלוי במהירות שבה היא מתרחשת, אפשר להעסיק מכשיר מהיר-להרוות להשיג דגימות בסקלות הזמן נוחות עבור ניתוח משמעותי של קורסי זמן תגובה כלשהי באחד משני יציבה או במצב טרום היציב. לאחרונה, השתמשנו מבחנים המתוארים כאן כדי לספק evidencדואר לחשיבות שחרור פריימר מהתחום primase של gp4 בייזום של שברי Okazaki. בנוסף, מצאנו עדויות של תפקיד רגולטורי עבור דנ"א חד-גדילי T7 חלבון מחייב, gp2.5, בקידום היווצרות פריימר יעיל וניצול 8.
הגורם החשוב ביותר בביצוע הניסויים אלה הוא הזמינות של אנזים מטוהר מאוד פעיל. במהלך עבודתנו עם gp4, למשל, מצאנו אחסון של האנזים מטוהרים חיץ (פוספט אשלגן 20 מ"מ, pH 7.4, 0.1 EDTA מ"מ, 1 מ"מ DTT) המכיל גליצרול 50% ב -20 ° C מוביל לירידה ב הפעילות הספציפית של התכשיר על פני כמה חודשים. ל…
The authors have nothing to disclose.
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
Tris base | SIGMA | 93362 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
[α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
[γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |