Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحديد "قوتها النسبية" من مكافحة-تنف [مونوكلونل] جسم (ماب) قبل Neutralizing تنف استخدام أسلوب بيواناليتيكال في المختبر

Published: September 16, 2017 doi: 10.3791/55376
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2
1Research and Development, Probiomed, 2Bioprocess Research and Development Unit, Instituto Politecnico Nacional

Summary

بروتوكول لتحديد نشاط apoptotic مكافحة النسبي ماب TNFα مكافحة استخدام إليه إبطال مع خلايا WEHI 164 يرد هنا. هذا البروتوكول مفيدة لمقارنة قوة الأبطال من جزيئات مختلفة مع نفس الوظيفة البيولوجية.

Abstract

هذا البروتوكول يظهر قياس تحييد نشاط apoptotic TNFα في نموذج خلية تنتجها الخلايا الليفية ماوس (WEHI 164) ماب TNFα المناهضة استخدام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم الجزيئات المضادة-TNFα الأخرى، مثل البروتينات الانصهار. نموذج الخلوية المستخدمة هنا حساس للمبرمج بوساطة TNFα عندما فعل عامل ضغط إضافي في خلية ثقافة الظروف (مثل مصل الحرمان). ويمثل هذا الإجراء كيفية تنفيذ هذا الفحص التحليلي، تسليط الضوء على العمليات الرئيسية المتصلة بإعداد عينة وتمييع الخلية، المبرمج التعريفي، والقياسات سبيكتروفوتوميتريك ذات الأهمية الحاسمة لضمان تحقيق نتائج ناجحة. ويكشف هذا البروتوكول، أداء أفضل الشروط المتعلقة بتحريض المبرمج وكفاءة إشارة تسجيل، مما يؤدي إلى عدم اليقين انخفاض قيم.

Introduction

الفاعلية البيولوجية هو مقياس كمي للنشاط البيولوجي استناداً إلى سمات المنتج جزيئي مرتبطة بالخصائص البيولوجية ذات الصلة، بينما الكمية (معبراً عنها بالكتلة) مقياس الفيزيائية لمحتوى البروتين. يتم إجراء الاختبارات فاعلية، جنبا إلى جنب مع منهجيات تحليلية أخرى، كجزء من المنتج المطابقة، والاستقرار، والدراسات المقارنة. وبهذا المعني، تستخدم القياسات فاعلية لإثبات استيفاء دفعات المنتج السمات النوعية الحرجة (كقاس) أو معايير القبول خلال جميع مراحل من التجارب السريرية، وبعد الحصول على موافقة السوق.

المبرمج موت الخلايا المبرمج، وتحدث بشكل طبيعي عندما الخلايا مصابة بفيروس، أو عندما يتم أكد الخلايا البيئية عاملاً أن التنازلات الخلوية البقاء والدالة1،2. بين أمور أخرى، تثبيط المبرمج، أو تحييد البيولوجية، إحدى الآليات العلاجية المعروفة أساسا من مابس، لا سيما في علاج الأمراض المزمنة مثل أمراض التهاب المناعي بوساطة. تمارس الجزيئات المضادة-TNFα خصائصها العلاجية بحجب تفاعل عامل نخر الورم ألفا (TNFα) مع p55 و p75 خلية المستقبلات السطحية3، وبالتالي منع مسارات إشارة تؤدي أخيرا إلى المبرمج الخلوي.

يمكن أن تنتج TNFα التهاب في بعض الأمراض المزمنة4. ويفرز TNFα أيامهم في الوسط خارج الخلية بواسطة الضامة، التي هي الحراس من نظام المناعة الفطرية، والجهات الفاعلة الرئيسية في هذا النوع من المرض5. كمسار مشترك، TNFα رفع القيود المقترنة مع الآلية المرضية لهذه الأمراض. دون مراقبة وفي إطار الحث المستمر والإجهاد الخلية، يستحث TNFα خلية انحطاط الموت والأنسجة، يؤدي في النهاية إلى التهاب المفاصل، وداء كرون، و الملامح المرضية الأخرى6.

قد استخدمت تنف الخصوم التي تمنع التفاعل بين تنف ولها مستقبلات متزايدة كعلاج فعال للحد من الأعراض وتعيق تطور هذه الأمراض. في الوقت الحاضر، TNFα مكافحة المخدرات المنتجات تستخدم على نطاق واسع التحكم بتركيز الجهازية سيتوكين هذا، وبالتالي منع المزيد من تدهور الأنسجة المعنية. وبهذا المعني، يتحتم توفير الحشري استنساخه وقوية لوصف قدرة محددة من المخدرات لتحقيق التأثير البيولوجي.

في هذا البروتوكول، الحرجة خطوات تم تحديدها من خلال تطوير مقايسة الأبطال-لقياس الفاعلية البيولوجية الناجحة هي أبرز، مع تركيز بشكل خاص على المهارات اللازمة لتنفيذ الأسلوب الحيوي التحليلية. يوفر هذا الأسلوب الحيوي التحليلية معلومات مفيدة القابلية للمقارنة بين دفعات مختلفة أو مكافحة-TNFα المنتجات الدوائية بالمقارنة مع مادة مرجعية تم اختبارها سريرياً.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام والحلول

  1. إعداد متوسطة الثقافة: 1640 RPMI مع 10% FBS، درجة الحموضة 7.4.
  2. تحضير المقايسة الثقافة المتوسطة: 1640 RPMI دون الأحمر الفينول ولكن مع 1% FBS، درجة الحموضة 7.4.
  3. إعداد خلية يغسل الحل: الحل ملغ وخالية من كاليفورنيا دببس مع 0.02% يدتا، درجة الحموضة 7.4.
  4. تعد الخلية المفرزة الحل: التربسين 0.125 في المائة مع 1 مم يدتا.
    1. ذوبان الجليد 100 مل حل 0.25% يدتا التربسين ونقل إلى قارورة 500 مل معقمة.
    2. ميكس مع 100 مل خلية يغسل الحل والاستغناء عن مختبرين 15 مل في أنابيب معقمة 15 مل. مخزن في-70 إلى-80 درجة مئوية حتى استخدام.
    3. تصفية هذه الحلول من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر والحارة يصل إلى 37 درجة مئوية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل استخدامها.
  5. إعداد المبرمج-التعريفي الأسهم الحل TNFα في 3.3 ميكروغرام/ملليلتر-
    1. حل 20 ميكروغرام من TNFα مع 500 ميليلتر لتصفية تعقيم المياه في الحاويات الأولية والمزيج حتى حل كامل-
      2. نقل في أنبوب عقيم 15 مل
    2. وإضافة 5.5 مل دببس مغ وخالية من كاليفورنيا إلى حل لهذا الأنبوب. المزيج بلطف باستخدام خلاط دوامة.
    3. قاسمة الحل إلى 70 ميليلتر أجزاء. الاستغناء عن كل قاسمة إلى 0.5 مل microtubes ومخزن في-80 درجة مئوية.
  6. إعداد المبرمج حل التعريفي: حل TNFα في 40 نانوغرام/مليلتر.
    1. ذوبان الجليد قاسمة الحل الأسهم التعريفي المبرمج، تفرخ في حمام مائي في ˚C 25 للحد الأدنى 10
    2. إضعاف التعريفي المبرمج حل الأسهم 40 نانوغرام/مل بإضافة ميليلتر 61 3.3 ميكروغرام/مل TNFα حل لمل 4.939 للمقايسة الثقافة المتوسطة في أنبوب عقيم 15 مل.
    3. مزيج من دوامة خلاط 10 s؛ وهذا الحل يجب أن يكون مستعدا طازجة قبل الاستخدام.
    4. الاحماء الحل إلى 37 درجة مئوية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل استخدامها في التحليل انيوتراليزيشن ال-
  7. إعداد الحل الركيزة: caspase 3/7 Glo الحل 7 ، 8-
    1. ذوبان الجليد الحل المخزن المؤقت كاسباسي (المخزن المؤقت Glo كاسباسي 3/7) ح 12 قبل الاستخدام.
    2. تمكنك من حل المخزن المؤقت كاسباسي والركيزة (الركيزة Glo كاسباسي 3/7) الجلوس بشكل منفصل في 25 ± 5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاختلاط.
    3. نقل 10 مل الحل المخزن المؤقت caspase قنينة الركيزة ومزيج من انعكاس.
    4. تبقى في 25 ± 5 درجات مئوية، محمية بالضوء حتى استخدام.
      ملاحظة: الحل مستقر ح 6 في درجة حرارة الغرفة-

2. خلية كولتورينج والعد

  1. ذوبان الخلية وثقافة فرعية الأولى.
    1. إزالة قنينة واحدة مع WEHI 164 الخلايا 9 من ثلاجة في-80 ˚C ونقلها إلى حمام الثلج.
    2. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مع 1 مل من قبل حرارة ثقافة متوسطة حتى ذوبان الجليد تماما الخلايا المجمدة.
    3. الاستغناء عن 9 مل من قبل حرارة متوسطة الثقافة على أنبوب عقيم 15 مل.
    4. نقل تعليق خلية في أنبوب عقيم 15 مل وتخلط بلطف من خمس مرات بانعكاس.
    5. الطرد المركزي من تعليق خلية في 125 x ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وتصنيف بيليه الخلية.
      6. إضافة
    6. 5 مل من الثقافة المتوسطة للأنبوب. مزيج حتى يتم تماما حراكه الخلايا.
    7. لعد الخلايا، نقل 50 ميليلتر من تعليق خلية إلى 500 ميليلتر microtube وخلط مع 50 ميليلتر من 0.4% تريبان الأزرق. عد الخلايا وضبط إلى 0.5 × 10 6 خلايا/مل. راجع الخطوة 2-2، أدناه-
    8. إضافة 13 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة إلى قارورة ثقافة الخليوي 75 مل.
    9. الاستغناء عن حجم تعليق الخلية ما يكفي من الخطوة 2.1.6 لتحقيق 0.5 × 10 6 خلايا/مل في قارورة ثقافة الخليوي واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 بين عشية وضحاها.
  2. خلية العد.
    ملاحظة: انظر المرجع 10.
    1. باستخدام الحل من الخطوة 2.1.6، نقل 0.05 مل هيموسيتوميتير وتحديد كثافة الخلية تحت مجهر استخدام الاستبعاد تريبان الأزرق-
    2. تقدير العدد الكلي للخلايا وخلايا قابلة للحياة-
    3. ضبط تعليق خلية إلى 0.5 × 10 6 خلايا/مل.
      معادلة 1
      V الثقافة المتوسطة (mL) = Equation 1
      V الثقافة المتوسطة (mL) = (5 مل-V تعليق خلية)
      V الثقافة المتوسطة (mL) = حجم المعدل WEHI 164 خلية تعليق
      NVC = عدد مجدية WEHI 164 خلايا/مل
      الخامس الثقافة المتوسطة (mL) = المقايسة الثقافة المتوسطة الحجم إضافة إلى تعليق خلية لتحقيق 0.5 × 10 6 خلايا/مل
      0.5 × 10 6 = كثافة الخلية المستهدفة
  3. الخلية المفرزة وفرعية الثاني والثالث.
    ملاحظة: يمكن استخدام نظام الشفط لإزالة الحلول من قوارير. ويمكن استخدام الماصات معقمة تستعمل لمرة واحدة أو الزجاج. إذا كان يحتوي الماصة تسد القطن أعلى، يجب إزالته قبل الاستخدام.
    1. إزالة المتوسطة الثقافة من زراعة الخلايا T-قارورة استخدام 1 مل ماصة معقمة وفراغ.
      2. الحل
    2. مل 5 الاستغناء عن الغسيل الخلية في الثقافة تي-قارورة، تخلط بلطف، وتجاهل الحل. كرر هذه الخطوة مرتين-
      ملاحظة: الإزالة الكاملة للمتوسط الثقافة حاسمة بالنسبة لكفاءة الخلية المفرزة.
    3. إضافة 15 مل من محلول مفرزة خلية T-قارورة واسمحوا الوقوف لمدة 3 دقائق في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
    4. التحقق من عدم وجود خلايا المرفقة في قارورة الجدار الداخلي تحت المجهر. إزالة الخلايا من ثقافة تي-قارورة استخدام ماصة معقمة من 20 مل والاستغناء عن لهم في أنبوب 50 مل معقمة.
    5. الطرد المركزي من تعليق خلية في 125 x ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع آخر 5 مل من مستنبت.
    6. عد الخلايا، وإضافة المتوسطة الثقافة ما يكفي للوصول إلى تركيز الخلايا المطلوب وفقا المعادلة 1-
    7. إضافة هذا التعليق إلى 72 سم 2 ر-قارورة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
    8. ثقافة فرعية الخلايا مرتين على الأقل قبل استخدامها في التحييد الاعتداء. كرر الخطوات 2.3.1-2.3.8 لليومين المقبلين-
  4. الاعتداء تعليق خلية. ثقافة فرعية
    1. حدد 164 WEHI يحتوي على مسارات ثلاثة على الأقل. راجع الخطوة 2، 1-
    2. فصل وحساب الخلايا وفقا للخطوات 2-2 و 2-3 من هذا البروتوكول.
    3. تمييع تعليق خلية وفقا المعادلة 1 إلى 0.5 × 10 6 خلايا/مل.
    4. استخدام هذا التعليق الخلوية للمقايسة الأبطال. خلط كل تعليق خلية دوامة خلاط قبل استخدام.

3. إعداد الأجسام المضادة وتخفيف

  1. كوانتيتيشن مابس-
    1. تحديد تركيز المواد المرجعية ونموذج عنصر تحكم نموذج تحليلي من خلال امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر باستخدام معامل (1.39) انقراض جماعي على 11-
      ملاحظة: يمكن أن تؤخذ تركيزات الأصلي من المخدرات المنتج التسميات. ومع ذلك، يجب التحقق من ذلك بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية-
  2. تخفيف ماب-
    1. ديلوت جميع العينات بشكل مستقل في ثلاث نسخ، مع حل مغ وخالية من كاليفورنيا دببس في microtubes 2 مل، وصولاً إلى 2 ملغ/مل. تأكيد هذا التركز بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في ثلاث نسخ، باستخدام حل خالية من كاليفورنيا وملغ دببس الفارغة.
    2. ميكس الحلول البروتين المخزون 5 s باستخدام خلاط دوامة.
    3. ميليلتر 100 تمييع كل حل ماب 2 مغ/مل مع 0.9 مل المتوسط الثقافة المقايسة.
      4. S
    4. المزيج ل 5 من دوامة خلاط.
      ملاحظة: هذه الحلول لها بتركيز 200 ميكروغرام/مل. ويجب أن يتم تخفيف لكل ثلاث نسخ.
    5. تمييع 10 آند #181؛ L لكل حل ماب 200 ميكروغرام/مل مع مل 0.99 المتوسط الثقافة المقايسة. مزيج 5 s باستخدام خلاط دوامة. هذه الحلول لها بتركيز 2 ميكروغرام/مل. إجراء تخفيف المسلسل لكل ثلاث نسخ قبل استخدامها في التحليل تحييد.
      6. جعل
    6. المضادة-TNFα تخفيف ماب في ثلاثة ميكروبلاتيس المستقلة. جعل نسخة مكررة من كل ثلاث نسخ مستقلة والاستغناء عن لهم في صفيحة واحدة، كما هو مبين في الجدول 1. مرجع مضمون < الجدول fo:keep-together.within-الصفحة = fo:keep "1"-مع-next.within-صفحة = "دائماً" fo:text-محاذاة = "توسيط" > 1 لوحة لوحة 2 لوحة 3 الآبار عينة الآبار عينة الآبار عينة B2:B11 مادة مرجعية B2:B11 B2:B11 نموذج عنصر تحكم نموذج تحليلي C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 نموذج تحليلي D2:D11 مادة مرجعية D2:D11 نموذج عنصر تحكم E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 نموذج عنصر تحكم F2:F11 عينة تحليلية F2:F11 مادة مرجعية G2:G11 G2:G11 G2:G11 1 الجدول: صفائف عينة ميكروسكوبية. يجب تشغيل مقايسة تحييد كاملة في ميكروبلاتيس الثلاثة ضمن إحداثيات B2 إلى G11. عشوائي الاستغناء عن الإشارة، تحليلية، وعينات مراقبة السماح للباحثين للتحقق من أي تحيز في المقايسة.
    7. إجراء تخفيف ماب كل مرجع، عينة، أو التحكم، كما هو مبين في الجدول 2-
      ملاحظة: لا يتم تركيزات ماب TNFα المضادة الموضحة في هذا الجدول التركيزات النهائية في مقايسة الأبطال. < td > 250
      عمود لوحة "حجم المقايسة" الثقافة المتوسطة (ميكروليتر) حجم مادة مرجعية، ونموذج تحليلي أو عنصر تحكم عينة (uL) تركيز في "لوحة الفحص" (نانوغرام/مل)
      2 0 230 2000
      3 150 150 من السطر 2 1000
      4 75 75 من سطر 3 500
      5 100 50 من سطر 3 333
      6 75 75 من سطر 4
      7 75 75 من سطر 5 166
      8 75 75 من خط 6 125
      9 75 75 جيئة وذهابا خط م 7 83
      10 75 75 من الخط 9 41
      11 150 75 من خط 10 13
      تي 2 قادرة على: تخفيف ماب المضادة-TNFα. تخفيف المسلسل لمكافحة--TNFα مابس وأظهرت في هذا الجدول. تركيزات النهائية المبينة في هذا الجدول لا التركيزات في التحليل، حيث كانت مخففة المضادة-TNFα مابس بمعامل 3 (تمييع ماب + المتوسطة الثقافة تعليق الخلايا). تمثل الخطوط بخط غامق تخفيف قادمة من البنود 3، 5، 7، 9 و 10؛ تمثل الخطوط غير الغامق التخفيف من البنود 3 و 4 و 6. وتتم هذه تخفيف المسلسل فقط قبل إجراء الفحص تحييد. ويجب الحرص على مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً ثلاث مرات قبل صرفها تخفيف.
    8. الحفاظ اللوحات في 25 ± 5 درجات مئوية حتى استخدام.

4. تحييد الإنزيم مع خلايا 164 WEHI

  1. مزيج من فورتيكسينج كل خلية المعلقات (0.5 × 10 6 خلايا/مل) قبل صرفها في أي خطوة من هذا البروتوكول.
    ملاحظة: في هذا القسم، الحارة كل حل إلى 37 درجة مئوية و 30 دقيقة قبل استخدام.
  2. نقل 50 ميليلتر من تعليق خلية لكل من الآبار 60 من ميكروبلاتيس، الانتقال من العمود 2 إلى 11 وخط ب غ.
    3. تخفيف
  3. نقل 50 ميليلتر ماب وعينه، والتحكم في ميكروبلاتيس. وتتبع النمط هو مبين في الشكل 1.
  4. إضافة 50 ميليلتر من الحل التعريفي المبرمج لكل بئر.
  5. ضوابط استخدام الهاتف الخلوي من 50 ميليلتر من WEHI 164 الخلايا، في ثلاثة آبار. إحضار كل بئر لوحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر مع المقايسة الثقافة المتوسطة.
  6. استخدام عنصر تحكم سيتوتوكسيسيتي من خليط من 50 ميليلتر من الخلايا WEHI 164 زائد 50 ميليلتر من المبرمج التعريفي الحل. إحضار كل بئر لوحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر مع المقايسة الثقافة المتوسطة.
  7. السيطرة على TNFα، استخدم 50 ميليلتر من الحل التعريفي المبرمج واحضاره إلى 150 ميليلتر مع المتوسط الثقافة المقايسة.
  8. للفراغ، استخدم 150 ميليلتر المتوسط الثقافة المقايسة وحدها.
  9. ملء الآبار المتبقية مع 150 ميليلتر من مستنبت لتجنب آثار تبخر لوحة.
    10. 4.1.1-4.1.9
  10. تكرار الخطوات مرتين في اثنين آخرين ميكروبلاتيس.
    ملاحظة: ماب وتركيزات نهائية في الميكروسكوبية هي: 0.666، 0.333، 0.167، 0.111، 0.083، 0.056، 0.042، 0.028، 0,014، و 0.004 ميكروغرام/ملليلتر-
  11. تحميل العينات في ميكروبلاتيس، كما هو مبين في الشكل 1.
    Figure 1
    رقم 1: التخلص عينات في لوحات المقايسة. B1 إلى G11 إحداثيات جيدا في ميكروبلاتيس وتصف المواقف التي يوضع فيها تخفيف العينة. إحداثيات المفقودين آبار مليئة بالضوابط والمقايسة الثقافة المتوسطة (A1-A12 و H1-H12). ويساعد هذا التوزيع العشوائي من عينات (تخفيف الأمامية والعكسية في ميكروبلاتيس) للقضاء على التحيز في النتائج بسبب التبخر متوسطة أو متغيرات أخرى. فمن الأفضل أن كل الميكروسكوبية يقوم به محلل واحد في وقت واحد. R: مرجع, s: عينة، CS: عنصر تحكم نموذج، ديل: التخفيف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
  12. احتضان ثلاث لوحات في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 ل 16 ± 2 حاء
  13. اسمحوا الوقوف عند 25 ± 5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل استخدام الكاشف Glo كاسباسي 3/7-
  14. إضافة 100 ميليلتر من هذا الكاشف لجميع الآبار، بما في ذلك النماذج وعناصر التحكم.
  15. يهز لوحات استخدام خلاط دوامة ميكروسكوبية لمدة 3 دقائق في 25 ± 5 درجات مئوية مباشرة بعد الاستغناء عن إلى الآبار.
  16. احتضان اللوحات ل 2.5 ± 0.5 ح في 25 ± 5 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
  17. إدراج هيئة التصنيع العسكريروبلاتيس إلى لومينوميتير وإكمال المقطع التالي-

5. تحليل نتائج

  1. باستخدام برمجيات للكشف عن التﻷلؤ، حدد الدالة الوضع ونقطة النهاية التﻷلؤ.
  2. تحديد واضح 96-جيدا-قاع اللوحة وآبارها الداخلية 80، باستثناء الأعمدة 1 و 12-
  3. حدد وقت تكامل 1,250 مرض التصلب العصبي المتعدد و 10 ق لخلط الميكروسكوبية قبل القراءة.
  4. تحديد الآبار حيث سيتم وضع المواد المرجعية والمضمون التحليلي ونموذج عنصر تحكم وتحديد تركزاتها المقابلة.
  5. قراءة العينات التي توضع في ميكروبلاتيس لومينوميتير-
  6. استخدام معادلة معلمة الرابع بإجراء تحليلات للنتائج. رسم منحنى استجابة لجرعة، كما هو مبين في الشكل 2-
    Figure 2
    رقم 2: منحنى الاستجابة للجرعة. ويرد المضادة-TNFα ماب تركيز مقابل التﻷلؤ (بقاء الخلية). واستخدمت كنموذج معادلة معلمة الرابع بوصف حماية مكافحة-TNFα مابس. EC50 هو تركيز الإنسان والمحيط الحيوي الذي يمكن تحييد مبلغ TNFα التي تتسبب في موت الخلايا 50% في كل فحص، يتمثل ذلك في الرسم البياني كالتغيير في المنحدر. أشرطة وصف الانحراف المعياري التﻷلؤ لكل تركيز الإنسان والمحيط الحيوي. x يمثل تركيز Ab المضادة-TNFα وهو يصور على أنه دالة لوغاريتمية في نانوغرام/ملليلتر، بينما تمثل y الاستجابة التﻷلؤ في وحدات التعسفي التﻷلؤ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
    ملاحظة: في معادلة المعلمة الرابع، ج هو التركيز الفعال 50 (EC50). سيتم استخدام هذه القيمة مقارنة مادة مرجعية، ونموذج تحليلي، ونموذج عنصر تحكم عن طريق الدالة المستجيب.
  7. لحساب مقايسات النسبي، إصلاح مضمون الإشارة إلى 100% وحساب مقايسات العينة والسيطرة عليه.
    ملاحظة: هذه القيم ويرد في الشكل 3-
    Figure 3
    رقم 3: المعادلات الرياضية المستخدمة لحساب في EC50s وقيمها. EC50 القيم، أو معلمات ج، بعدم اليقين ما وصفت الخطأ القياسي. كما هو مبين من EC50s مقارنة بين نتائج العينة ومرجع لقوتها النسبية. يتم حساب فاصل الثقة مع α = 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الرسم البياني في الاستجابة للجرعة (مع عناصر التحكم)
يمثل الشكل 1 الاستجابة التﻷلؤ مقابل تركيز الإنسان والمحيط الحيوي. تجسد هذه الدالة سيجمويدال caspase 3 و 7 الإفراج عنه في مستنبت المقايسة بسبب تحلل الخلية. موت الخلية تتعزز بالمجاعة المصل بالإضافة إلى TNFα إشارات تعريفية. ولذلك، يتفاعل جزيء المضادة-TNFα (ماب) مع سيتوكين، يحول دون تفاعلها مع مستقبلات الخلية تنف (عن طريق إعاقة الفراغية). وهذا يسبب بقاء الخلية في تركيزات أعلى ماب.

كانت عناصر التحكم المستخدمة في الأسلوب: الخلايا مع المقايسة الثقافة المتوسطة، والخلايا بالإضافة إلى المتوسطة الثقافة TNFα بالإضافة إلى المقايسة، والاعتداء ميديومالوني الثقافة. لم تطرأ الخلايا وحدها مع المقايسة الثقافة المتوسطة تحت المجاعة FBS للمبرمج، وبالتالي تطوير التﻷلؤ. وعلاوة على ذلك، الخلايا المعرضة ل TNFα وحدها لكن المزروعة مع المتوسط الثقافة حقاً البقاء على قيد الحياة.

عنصر تحكم آخر هام هو الوسيلة الثقافة المقايسة وحدها. وهذا يتحكم في يساعد مع فهم الجزيئية التدخل المتعلقة بالمتوسط، على وجه التحديد البروتينات التي يمكن هضم الركيزة caspase، مما يشير إلى إشارة إيجابية كاذبة الإنارة. ويرد في الجدول 3EC50 ونتائج الفاعلية النسبية.

عينة EC50 الفاعلية النسبية (%) فاصل الثقة (%) RDS (%)
مادة مرجعية 241.5 100 -- --
243.6
234.2
نماذج تحليلية 225.2 99.7 86.0 115.1 8.5
240.3
258.8
نموذج عنصر تحكم 230.5 97.1 86.5 108.7 6.9
264
248.4

الجدول 3: نتائج الفاعلية النسبية. تتم مقارنة العينة التحليلية عينة فاعلية معروفة، المبينة في الجدول كالمرجع، مع قوتها 100% ثابت. ويحسب بعلاقة مع EC50 لكل عينة. وتحسب الفترة ثقة 95% (α = 0.05). تحديد وضع اللاجئ: الانحراف المعياري النسبي.

ويبين الجدول 3 قوتها النسبية، كنسبة مئوية، بين ماب مرجع وعينه قيد التحقيق. ويفترض إمكانية المقارنة ضمن مجموعة من 80-120% الإشارة. ومع ذلك، في بعض الأحيان الإشارة قد تباين كبير بين دفعات؛ ولذلك، يمكن تغيير نطاق القبول. ومن ثم، فإنه هو المطلوب لتحديد مرجع دفعات خلال فترة قصيرة من التصنيع، تشديد الفاصل الزمني الفيزيائية خصائص والقبول.

يبين هذا الجدول أن الإشارة لديه فاعلية 100%، بينما العينة التحليلية فاعلية 99.7 في المائة. هذه النتيجة تعني أن القدرة على تحييد TNFα بالعينة مماثلة لتلك الإشارة. ومن المتوقع أن يمكن التحكم في الأمراض المرتبطة ب overexpression من سيتوكين بهذه مابس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهذا الوصف تساعد على تحديد بداهة السلوك البيولوجي لجزيء تحت التطوير قبل أن تجري التجارب السريرية مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. كما أنها مفيدة للإفراج عن دفعة لدفعة لمنتج المخدرات الموافق عليها. تجدر الإشارة إلى أن هذه الاختبارات مفيدة لتحديد ما إذا كان جزيء له تأثير بيولوجية ملائمة بشأن إليه العمل. الأسلوب الحيوي التحليلية المقدمة في هذا البرنامج التعليمي من الأهمية بمكان للمقارنة بين الجزيئات المضادة-TNFα مختلفة. على الرغم من الأسلوب الفيزيائية المشتركة، هذه المنهجية قادرة على أن تحدد، من خلال الوسائل البيولوجية، وفاعلية ونجاعة دواء كسمة نوعية، مما يدل على أهمية وظائف المستجيب والتام.

عادة، يمكن أن تكون الخلية المبرمج التجاوب TNFα مهمة صعبة للباحثين لإجراء. ويمكن إجراء استكشاف الأخطاء وإصلاحها عن طريق وصف البنك الخلية المستخدمة يوميا قبل توحيد هذه الطريقة البيولوجية. مثال واحد هو تباين استجابة الخلية ضمن فترة زمنية تتعلق بالشيخوخة خط الخلية12. هو القضاء على هذه المشكلة باستخدام أحد البنوك رئيسية خلية مجمدة في-80 درجة مئوية. خلية عمل البنك الدولي يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لتغطية متطلبات دراسة الكيان التشغيلي المعين يؤديها R & د أو لفترة سنة واحدة لاستخدامها في مختبر مراقبة الجودة. أيضا، يمكن أن تكون ثابتة هذه الاستجابة باستخدام حلول استقرت درجة حرارة قبل إضافتها إلى الخلايا في أي خطوة خلال هذا البروتوكول. يجب أن يتم على الأقل ثلاث مرات مرور قبل تشغيل مقايسة إبطال وتقييد طول الفترة الزمنية التي تزرع الخلايا في الثقافة المستمر بسبب التكيف والسكان ديناميات12،13.

ويجب حماية جزيء TNFα من دورات تجميد أذاب، كما أن فاعلية هذا البروتين كبيرة تقوض إذا لم تستقر. الصياغات المذكورة في أماكن أخرى14 لإعداد سيتوكين اقترح عندما سيتم تخزين سيتوكين المعاد تشكيلها، كما تركز TNFα أمر بالغ الأهمية لنجاح البروتوكول. استجابة خلية إلى سيتوكين يعتمد على عدد مستقبلات كل خلية. ولذلك، يعتمد تركيز TNFα الأمثل على الخلية خط وكثافة15،16. نحن المخفف TNFα إلى نهائي تركز 13.3 نانوغرام/مليلتر وضبط كثافة الخلية استخدام منحنى حول الخلايا 25,000/جيدا. ولذلك، يجب التحقق من كثافة الخلية لكل تركيز TNFα.

فيليجاس كاماتشو et al. تقارير بتركيز نهائي TNFα 1.25 نانوغرام/مل؛ كما يستخدم هذا الفريق والاكيتنوميسين د إجهاد خلية عامل9،،من1718. بدلاً من ذلك غيرنا FBS من 10% إلى 1% من الثقافة المتوسطة إلى المتوسطة المقايسة، إعطاء إشارة قوية التحمل للحث على المبرمج في الخلايا WEHI 164 مع TNFα وحدها، القضاء على متغير آخر من البروتوكول. مجموعات أخرى تقرير جدوى الخلية باستخدام MTT. منهجيات تستخدم الركازة التﻷلؤ حساسة إلى كاسباسي 37، بدلاً من أسلوب سبيكتروفوتوميتريك التي توجد فيها مواد امتصاص الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة في المتوسط الثقافة أو الخلايا نفسها (مثل الفينول الأحمر يمتص قبل الخلايا)، يمكن أن تتداخل مع الإشارات. وهكذا، حساسية المقايسة زاد استخدام هذا لومينيسسينتريكتانت التيار المتردد-ديفد-السلطة الوطنية الفلسطينية، كما لا يتوقع وجود مواد الإنارة (خلفية) في الأجلين المتوسط والثقافة.

حد لهذا الأسلوب أن فإنه يمكن أن تطبق فقط على الخلايا الحساسة TNFα؛ يجب اختبار خطوط الخلايا الأخرى وتركيز سيتوكين المعدلة لاستجابة خلوية أمثل. وعلاوة على ذلك، رد المطلقة لا يمكن قياسه، كما أننا لا تستخدم خط خلية الابتدائية أو في فيفو مقايسة؛ بدلاً من ذلك، يقترح متعامد المعايرة متحاور القياس (ITC) تجارب التكيف الطريقة الأولى. معلومات من مركز التجارة الدولية مفيدة لإنشاء TNFα تقارب مع جزيء جديد قيد التطوير وتحديد الشروط الأولية في أسلوب البيولوجية.

يعد هذا الأسلوب مفيداً لاختبار الجزيئات الجديدة لدى الباحثين مادة مرجعية للحصول على استجابة نسبي القاعدية؛ وبالتالي، يوصي بتقييم بيو-أفضل أو استجابة جزيئية المتصلة بحماية الخلايا. أنه يمكن تطبيقها على غيرها من البروتينات المضادة-TNFα. على سبيل المثال، أنها تنطبق على تقييم فاعلية البيولوجي النسبي اتانيرسيبت، إينفليكسيماب، سيرتوليزوماب، أو جوليموماب19. بيد أن جميع هذه الجزيئات المضادة-TNFα الانتماءات المختلفة سيتوكين؛ ولذلك، يجب تعديلها تركيزات منفردة. وهناك ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو ضيق الوقت بين بدء التجارب وتحقيق النتائج، مما يجعل من السهل لتنفيذ وغير مكلفة بالمقارنة مع نماذج حيوانية. علاوة على ذلك، تعديل هذا الأسلوب تدابير التفاعل بين الإنسان والمحيط الحيوي جزيء TNFα نشط بشكل كامل، مما يوحي بأن يدرك ماب تريمير TNFα وأن الجزيئات ليست أثناء التخزين أو مختبر التلاعب. من ناحية أخرى، نتيجة فحص الفيزيائية البحتة لا تزال مشكوك فيها. على سبيل المثال، يمكن أن يكون التفاعل بين TNFα ومآب أليسا تقليدية باستخدام قطعة أثرية تتعلق بالتغييرات الهيكلية بسبب تجميد سيتوكين الكيميائية؛ ولذلك، يمكن أن تتأثر النسب والقياسات للخطر. تمييع الحلول خلال تحليلات مركز التجارة الدولية، علاوة على ذلك، يمكن تعديل هيكل TNFα أو الإنسان والمحيط الحيوي، مما يحول دون تشكيل تريمير TNFα أو التفاعل ماب جيل حانمه artifactual. يمكن أن تكون المطالبة باستخدام خطوط الخلايا الأولية في هذا الأسلوب؛ ومع ذلك، يمكن أن تعطي حماية ضد TNFα النتائج مثيرة للاهتمام، ومحاكاة في فيفو الردود.

لقد قمنا بتصميم هذا الأسلوب ليكون من السهل متابعة واستنساخه. كما لا يمكن أن يكون مقنعا التﻷلؤ الفينول الحمراء أو غيرها من المواد امتصاص الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة، يمكن استخدام تقريبا كل مضافة متوسطة الثقافة لزراعة الخلايا. هذا التعديل الإيدز الباحثين في دراسة تطالب بخطوط الخلايا، مع استجابة كشف كامل للبقاء بعد العلاج سيتوكين. مقاطع ثلاثة على الأقل من الخلية والخلية كثافة التعديلات يجب أن تتم قبل تنفيذ المقايسة الأبطال. استقرار سيتوكين وتركيزه، أيضا، فضلا عن الاحترار واكويليبراتينج تركيز CO2 في المتوسطة الثقافة والحلول خطوات حاسمة لنجاح الفحص. وعموما، يوضح هذا المقال الخطوات اللازمة لتحييد TNFα سيتوكين مع ماب استخدام في المختبر البيولوجي اختبار للمقارنة بين إشارة وعينه قيد التطوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمه "المجلس الوطني للعلوم" والتكنولوجيا (المجلس الوطني)، والمكسيك منحة بي مبرزين 2015 220333، دون مشاركة في التصميم الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
WEHI 164 ATCC CRL-1751 Fibrosarcoma cells from Mus musculus
RPMI-1640 Medium ATCC 30-2001 Store medium at 2 °C to 8 °C
RPMI 1640 Medium, no phenol red GIBCO 11835-030 Store medium at 2 °C to 8 °C
Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red GIBCO 25200-056 Store medium at -10 °C to -20 °C
DPBS, no calcium, no magnesium GIBCO 14190-136 Store medium at 2 °C to 8 °C
Recombinant Human TNF-alpha Protein R&D Systems 210-TA-020 Store at -20 °C to -70 °C
Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG HyClone SH3089803 Store at -10 °C to -20 °C
Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized HyClone SH3007103 Store at -10 °C to -20 °C
Caspase-Glo 3/7 Assay kit Promega G8093 Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent J.T.Baker 8993-01 --
Sample mAb Adalimumab Probiomed NA Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Reference and Control mAb Adalimumab Abbvie NA Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Microplate Reader Molecular Devices 89429-536 SpectraMax M3 Multi-Mode
Microplate reader Software  Molecular Devices -- SoftMax Pro 6.3 GxP
Incubator  Revco  30482 Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2
Laminar Flow Hood  The Baker Company   200256 Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2          

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
  3. Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
  4. Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
  5. Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
  6. Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
  7. Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
  8. Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
  9. Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
  10. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
  11. Ramasubramanyan, N., et al. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).
  12. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
  13. Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
  14. Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
  15. Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
  16. Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
  17. Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
  18. Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
  19. Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).

Tags

الطب، 127 قضية، المبرمج، وتحييد الإنزيم، عامل نخر الورم ألفا، ماب المضادة-TNFα، بيوكومبارابيليتي
تحديد "قوتها النسبية" من مكافحة-تنف [مونوكلونل] جسم (ماب) قبل Neutralizing تنف استخدام أسلوب بيواناليتيكال <em>في المختبر </em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tierrablanca-Sánchez, L.,… More

Tierrablanca-Sánchez, L., Pérez Medina Martínez, V., Ramírez Ibañez, N. D., Pérez Ramírez, N. O., Flores Ortiz, F. L., Medina-Rivero, E. Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method. J. Vis. Exp. (127), e55376, doi:10.3791/55376 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter