Determinación de la potencia relativa de un Anti-TNF Anticuerpo Monoclonal (mAb) por neutralizante utilizando un método de bioanalítica In Vitro TNF

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la determinación de la actividad anti-apoptótica relativa de un mAb anti-TNFα mediante un mecanismo de neutralización con células WEHI 164. Este protocolo es útil para comparar la fuerza de la neutralización de diferentes moléculas con la misma funcionalidad biológica.

Resumen

Este protocolo indica la medida de la neutralización de actividad apoptótica de TNFα en un modelo de celular de la fibroblastos de ratón (WEHI 164) con un mAb anti-TNFα. Además, este protocolo puede utilizarse para evaluar otras moléculas anti-TNFα, tales como proteínas de fusión. El modelo de celular utilizado aquí es sensible a la apoptosis mediada por el TNFα cuando es inducida por un factor de estrés adicional en las condiciones de cultivo celular (p. ej., privación de suero). Este procedimiento es un ejemplo de cómo ejecutar este ensayo analítico, destacando las operaciones claves relativas a la preparación de la muestra, dilución celular, inducción de apoptosis y medidas espectrofotométricas que son críticas para garantizar resultados exitosos. Este protocolo revela las condiciones de mejor rendimiento relacionados con la inducción de apoptosis y eficiente de señal de grabación, llevando a valores bajo incertidumbre.

Introducción

Potencia biológica es la medida cuantitativa de la actividad biológica basada en los atributos del producto ensayado que están vinculados a las propiedades biológicas pertinentes, considerando que la cantidad (expresada en masa) es una medida fisicoquímica del contenido de proteínas. Pruebas de potencia, junto con otras metodologías analíticas, se realizan como parte de estudios de comparabilidad, la estabilidad y la conformidad del producto. En este sentido, las mediciones de potencia se utilizan para demostrar que los lotes de producto cumplen los atributos de calidad críticos (CQAs) o criterios de aceptación durante todas las fases de ensayos clínicos y después de ....

Protocolo

1. preparación de las soluciones y los medios de comunicación

1. preparar el medio de cultivo: RPMI-1640 con 10% FBS, pH 7.4.
2. Preparar medio de cultivo de ensayo: RPMI-1640 sin rojo de fenol con 1% FBS, pH 7.4.
3. Preparar la solución de lavado celular: solución de DPBS libre de Ca y Mg con EDTA 0.02%, pH 7,4.
4. Preparar la solución de separación celular: tripsina 0,125% con EDTA 1 mM.
   1. Descongelar 100 mL de una solución al 0,25% de tripsina-EDTA y transferir a un matraz de 500 mL estéril.
   2. Mezcla con 100 mL de célula solución de lavado y dispe....

Resultados

Gráfico de la respuesta a la dosis (con controles)
La figura 1 representa la respuesta de luminiscencia frente a concentración de mAb. Esta función sigmoidal es un ejemplo de liberación de la caspasa 3 y 7 en el medio de cultivo de ensayo debido a la lisis celular. Muerte celular es realzada por inanición de suero además de TNFα inducción de señalización. Por lo tanto, la molécula anti-TNFα (mAb) interactúa con la citocina, inhibición (po.......

Discusión

Esta caracterización ayuda a determinar a priori el comportamiento biológico de una molécula en desarrollo antes de que se llevan a cabo ensayos clínicos costosos y desperdiciadores de tiempo. También es útil para la liberación de lote a lote de un producto de droga aprobado. Cabe destacar que estos análisis son útiles para determinar si una molécula tiene un efecto biológico adecuado en cuanto a su mecanismo de acción. El método bio-analítico presentado en este tutorial es muy importante que la comparación de m.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Células de fibrosarcoma de Mus musculus
RPMI-1640 Medio	ATCC	30-2001	Almacene el medio a 2 & grados; C a 8 ° C
RPMI 1640 Medio, sin rojo fenol	GIBCO	11835-030	Almacene el medio a 2 & grados; C a 8 ° C
Tripsina-EDTA (0.25%),rojo fenol	GIBCO	25200-056	Almacene el medio a -10 & grados; C a -20 ° C
DPBS, sin calcio, sin magnesio	GIBCO	14190-136	Almacene el medio a 2 & grados; C a 8 ° C
Proteína TNF-alfa humana recombinante	R& D Systems	210-TA-020	Tienda a -20 ° C a -70 ° C
Suero fetal bovino (EE. UU.), IgG súper baja	HyClone	SH3089803	almacenar a -10 & grados; C a -20 ° C
Suero fetal bovino (EE. UU.), caracterizado	HyClone	SH3007103	almacene a -10 ° C a -20 ° C
Caspasa-Glo 3/7 Kit de ensayo	Promega	G8093	Almacene el sustrato Caspasa-Glo. 3/7 y el tampón Caspasa-Glo. 3/7 en – 20 º C protegido deEDTA ligero
, sal disódica, dihidrato, cristal, reactivo A.C.S.	J.T.Baker	8993-01	--
Muestra mAb Adalimumab	Probiomed	NA	Las concentraciones finales en la microplaca son:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 y 0.004 μ g/mL
Referencia y control mAb Adalimumab	Abbvie	NA	concentraciones finales en la microplaca son:  0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 y 0,004 μ g/mL
Lector de microplacas	Molecular Devices	89429-536	SpectraMax M3 Lector de
microplacas multimodo Software	Dispositivos moleculares	:	SoftMax Pro 6.3 GxP
	Revco	30482	de CO2 para aire forzado
	La Compañía Baker	200256	Panadero SG603A-HE | Alta eficiencia, Clase II Tipo A2

Las incubadora Revco RNW3000TABB Campana de flujo laminar