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Artículo de método

La bioluminiscencia e infrarrojo cercano de imagen de la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo de EAE de esclerosis múltiple en ratones

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DOI:

10.3791/55321

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1 de marzo de 2017

 , 
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

En este artículo

Resumen

Mostramos una técnica para la bioluminiscencia in vivo en vivo y en el infrarrojo cercano de formación de imágenes de la neuritis óptica y la encefalitis en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) para la esclerosis múltiple en ratones SJL / J.

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones SJL / J es un modelo para la esclerosis múltiple recurrente-remitente (EMRR). puntuaciones de EAE clínicos que describen déficit de la función de motor son lecturas básicas de la inflamación inmune mediada de la médula espinal. Sin embargo, las puntuaciones y el peso corporal no permiten una evaluación in vivo de la inflamación del cerebro y la neuritis óptica. Este último es una manifestación temprana y frecuente en aproximadamente 2/3 de los pacientes con EM. Aquí, se muestra métodos para la bioluminiscencia y de formación de imágenes en vivo en el infrarrojo cercano para evaluar EAE evocado neuritis óptica, inflamación del cerebro, y alteración de la barrera hematoencefálica (BBB) en ratones vivos utilizando un sistema de imagen in vivo. Un sustrato bioluminiscente activado por oxidasas mostró principalmente la neuritis óptica. La señal era específico y permite la visualización de los efectos de la medicación y cursos de tiempo de la enfermedad, que en paralelo las puntuaciones clínicas. nanopartículas fluorescentes pegilada que permanecían dentro del vasculature durante largos períodos de tiempo se utilizaron para evaluar la integridad BBB. Infrarrojo cercano de imágenes revela una fuga de acreditación en el pico de la enfermedad. La señal fue el más fuerte alrededor de los ojos. Un sustrato de infrarrojo cercano para metaloproteinasas de la matriz se utilizó para evaluar la inflamación EAE-evocado. Auto-fluorescencia interfirió con la señal, lo que requiere desmezcla espectral para la cuantificación. En general, imágenes de bioluminiscencia era un método fiable para evaluar la neuritis óptica y la medicación efectos de EAE asociado y fue superior a las técnicas de infrarrojo cercano en términos de especificidad de la señal, robustez, facilidad de cuantificación, y el costo.

Introducción

La esclerosis múltiple es causada por el ataque y la destrucción autoinmune de la vaina de mielina en el cerebro y la médula espinal1. Con una incidencia general de alrededor de 3,6 casos por cada 100.000 personas al año en mujeres y alrededor de 2,0 en hombres, la EM es la segunda causa más común de discapacidad neurológica en adultos jóvenes, después de las lesiones traumáticas2,3. La patología de la enfermedad es atribuida por factores genéticos y ambientales4 pero aún no se comprende completamente. Los linfocitos T autorreactivos entran en el sistema nervioso central y desencadenan una cascada inflamatoria que provoca infiltrados focales en la sustancia blanca del cerebro, la médula espinal y el nervio óptico. En la mayoría de los casos, estos infiltrados son inicialmente reversibles, pero la persistencia aumenta con el número de recaídas. Se han desarrollado varios modelos de roedores para estudiar la patología de la enfermedad. Los modelos más populares son la EAE remitente-recurrente en ratones SJL/J y la EAE primaria-progresiva en ratones C57BL6.

Las puntuaciones clínicas de EAE, que describen el alcance de los déficits de la función motora, y el peso corporal son el estándar de oro para evaluar la gravedad de la EAE. Estos signos clínicos concuerdan con el grado de infiltración de células inmunitarias y destrucción de mielina en la médula espinal y predicen moderadamente la eficacia del tratamiento farmacológico en humanos5. Sin embargo, estos signos reflejan principalmente la destrucción de los tractos de fibras ventrales en la médula espinal. En la actualidad, no existe un método fácil, no invasivo, fiable y reproducible para evaluar la infiltración cerebral in vivo y la neuritis óptica en ratones vivos.

Las imágenes in vivo concuerdan con los 3 principios "R" de Russel y Burch (1959), que afirman un Replacement, Reducación y Refinement de los experimentos con animales6, porque las imágenes aumentan las lecturas de un animal en varios puntos de tiempo y permiten una reducción de los números totales. En la actualidad, la inflamación o el estado de la mielina se evalúan principalmente ex vivo mediante inmunohistoquímica, análisis FACS o diferentes métodos de biología molecular7, todos ellos requiriendo ratones sacrificados en momentos específicos.

Se han desarrollado varias sondas de sistemas de imagen in vivo para evaluar la inflamación en la piel, las articulaciones y el sistema vascular. Las técnicas se basan en la activación de sustratos fluorescentes bioluminiscentes o de infrarrojo cercano por peroxidasas tisulares, incluyendo la mieloperoxidasa (MPO), las metaloproteinasas de matriz (MMPs)8, y las catepsinas9 o cyclooxygenase2. Estas sondas se han validado principalmente en modelos de artritis o aterosclerosis9,10. También se ha utilizado una sonda sensible a la catepsina para la obtención de imágenes de tomografía molecular de fluorescencia de EAE11. Las MMPs, particularmente MMP2 y MMP9, contribuyen a la disrupción de la BBB mediada por la proteasa en EAE y están reguladas al alza en los sitios de infiltración de células inmunes12, lo que sugiere que estas sondas pueden ser útiles para la obtención de imágenes de EAE. Lo mismo ocurre con las sondas basadas en peroxidasa o catepsina. Técnicamente, las imágenes de la inflamación en el cerebro o la médula espinal son sustancialmente más desafiantes porque el cráneo o la columna vertebral absorben señales bioluminiscentes e infrarrojas cercanas.

Además de los indicadores de inflamación, se han descrito sustancias químicas fluorescentes, que se unen específicamente a la mielina y pueden permitir la cuantificación de la mielinización13. Se descubrió que una sonda fluorescente de infrarrojo cercano, yoduro de 3,3'-dietiltiatricarbocianina (DBT), se unía específicamente a fibras mielinizadas y se validó como herramienta cuantitativa en modelos de ratón de defectos primarios de mielinización y en desmielinización evocada por cuprizona14. En EAE, la señal de DBT estaba bastante aumentada, lo que refleja la inflamación de las fibras de mielina5.

Un sello distintivo adicional de EAE y MS es la ruptura de la BBB, lo que resulta en un aumento de la permeabilidad vascular y la extravasación de células sanguíneas, líquido extracelular y macromoléculas en el parénquima del SNC. Esto puede provocar edema, inflamación, daño de oligodendrocitos y, finalmente, desmielinización15,16. Por lo tanto, la visualización de la fuga de BHE utilizando sondas fluorescentes, como la albúmina sérica bovina marcada con fluorocromo5, que normalmente se distribuyen muy lentamente de la sangre al tejido, puede ser útil para evaluar la EAE.

En el presente estudio, hemos evaluado la utilidad de diferentes sondas en EAE y mostramos el procedimiento para la técnica bioluminiscente más fiable y robusta. Además, discutimos los pros y los contras de las sondas de infrarrojo cercano para la actividad MMP y la integridad de BBB.

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Protocolo

1. EAE inducción en SJL / J Mice

  1. Ratones
    1. Utilice SJL ratones hembra de 11 semanas de edad / J y permitir que se habitúan a la sala de experimentación durante unos 7 días. Use n = 10 ratones por grupo.
    2. Para la evaluación de los efectos de la medicación, para administrar el fármaco y el placebo para el grupo control de forma continua a través del agua de bebida o a través de gránulos de comida a partir de 3 o 5 días después de la inmunización (n = 10 por grupo). Durante el pico de la enfermedad, administrar medicamentos o placebo con leche o 3% de copos de maíz remojadas en agua de azúcar.
  2. material de la inmunización
    1. Utilice un kit de la inducción de EAE que consiste en antígeno (péptido de la proteína proteolipídica, PLP139-151, 1 mg / ml de emulsión) en una emulsión con adyuvante completo de Freund (CFA, muertos por calor-Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) y 2 viales (5 mg cada uno) de la toxina pertussis liofilizado (PTX).
    2. Disolver la PTX (2 mg / ml) en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS; es decir, </ Em> añadir 1,5 ml de PBS a cada tubo PTX, mezclar bien, retirar con la misma punta de la pipeta, y añadir a 1 ml de PBS en un tubo de 50 ml); mezclar bien.
  3. Inmunización
    1. Inyectar PLP / CFA subcutáneamente en 2 porciones, cada 100 l, tanto en la base de la cola. No se inyecte en la parte posterior del cuello, porque las reacciones inmunes en la piel en la parte superior trasera del cuello o perturbarán la imagen de la cabeza y la médula espinal.
    2. Inyectar 100 l de PTX por vía intraperitoneal (ip), dos veces por ratón, la primera 1-2 h después de la inmunización y la segunda en 24 h.
    3. A los ratones de control, inyección de CFA sin PLP (2 porciones de 100 l), además de PTX sin PLP.
  4. Ratón manipulación después de la inmunización
    1. Pesar los ratones cada dos días hasta el día 7, y luego pesarlos todos los días.
      NOTA: Los ratones pierden aproximadamente 1 - 2 g de peso corporal durante EAE. El descenso marca el inicio de la EAE.
    2. Evaluar los síntomas clínicos diariamente desde el día 7 de acuerdoing de los sistemas de puntuación estándar (es decir, Puntuación 0: no hay cambios evidentes en las funciones motoras; puntuación de 0,5: parálisis distal de la cola; puntuación 1: parálisis completa de la cola; puntuación de 1,5: paresia leve de una o ambas patas traseras; puntuación 2: paresia grave de las patas traseras; puntuación de 2,5: parálisis completa de una pata trasera; puntuación 3: parálisis completa de ambas patas traseras; anotar. 3.5: parálisis completa de las patas traseras y la parálisis de una pierna delante eutanasia a los ratones con una puntuación de 3,5 o superior para > 12 h.
  5. Curso y el tiempo de formación de imágenes EAE
    1. Realizar la primera formación de imágenes en el inicio de la enfermedad, cuando los ratones alcanzan las puntuaciones> 1, lo que ocurrirá alrededor días 10 a 12 después de la inmunización.
    2. Realización de la segunda imagen en el pico, que se alcanzará 1 o 2 días después de los síntomas iniciales se desarrollan y tendrá una duración de 1 - 3 días.
      NOTA: Posteriormente, los ratones se recuperará por completo dentro de los 7 a 10 días. Imaging durante los intervalos todavía puede mostrar fugas vasculares,pero los indicadores de inflamación debe ser negativo.

2. bioluminiscente y imágenes de infrarrojo cercano de la neuritis óptica y la inflamación cerebral

  1. Configuración del sistema de imagen
    1. Realizar imágenes in vivo con cualquier equipo que permite el análisis de bioluminiscencia y señales de infrarrojo cercano.
    2. Mantenga ratones bajo 2 - anestesia con isoflurano al 2,5% durante todos los procedimientos de formación de imágenes.
    3. La posición de uno o dos ratones uno junto al otro en el aparato utilizando los suministros de gas medias. Coloque la columna vertebral superior en el centro.
    4. Utilice dos ratones simultáneamente, una por grupo, para la evaluación de los efectos de la medicación para comparar pares. Esto es importante para bioluminiscente de imágenes.
    5. Proteger el sitio de la inmunización con un paño negro y tomar una imagen de la fotografía y la línea de base para evaluar el correcto posicionamiento del ratón / ratones. Utilice los botones B-foco con una distancia de 6,5 cm a la cámara para todas las imágenes.
  2. Inyección y de formación de imágenes de la sonda de la inflamación bioluminiscente
    1. Utilice la configuración del sistema en vivo de imágenes: Epi-BLI, Em filtro abierta, Ex bloque de filtro, fstop 1, se va a agrupar 8, se centran B = 6,5 cm, anuncio de exposición 120 s; tomar una imagen de referencia.
    2. Inyectar 100 ip l del reactivo quimioluminiscente listo para su uso (40 mg / ml). Mezclar bien antes de llenar la jeringa.
    3. Capturar imágenes de bioluminiscencia 5, 10 y 15 min después de la inyección. El curso temporal del pico bioluminiscente se diferencia entre los animales.
      NOTA: El pico se producirá de 5 - 10 min después de la inyección; una disminución en 15 min indica que no se necesitan más imágenes. Utilizar pares de ratones de los grupos control y de tratamiento para eliminar sesgos menores debido a diferentes cursos de tiempo.
    4. Rellene descripciones relevantes para el experimento. Observar un cuadro de diálogo pop-up de forma automática; que incluye información, tal como la cepa de ratón, el sexo, punto de tiempo, momento de la inyección de la sonda, grupo, etc. Guarde los archivos o en todocarpeta ne; tendrán etiquetas de tiempo y todas las descripciones.
  3. Inyección y obtención de imágenes de nanopartículas fluorescentes en el infrarrojo cercano para la acreditación integridad
    1. Utilizar imagen de epifluorescencia infrarrojo cercano en el B-enfoque (distancia: 6,5 cm). Los máximos de excitación / emisión de las nanopartículas fluorescentes pegilados son 675/690 nm. Capturar dos imágenes en diferentes longitudes de onda, en Ex640 / Em700 y Ex675 / Em720; utilizar un 2-s de la exposición, se va a agrupar 8, y fstop 2. Tomar una imagen de línea de base.
    2. Inyectar 70 l de nanopartículas fluorescentes infrarrojos pegilado iv a través de la vena de la cola e imaginar los ratones 3 hy 24 h después de la inyección utilizando la configuración anterior. Mezclar la solución bien antes de llenar la jeringa.
    3. Se inyecta cloruro de sodio al 0,9% en los ratones de control, que serán necesarios para evaluar la especificidad de la señal.
  4. Inyección y obtención de imágenes de la sonda fluorescente del infrarrojo cercano para la actividad de MMP
    1. Afeitarse o depilarse la cabeza yuregión de la columna vertebral pper con cautela un día antes de tomar la imagen de referencia. La piel no debe ser herido.
    2. Utilizar imagen de epifluorescencia infrarrojo cercano en el B-enfoque (distancia: 6,5 cm). Los máximos de excitación / emisión de la sonda activable MMP son 680/700 nm. Capturar dos imágenes en diferentes longitudes de onda, en Ex640 / Em700 y Ex675 / Em720; utilizar un 1-s de la exposición, se va a agrupar 8, y fstop 2. Tomar una imagen de línea de base.
    3. Añadir 200 l de 1x PBS al tubo 1,5 ml de la solución lista para usar (20 nmol / 1,5 ml en 1 x PBS) de manera que será suficiente para 10 ratones; mezclar bien antes de llenar la jeringa.
      NOTA: El volumen suministrado no se tiene en cuenta que un poco de volumen se pierde durante el llenado de la jeringa y la inyección.
    4. Inyectar 150 l de la sonda a través iv la vena de la cola 24 h antes de formación de imágenes. Inyectar PBS sólo en los animales de control para evaluar la especificidad de la señal.
    5. A las 24 h después de la inyección, tomar Epi-FL imágenes por lo menos en dos longitudes de onda, Ex640 / Em700 y Ex 675 / Em720, con la configuración explicada anteriormente (1-s exposición, el enfoque B, se va a agrupar 8, y fstop 2).
      NOTA: El uso de dos longitudes de onda permite la desmezcla espectral restando la señal inespecífica.

3. Los análisis de imagen

  1. Análisis de bioluminiscencia (BLI)
    1. Haga doble clic en el software para abrirlo.
    2. En la barra de menú superior, haga clic en el icono del explorador de archivos, vaya al directorio de la carpeta del experimento, y seleccionarlo; esto abrirá todos los archivos en la carpeta en una tabla.
    3. Configurar las columnas que muestran las descripciones pertinentes al experimento.
    4. Para el control de calidad, haga doble clic en un archivo de un ratón no respondedor sin síntomas de EAE y / o un ratón ingenuo para comprobar la especificidad de las señales de EAE.
      NOTA: No debe haber ninguna señal en los ratones no tratados previamente y mínima de la señal en los ratones que no respondieron.
      1. Compruebe la imagen de la línea de base antes de la inyección de la proser para cada ratón como un control adicional de la especificidad de la señal; que debe ser negativo.
    5. Para seleccionar una imagen, haga doble clic en el primer archivo del primer ratón de EAE y comprobar la intensidad bioluminiscente (LUT gama de barras) y la localización. Compruebe todas las imágenes una por una. Cierre el archivo con la intensidad más baja para cada ratón (es decir, mantener 2 de cada 3 imágenes por cada ratón).
    6. Ajuste de la imagen y la exportación
      1. Haga doble clic en el primer archivo de ser cuantificados. Observar una nueva ventana emergente. En "Opciones" (menú superior), personalizar las etiquetas que se mostrarán en cada imagen.
      2. En la paleta de herramientas a la derecha, vaya a "Ajuste de imagen". Por defecto, las intensidades mínimas y máximas se establecen en "auto" y se muestran en pseudocolor arco iris. Seleccione "manual" para cambiar la configuración si es necesario.
        NOTA: Por ejemplo, todas las imágenes exportadas pueden tener barras idénticas LUT (mínimos y máximos) idénticos que sean fácilmente comparables.El ajuste de los mínimos y máximos no tiene impacto en los resultados cuantitativos.
      3. Haga clic en la exportación de imágenes, seleccione png, el directorio y un nombre de imagen
    7. La cuantificación de regiones de interés (ROI)
      1. Ir a la función "retorno de la inversión" en la paleta de herramientas. Seleccione el método de retorno de la inversión (círculo, rectangular, auto o manos libres) y el número de regiones de interés. Observe la ventana pop-up retorno de la inversión en la ventana de imagen.
      2. Con el ratón, ajustar el tamaño y la posición. Utilizar umbrales de ROI idénticos para todas las imágenes si se utiliza la herramienta de auto-retorno de la inversión. Utilice áreas idénticas para todas las imágenes si los tamaños y posiciones de ROI se definen de forma manual (por ejemplo, los ROI circulares).
      3. Haga clic en "medir RO.I. Observar una nueva ventana emergente. Personalizar las columnas (por ejemplo, nombre de archivo, el número de animales, grupo, experimento, área, los recuentos totales, recuentos promedio, los recuentos SD, mínimo y máximo que cuenta, área, tiempo punto, el tiempo de inyección de sonda, etc.). Guardar los ajustes personalizados. Cuando ready, seleccionar todo (Ctrl + A), y copiar y pegar la tabla en una hoja de cálculo.
      4. Exportar la imagen como un png con las regiones de interés en su lugar. Guarde y cierre el archivo de imagen.
    8. Repetir el procedimiento (pasos 3.1.6 - 3.1.7) para todos los archivos de imágenes que necesitan ser cuantificados. Copiar todas las cuantificaciones de ROI en la hoja de cálculo.
      NOTA: En este caso, los resultados se pueden ordenar por grupo, punto en el tiempo, etc. y se analizaron estadísticamente. Utilice el recuento total de señales de bioluminiscencia en el rendimiento de la inversión para los análisis estadísticos.
  2. El análisis de infrarrojo cercano (NIR) de nanopartículas fluorescentes
    1. Uso de los controles en el software, ajustar el umbral de la imagen.
      NOTA: Esto no tiene ningún impacto en el resultado cuantitativo.
    2. comparar visualmente las imágenes captadas a Ex / Em 675/720 y Ex / Em 640/700 para evaluar la especificidad de la señal.
    3. Utilizar las imágenes captadas a Ex / Em 675/720 para el análisis cuantitativo (máximo de excitación: 680 nm). Definir regiones de interés, para lo cual se puede utilizar la herramienta de auto-retorno de la inversión. Ajuste del umbral de auto-retorno de la inversión y utilizarlo para todas las imágenes. Cuantificar la eficiencia total radiante en regiones de interés (véase el paso 3.1).
  3. El análisis de infrarrojo cercano (NIR) de la sonda sensible a la proteasa
    1. El uso de controles de software, ajustar el umbral de la imagen.
      NOTA: Esto no tiene ningún impacto en el resultado cuantitativo. Realizar desmezcla espectral de la autofluorescencia. La herramienta de desmezcla se implementa en imagen viva. La auto-desmezcla utiliza el Ex / Em 640/700 como el específico y 675/720 como la imagen de auto-fluorescente.
    2. Seleccione la imagen sin mezclar y definir las regiones de interés, como se describió anteriormente. Utilice la eficiencia total radiante en regiones de interés para los análisis cuantitativos y estadísticos.

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Resultados

Lapso de tiempo de bioluminiscencia de la neuritis óptica

La señal de bioluminiscencia de la sonda era el más fuerte inflamación alrededor de los ojos y se produjo exclusivamente en ratones con EAE con neuritis óptica. Una señal se produjo ni en los ratones no EAE ni los ratones no inyectados con la sonda de la inflamación. La señal desapareció cuando los ratones se recuperó. Por lo tanto, la señal es específi...

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Discusión

La presente video muestra técnicas para la bioluminiscencia y fluorescencia en el infrarrojo cercano de imágenes in vivo de la EAE en ratones SJL / J. Se demuestra que la formación de imágenes de bioluminiscencia utilizando una sonda inflamación sensible muestra principalmente neuritis óptica, y la cuantificación de acuerdo con la evaluación clínica de la gravedad de EAE y los efectos de la medicación. Sin embargo, el método de formación de imágenes de bioluminiscencia no fue capaz de detectar la infla...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) y el programa de financiación de la investigación "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) del Estado de Hessen, Centro de Investigación de Medicina Traslacional y Farmacología TMP y el Else Fundación Kröner-Fresenius (EKFS), Grupo de Investigación de Formación de Investigación traslacional Innovación - Pharma (TRIP).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AngioSpark-680Perkin Elmer, Inc., Waltham, EE. UU.NEV10149Sonda de imagen, nanopartículas pegiladas, útil para la obtención de imágenes de la integridad de la barrera hematoencefálica
MMP-sense 680Perkin Elmer, Inc., Waltham, EE. UU.NEV10126Sonda de imagen, activable por metaloproteinasas de matriz, útil para la obtención de imágenes de la inflamación
Sonda de inflamación XenoLight RediJect PerkinElmer, Inc., Waltham, EE. UU.760535Sonda de imagen, activable por oxidasas, útil para la obtención de imágenes de la inflamación
PLP139-151/CFA emulsión Hooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123EAE kit de inducción
Pertussis ToxinHooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123EAE kit de inducción
IVIS Lumina SpectrumPerkin Elmer, Inc., Waltham, EE. UUSistema de bioluminiscencia e imágenes infrarrojas
Software LivingImage 4.5 Perkin Elmer, Inc., Waltham, EE. UU.CLS136334software de análisis IVIS
IsofluranoAbbott Labs, Illinois, EE. UU.26675-46-7Anestésico
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Referencias

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