La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

Resumen

Este protocolo describe la reconstitución de los nucleosomas que contienen histonas hermana marcados con isótopos diferencialmente. Al mismo tiempo, los nucleosomas asimétricamente después de la traducción modificados pueden ser generados después de usar una copia de la histona premodified. Estas preparaciones se pueden utilizar fácilmente para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía, simultáneamente en ambos histonas hermanas, mediante el uso de la espectroscopia de RMN de alta resolución.

Resumen

nucleosomas asimétricamente modificados contienen las dos copias de una histona (histonas hermana) decoradas con distintos conjuntos de modificaciones post-traduccionales (PTMs). Son especies recién identificadas con medios desconocidos de establecimiento y consecuencias funcionales. métodos analíticos actuales son insuficientes para detectar la aparición-copia específica del PTM de las histonas del nucleosoma hermanas. Este protocolo presenta un método bioquímico para la reconstitución in vitro de los nucleosomas que contienen histonas hermanas marcados con isótopos diferencialmente. El complejo generada puede ser también modificado de forma asimétrica, después de que incluye una piscina de histonas premodified durante el replegamiento de Subcomplejos histonas. Estas preparaciones de nucleosomas asimétricos pueden ser fácilmente reaccionar con enzimas modificadoras de histonas para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía impuestas por el PTM asimétricamente pre-constituida mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). En particular, las reacciones de modificación enEn tiempo real se puede asignar de forma independiente en los dos histonas hermanas mediante la realización de diferentes tipos de experimentos de correlación de RMN, adaptados para el tipo de isótopo. Esta metodología proporciona los medios para estudiar los mecanismos de diafonía que contribuyen a la formación y propagación de los patrones de PTM asimétricos en complejos nucleosomal.

Introducción

DNA eucariótico está estrechamente empaquetados dentro de los núcleos celulares en la cromatina. El bloque de construcción fundamental de la cromatina es la partícula de núcleo nucleosoma que contiene ~ 147 pb de ADN envuelto alrededor de un complejo de octameric formado por dos copias de cada uno de los cuatro histonas del núcleo (H3, H4, H2A, H2B). Las proteínas histonas albergan una gran cantidad de modificaciones post-traduccionales (PTMs). Estas sustituciones covalentes inducen alteraciones en la estructura de la cromatina, tanto directamente al afectar a la química física del sistema e indirectamente mediante el reclutamiento de las actividades de remodelación ....

Protocolo

1. Reconstitución de los nucleosomas con marcado con isótopo diferencialmente (y asimétricamente modificado) de la hermana histonas

NOTA: El protocolo actual describe la reconstitución de los nucleosomas con diferencialmente histona H3 marcada con isótopo. Con este fin, se utilizaron dos piscinas de la histona H3; uno era ¹⁵ N-etiquetados y contenía una 6xHis-tag en el extremo N-terminal y el segundo fue ¹³ C-etiquetados y contenía el péptido Strep (WSHPQFEK) fusionada en el extremo N-terminal. Ambas marcas fueron separados de la secuencia nativa H3 con un sitio de reconocimiento de la proteasa del virus del gra....

Resultados

Octameric especies replegadas adecuadamente son aislados después de una carrera de la mezcla de la reconstitución través de una columna de filtración en gel (Figura 2). La piscina reconstituido octameric que contiene los tres tipos diferentes de octámeros se somete al esquema de purificación por afinidad en tándem. Las muestras se recogen a partir de todos los pasos y se analizaron por SDS-PAGE y posteriormente WB. La verificación de la correcta ejecución del protocolo q.......

Discusión

Para la reconstitución de nucleosomas, el protocolo actual utiliza un molde de ADN largo de 165 pb que contenía la secuencia de posicionamiento de nucleosomas 601-Widom ^20, pero un rendimiento similar se espera que el uso de diferentes longitudes de moldes de ADN. El protocolo fue diseñado y emplea el uso de tipos asimétricas de la histona H3. Con el mismo principio, el método se puede aplicar también para los otros histonas del núcleo y, además, puede ser utilizado para reconstituir los complejo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Guanidinio HCl	Applichem	A14199	Utilice Gu-HCl
Tris de	Roth	4855.2
DTT	Applichem	A1101
NaCl	Productos químicos VWR	27810.364
EDTA	Roth	8043.2
Na2H2PO4	Applichem	A1046
NaH2PO4	Applichem	A3902
Imidazol	Applichem	A1073
d-Desthiobiotin	Sigma	D1411
Ni-NTA Superflow	Qiagen 1034557
Strep-Tactin Superflow	IBA	2-1207-001
Anticuerpo His-probe	Santa Cruz	sc-8036
Estreptococo conjugado HRP	IBA	2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28-9893-35
membrana de diálisis de 6 - 8 kDa	Spectrumlabs	spectra/por 1, 132650
membrana de diálisis de 50 kDa	Spectrumlabs	spectra/por 7, 132129
10 kDa unidad de filtro centrígulo	Merck Millipore	UFC901024
30 kDa unidad	Merck Millipore	UFC903024
Espectrómetro de RMN en estado de solución			frecuencia de funcionamiento de al menos 500 MHz, equipado con una criosonda de triple resonancia
Nombre del tampón	componente
despliegue	7 m Guanidinaio HCl
	20 mM Tris, pH 7,5
	10 mM Tampón replegable DTT
	10 mM Tris, pH 7,5
	2 M NaCl
	1 mM EDTA
	2 mM TDT
Tampón de ensayo	25 mM Na2H2PO4, pH 6,8
	25 mM NaCl
	2 mM TDT

alta calidad;