La evaporación de reducción de Cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular Formación en placas de microtitulación

Resumen

La pérdida desigual de medio de placas de microtitulación afecta a la reproducibilidad de la formación de esferoides de tumor multicelulares uniforme. La mejora de las condiciones de cultivo para reducir la pérdida significativa medio mejorará la reproducibilidad de la formación de esferoides y los resultados de los ensayos basados ​​en esferoides utilizando la técnica de los líquidos de recubrimiento.

Resumen

Modelos de tumores que imitan estrechamente las condiciones in vivo se están volviendo cada vez más popular en el descubrimiento de fármacos y el desarrollo para el cribado de posibles fármacos contra el cáncer. Esferoides tumorales multicelulares (MCTSes) imitan efectivamente las condiciones fisiológicas de los tumores sólidos, haciéndolos excelente en modelos in vitro para la optimización de plomo y la validación de dianas. Fuera de las diversas técnicas disponibles para el cultivo de MCTS, el método líquido superposición de agarosa es uno de los métodos más económicos para la generación de MCTS. Sin embargo, la transferencia fiable de cultivos MCTS utilizando líquido de recubrimiento para la selección de alto rendimiento puede verse comprometida por una serie de limitaciones, incluyendo el recubrimiento de placas de microtitulación (MP) con agarosa y la irreproducibilidad de la formación de MCTS uniforme a través de pozos. MPs son significativamente propensos a los efectos de borde que resultan de la evaporación excesiva de medio desde el exterior de la placa, evitando el uso de toda la placa para la drogapruebas. Este manuscrito ofrece mejoras técnicas detalladas a la técnica de superposición de líquido para aumentar la escalabilidad y la reproducibilidad de la formación uniforme de MCTS. Además, los detalles de una herramienta de software simple, semi-automático, y universalmente aplicable para la evaluación de las características de MCTS después se presenta el tratamiento de drogas.

Introducción

Las células de cáncer en los tumores están dispuestos fisiológicamente en una estructura compleja, 3 dimensiones (3D), rodeada de matriz extracelular y células que interactúan. Como casi todas las células en los tejidos residen en un entorno 3D, la necesidad de más fisiológicamente relevante en modelos de tumores in vitro que imitan los rasgos tumorales se ha traducido en el desarrollo de varias técnicas de cultivo 3D ^{1, 2, 3.} Estos modelos se están convirtiendo en herramientas fundamentales de investigación para estudiar el papel del microambiente del tumor en respuesta metástasis y celular a la terapéutica en 3D ^2. Por otra parte, en comparación con 2-dimensionales cultivos celulares (2D) ^4, los modelos 3D permiten una mejor comprensión de las interacciones tumor-estroma, que afectan a las vías de señalización celulares.

esferoides tumorales multicelulares (MCTSes) de líneas celulares de cáncer se utilizan con frecuencia en la celda 3D cULTURA modelos debido a su relativa cercanía a los tumores in vivo. Fuera de las varias técnicas en uso, la técnica de los líquidos de recubrimiento (LOT) de la generación de MCTS en placas de agarosa recubiertas de ha ganado un interés significativo para la optimización de plomo y de destino de validación ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11.} Esto es evidente en los recientes estudios que fueron éxito capaz de ejecutar las pantallas piloto de bibliotecas de compuestos en cultivos MCTS utilizando ^el lote ^{6, 7.} Sin embargo, la variabilidad del pozo a pozo en MCTS morfología y crecimiento debido a la pérdida de evaporación desigual inducida del medio son obstáculos comunes que acompañan a la LOT usando placas de microtitulación (MPs). En consecuencia, la formación de no uniforme MCTSes compromete la importancia y relevanciade los datos de ensayos farmacológicos ^{8, 12, 13.} Además de los problemas de reproducibilidad, otro problema práctico que afecta a ensayos de alto rendimiento basado en lotes es el recubrimiento de los parlamentarios con la agarosa utilizando las unidades de dispensación automático de líquidos. Aunque la unidad de distribución se puede mantener calienta a prevenir la gelificación de agarosa, la obstrucción de la cassette de distribución y el tubo es un problema potencial para los sistemas robóticos ^6.

Para superar algunos de estos desafíos, hemos ideado recientemente algunas modificaciones en el lote para el cultivo de MCTS ^8. Estas modificaciones se basan principalmente en las posibles formas de prevenir la pérdida de medio desigual de los parlamentarios que utilizan instrumentos que se encuentran comúnmente en los laboratorios de análisis de alto rendimiento. Un procedimiento detallado de la LOT modificado para la generación de MCTSes de tamaño uniforme y reproducible a través de 3placas de 84 pocillos (WP) se presentan aquí. El manuscrito también presenta una rutina de semi-automatizado para la evaluación del tamaño de MCTS, en particular en MCTSes parcialmente desintegradas, tratados con el fármaco que no tienen un límite claramente definido para la medición del área en sección transversal.

Protocolo

1. Preparación de placas recubiertas con agarosa

1. Pesar 0,75 g de agarosa de bajo punto de fusión y añadirlo a 100 ml de medio 5A de McCoy (con o sin rojo fenol) sin suero. Calentar la solución en un horno de microondas y agitar cada 1-2 min para disolver completamente la agarosa. Autoclave la solución para esterilizarlo.
2. Se enfría la autoclave de agarosa a aproximadamente 70 ° C y filtrar a través de un 500 mL, 0,22 micras filtro superior por filtración a vacío en una caja de flujo laminar. Alícuota del 0,75% filtrada solución de agarosa (FAS) en volúmenes más pequeños si no se utiliza la solución completa de una vez. Almacenar esta solución de agarosa asépticamente listos para usar en una habitación fría o 4 ° C refrigerador hasta por 4 semanas.
3. Adjuntar un pequeño tubo con una Plastica- o casete de dispensación con punta de metal para un dispensador de reactivos Combi y cebar la casete con 70% de etanol (EtOH) y después con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en un cuadro de flujo.
4. Antes de su uso, calentar una alícuota almacenada de FAS i n el microondas para que se derrita. El primer casete de dispensación con una solución de agarosa y el abrigo de 384 pocillos, cultivo de tejidos (TC) tratados con "especial" microplacas con 15 l de FAS. Deje que la agarosa en la placa se enfríe durante 15-20 minutos antes de sembrar las células. Almacenar las placas de agarosa recubiertas de forma aséptica, envuelto en una bolsa de polietileno en una habitación fría o a 4 ° C y protegido de la luz directa.
   NOTA: Evitar el calentamiento repetido del 0,75% FAS para evitar un cambio en la concentración de agarosa en la solución madre. placas de agarosa recubiertas de se pueden almacenar durante hasta 2 semanas cuando se almacena bajo las condiciones antes mencionadas. El FAS no requiere calentamiento durante el recubrimiento de placas.
5. Limpiar el casete de dispensación cebando con 70-80 ° C agua estéril para eliminar cualquier resto de agarosa en la punta de cassette y tubos.

2. Cultivo Celular y MCTS Formación

1. HCT116 células de carcinoma colorrectal humano Cultura, como se ha descrito anteriormentelass = "xref"> 8.
2. Eliminar el número requerido de agarosa recubiertas, de 384 pocillos, TC-tratados microplacas de almacenamiento en frío y se equilibre a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
3. Preparar el dispensador de reactivos Combi para la siembra de células cebando un casete de dispensación tubo estándar con EtOH al 70% y PBS estéril. Ajuste el volumen a la siembra l requerida y la velocidad de dispensación al medio utilizando los botones de ajuste manual en el dispensador.
   NOTA: El proceso de la siembra de células se lleva a cabo en condiciones estériles y en un cuadro de flujo laminar.
4. Disociar las células adherentes del matraz de cultivo de tejidos usando una enzima de disociación celular recombinante. Hacer una acción suspensión de células en un vaso de precipitados estéril con células de semillas a una densidad de 2,5 x 10 ⁴ células / ml por pocillo en 50 l de medio de crecimiento completo. Cuando la siembra de más de un 384-WP, remover las células usando un agitador magnético para evitar que depositarse en el fondo del vaso de precipitados.
5. permitir que elplacas en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante 15 minutos a 4 x g.
6. Mientras tanto, tomar una tapa de la evaporación del medio ambiente reductor y llenarlo con 8 ml de _H2O estéril o el 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) en los lados cortos (izquierda y derecha) usando una pipeta de 5 ml (Figura 1A). En primer lugar, prescindir 4 ml de líquido de relleno en la pila de la izquierda mediante el barrido de la punta de la pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo. Repita este paso con el canal del lado derecho.
   NOTA: Asegúrese de que el líquido añadido a los canales secundarios no mezcla en el centro de la tapa y dejar un espacio para el intercambio de gases (Figura 1A). La adición de una cantidad excesiva de H ₂ O resultados en la filtración de _H2O en el exterior de la tapa y, posteriormente, en los pocillos exteriores de las placas de 384 pocillos TC.
7. Llenar el depósito de líquido de la placa de TC de 384 pocillos con H ₂ O estéril y vuelva a colocar las tapas de placas regulares con las tapas ambientales llenas de líquido (Figura 2A).
8. Colocar las placas en una incubadora rotativa 37 ° C con 95% de humedad, 5% de CO _2, y 20% de O _2, y permitir que las células se agregan en MCTSes durante 4 días. Evitar la apertura de la puerta de la incubadora durante demasiado tiempo en los días posteriores a fin de evitar que el nivel de humedad caiga bruscamente.

3. Intercambio media usando un sistema robótico

1. En el día 4 después de la formación de MCTS, añadir 30 l de medio de pre-calentado por pocillo usando un dosificador lavador de microplacas automatizado. Permitir que los MCTSes crecer durante 3 días adicionales. Reemplazar el medio regularmente cada 3 días, hasta que alcancen el tamaño deseado para la experimentación.
2. Para aspirar un volumen definido de medio de cada pocillo, empíricamente ajustar el -altura z del colector de la lavadora. Aspirar 30 l de medio por pocillo y reemplazarlo con 30 l de medio fresco, pre-calentado.
   NOTA: Ajuste la velocidad de dispensación y la velocidad a la que el colector se desplaza hacia abajo la arandelaen los pozos en la tarifa más baja para minimizar la turbulencia en los pozos.

4. Imágenes de alta contenido de los MCT y análisis de imágenes semi-automatizado

1. La imagen de MCTS en un sistema automatizado de imágenes de alto contenido utilizando un objetivo de aire 4X (NA 16).
2. Ajuste el tiempo de exposición a 11 ms y el binning de 4 x 4. Ajuste el número y el espaciamiento de los -stacks Z y el pixel binning como se desee para el experimento para capturar todo un MCTS por pocillo.
3. Procesar las imágenes paso a paso, como se describe en el "readme", usando una rutina de la casa escrito en lenguaje de programación.
   Nota: El código .m y léame .txt archivos están disponibles como archivos de código suplementarios (Figura 1B). Las medidas rutinarias de la zona de MCTS, ejes mayor y menor, el perímetro y la solidez de las imágenes 2D.

Figura 1:Preparación de tapas ambientales y un diagrama de flujo de la rutina de semi-automática. (A) Imagen de una tapa de la evaporación del medio ambiente reductor de lleno con el correcto (izquierda) y el exceso (a la derecha) la cantidad de líquido que llena (en este caso, 5% de DMSO). La flecha indica la cubeta de lado corto para añadir líquido. El asterisco muestra el hueco en el centro de la tapa después de la adición del volumen correcto de DMSO. (B) Un flujo de trabajo que muestra las etapas implicadas en la rutina de análisis de imagen semi-automatizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

La pérdida desigual del medio, sobre todo de los pozos periféricos, es un problema frecuentemente encontrado en los parlamentarios con pequeños volúmenes de cultivo. Condiciones de cultivo sustancialmente mejoradas, tales como incubadoras con sistemas bien controlados de temperatura / humidificación y parlamentarios de evaporación reductores y tapas de placas, reducen la pérdida significativa de la media en todos los pozos ^8. Para medir la evaporación relativa, se...

Discusión

El recubrimiento de placas de 384 pocillos con filtro de CT con agarosa

La práctica estándar en la LOT es utilizar un punto de agarosa de baja fusión 1-1,5% para recubrir las placas, lo que requiere la agarosa y / o unidad de distribución que deben tenerse climatizada para evitar la gelificación de la agarosa ^6. La gelificación de la agarosa es materia de preocupación mientras se prepara múltiples platos usando casetes de dispensación de líquido con pequeñas aberturas de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9414
McCOY's 5A Medio de	Sigma-Aldrich	M8403
" rápido" Filtro Filtermax	TPP	99505	0.22 μ m, 500 mL
Multidrop™ Dispensador de reactivos Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300
Casete dispensador de tubo pequeño	Thermo Fisher Scientific	24073295	Punta de metal
Placa TC de 384 pocillos	PerkinElmer	6057308	Tipo de placa- CellCarrier
Casete dispensador de tubo estándar	Thermo Fisher Scientific	24072670
MicroClime Tapa Ambiental	Labcyte	LLS-0310
DMSO	Sigma	D4540
Incubadora rotativa (SteriStore )	HighRes Biosolutions	23641	Nº de serie: D00384
Dispensador de lavadora de microplacas	no especificado	de BioTek	: EL406 y nbsp;
Sistema de imágenes de alto contenido (CellVoyager)	Yokogawa Electric Corporation	no especificado	: CV7000
Orange G	New England Biolabs	B7022S
TrypLE™ Reactivo de disociación celular recombinante Express	Thermo Fisher Scientific	12604021	Phenol rojo free