Summary
Uma abordagem imuno-histoquímica de montagem total, para visualizar a expressão da proteína de neurofilamento no trato biliar extra-hepático em Suncus murinus. É apresentado aqui. Este protocolo pode ser usado para analisar a inervação de todos os órgãos viscerais em S. murinus ou outras espécies.
Abstract
Este trabalho descreve detalhadamente o método de coloração de imuno-histoquímica total, usando anticorpo de proteína de neurofilamento para rotular a inervação do trato biliar em Suncus murinus ( S. murinus ). Primeiro, a amostra foi dissecada de S. murinus e fixada em paraformaldeído a 4% (PFA). Em segundo lugar, foram realizados um tratamento enzimático e potencial inativação da peroxidase endógena. O espécime foi então exposto ao anticorpo primário, anticorpo anti-proteína de neurofilamento, durante 3-6 dias. Foi então incubado com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. A reação de cor foi revelada fazendo reagir o espécime com um substrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Este método pode ser aplicado para analisar a inervação de todos os órgãos viscerais. Além disso, este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronais, mas a otimização do antibodiO primeiro deve ser feito primeiro. Este método foi originalmente introduzido por Kuratani e Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
A muscaria Musk Muscus , Suncus murinus , pertence à ordem Insectivora e Soricidae familiar. Este pequeno mamífero é distribuído em todo o Sudeste Asiático e habita casas e áreas gramadas que se situam perto de habitações humanas ou canetas de gado 4 . Esta espécie exibe características morfológicas gerais mais semelhantes aos humanos do que outros animais de laboratório, como o mouse, o rato e o coelho 5 . Anteriormente, foi utilizada imunomarquência total com um marcador de neurônio periférico para a proteína de neurofilamento de S. murinus (NFP) para rotular os nervos periféricos no pâncreas 6 , a papila duodenal principal 7 , o píloro 8 , a vesícula biliar 5 e o trato biliar extra-hepático 9 .
NFP é um complexo macromolecular que faz parte do citoesqueleto neuronal maduro. Proteína relacionada ao neurofilamentoMede as interações entre NFP e o zygosoma. Tanto a função enzimática quanto a estrutura das proteínas de ligação são reguladas pelo NFP 10 . O complexo NFP é composto de três polipéptidos: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) e NF-H (200 kDa). O NFP pode ser encontrado em axônios neuronais no sistema nervoso central e periférico. O anticorpo anti-NFP humano mostrou rotular os axônios do sistema nervoso central e periférico. Investigações anatômicas e eletrofisiológicas demonstraram que o esfíncter, a vesícula biliar e o trato gastrointestinal proximal estão conectados 11 , 12 , 13 , 14 . No entanto, as características morfológicas de suas conexões neuronais ainda não foram definidas.
Este trabalho demonstra o uso de um método de coloração imuno-histoquimica de todo o suporte para rotular a inervação do S. murinus bilCom um anticorpo NFP.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Metropolitana de Tóquio (IACUC). Os animais foram alojados e manuseados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Utilizamos animais criados e mantidos no Laboratório de Morfologia Funcional, Departamento de Ciências da Saúde da Fronteira, Universidade Metropolitana de Tóquio, Japão.
1. Cuidados com animais e habitação
- Obtenha 7 S. murinus (3 fêmeas e 4 machos pesando 70-90 g) de uma colônia de criação fechada.
- Cale o S. murinus individualmente após o desmame (20 d após o nascimento ) em gaiolas de plástico equipadas com uma caixa de ninho de madeira contendo tiras de papel. Mantenha-os em uma sala de animais convencionalmente condicionada: 23-27 ° C, sem controle de umidade e uma luz de 12:12 h: ciclo escuro. Supply commercPellets de trutas e água ad libitum.
2. Preparação de Tecidos
- Para preparar 4% (p / v) de paraformaldeído (PFA), dissolver 40 g de PFA em 1000 mL de solução salina tamponada com fosfato 0,01 M (PBS, pH 7,4). Em uma aspiradora, misture usando um vórtice até a solução ficar limpa. Armazene 4% de PFA O / N a 4 ° C.
Cuidado: Use equipamento de proteção pessoal apropriado (PPE) ao manusear o PFA. - Para perfurar e consertar o animal, anestesiar com éter e depois dar-lhe uma injeção intraperitoneal de somnopentilo (pentobarbital sódico, 0,6 mL / kg de peso corporal).
- Depois que o animal é completamente narcotizado, abra a cavidade abdominal com um bisturi, criando uma incisão abdominal na linha média com 3 cm de comprimento. Ao incitar a veia cava inferior para exsanguinating, insira um catéter retrogradável na aorta abdominal no nível imediatamente acima da bifurcação desta artéria nas artérias ilíacas comuns.
- Injetar somnopentil (pentobarbital assimDium, 1,0 mL / kg de peso corporal). Após a eutanásia completa, perfusar com PBS 0,01 M (pH 7,4) e depois com 4% de PFA numa aspiradora.
- Após a perfusão, injete 2-3 mL de látex branco de neoprene (diluição do látex de neoprene branco 3: 2 com água destilada (DW)) para rotular os vasos sanguíneos.
- Extraia os órgãos abdominais, incluindo o fígado, a vesícula biliar, o ducto biliar comum, o duodeno e o pâncreas em bloco, com os nervos e vasos relacionados.
- Injetar aproximadamente 0,1 mL de látex azul de neoprene (adicionar uma gota de tinta azul a 10 mL do látex de neoprene branco diluído) até a vesícula biliar para rotular o sistema biliar.
- Pós-fixação durante a noite com 4% de PFA a 4 ° C para imunomarcação total.
Atenção: o PFA é tóxico. Evite manipular diretamente o PFA. O PFA deve ser usado em uma chaminé.
3. Imunohistoquímica de montagem total
Nota: Ao longo do protocolo, incluindo durante a lavagem, incubação de anticorpos e coloração,O espécime deve permanecer no nutator, balançando suavemente à TA ou a 4 ° C.
- Dia 1: Tratamento enzimático e inativação da potencial peroxidase endógena
- Lave o espécime preparado com DW 4x por 1 h cada à temperatura ambiente em um frasco de vidro de tamanho apropriado. Balance o espécime gentilmente sobre o nutator para remover o PFA. Evite danificar o espécime ao trocar soluções.
- Para preparar 1% (p / v) de ácido ortoperiodico, dissolva 1 g de ácido ortoperiodico em 100 mL de DW.
- Incubar a amostra em 1% de ácido ortoperiodico durante 20 minutos à TA para evitar qualquer reação intrínseca à peroxidase.
- Prepare 0,004% (p / v) de papaína por dissolução de 0,004 g de papaína em 100 mL de tampão Tris-HCl 0,025 mol / L (pH 7,6).
- Lave o espécime com DW por 10 minutos à TA.
- Incubar o espécime em 0,004% de papaia recém-preparada durante 2 h a 37 ° C em banho a temperatura constante com balanço suave.
- Lave o espécime com DW por 50-60 minutos na RT.
- Armazene o espécime em 4% de PFA a 4 ° CO / N.
- Dia 2: tratamento enzimático
- Lave o espécime armazenado com DW 4 vezes durante 1 h cada à TA.
- Incubar o espécime em 0,004% de papaia recém-preparada durante 2 h a 37 ° C em banho a temperatura constante com balanço suave.
- Lave o espécime com DW durante 50-60 minutos à RT. Armazene o espécime em 4% de PFA a 4 ° CO / N.
- Dia 3: tratamento de congelação
- Lave o espécime armazenado com DW 4x durante 1 h cada à temperatura ambiente, como acima.
- Preparar 2,5% (p / v), 5% (p / v) e 10% (p / v) de sacarose dissolvendo 2,5 g, 5 g e 10 g de sacarose, respectivamente, em 100 mL de PBS 0,01 M ( PH 7,4).
- Mergulhe o espécime em 2,5% (p / v), 5% (p / v) e 10% (p / v) de sacarose por 30 min cada.
- Congele o espécime a -20 ° C durante 30 a 60 min e depois descongelá-lo completamente à TA; Repita o ciclo 3x.
- TopoRepare 2% de Triton X-100 (v / v), adicione 2 mL de Triton X-100 a 100 mL de PBS 0,01 M (pH 7,4).
- Armazene o espécime em 2% de Triton X-100 a 4 ° CO / N.
- Dia 4: incubação primária de anticorpos
- Prepare a solução de diluição do anticorpo primário dissolvendo 0,2 g de albumina de soro bovino (BSA), 0,3 mL de Triton X-100 e 0,1 g de azida de sódio em 100 mL de PBS 0,01 M (pH 7,4).
Atenção: A azida de sódio é extremamente tóxica. A inalação e o toque devem ser evitados. Use PPE apropriado. - Diluir o anticorpo primário (NFP) 1: 600 no tampão de diluição acima (passo 3.4.1). Incube o espécime com anticorpo NFP a 4 ° C por 3-6 dias, mantendo o espécime balançando suavemente no nutator. Espécimes maiores exigirão tempos de incubação aumentados.
- Prepare a solução de diluição do anticorpo primário dissolvendo 0,2 g de albumina de soro bovino (BSA), 0,3 mL de Triton X-100 e 0,1 g de azida de sódio em 100 mL de PBS 0,01 M (pH 7,4).
- Incubação secundária de anticorpos
- Lave o espécime em PBS 4x durante 1 h cada à TA para remover o anticorpo primário não ligado. Preparar a solução de diluição para o anticorpo secundário dissolvendo 0,2 g de BSA e 0,3 mL de Triton X-100 em 100 mL de PBS 0,01 M (pH 7,4).
- Diluir o anticorpo secundário (IgG-HRP anti-rato anti-rato purificado por afinidade conjugado com peroxidase) 1: 600 no tampão de diluição (passo 3.5.2). Incube o espécime com o anticorpo secundário a 4 ° C durante 3 dias e mantenha o espécime balançando suavemente na porca.
- Coloração
- Prepare a solução de coloração DAB adicionando 0,002 g de tetrahidrocloreto de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) a 100 mL de tampão Tris-HCl 0,05 mol / L (pH 7,6) sob uma aspiradora, mantendo a solução no escuro.
- Lave os espécimes à RT em PBS 4x por 1 h cada.
- Adicione 10 μL de 30% de H 2 O 2 em solução de coloração DAB recém-preparada e incuba com a solução a 4 ° CO / N ou durante 3 dias enquanto se meca suavemente no nutator.
- Pare a reação por plaCing o espécime em PBS com 0,04% de azida de sódio quando a intensidade de coloração ideal é atingida.
NOTA: Evite o uso de azida de sódio até este passo, pois inibe a peroxidase de rábano.
- Imaginando o tecido manchado
- Transfira cuidadosamente o espécime para um prato de vidro petri (5 cm de altura, 10 cm de diâmetro) contendo PBS. Capture imagens de montagem total usando uma câmera montada em um estereomicroscópio.
NOTA: O tecido manchado de montagem total deve ser fotografado enquanto mergulhou completamente em PBS em um prato de vidro transparente.
- Transfira cuidadosamente o espécime para um prato de vidro petri (5 cm de altura, 10 cm de diâmetro) contendo PBS. Capture imagens de montagem total usando uma câmera montada em um estereomicroscópio.
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Representative Results
As Figuras 1 a 4 mostram resultados típicos para fibras nervosas NFP positivas no trato biliar extra-hepático em S. murinus . O anticorpo contra NFP reproduzivelmente rotulou a inervação em toda a imagem do trato extra-hepático biliar ( Figura 1 ), vesícula biliar ( Figura 2 ), ducto biliar superior ( Figura 3 ) e área de papila duodenal ( Figura 4 ), com alta especificidade e mínimo fundo.
Para todos os tecidos do espécime, independentemente da forma e tamanho, os nervos tegmentais podem ser tingidos ao mesmo tempo. Além da inervação do tracto biliar extra-hepático, a densidade de corrida e distribuição do vago do esôfago e do estômago foi exibida inequivocamente ( Figura 1 ).
Figura 2 ).
No ducto biliar superior, dois tipos de feixes nervosos foram rotulados. Os feixes de nervos finos formaram uma rede irregular e densa de nervos, correu de forma adesiva e residia no trato biliar; Os feixes neurais mais espessos foram distribuídos paralelamente à superfície do trato biliar ( Figura 3 ).
O ducto biliar comum foi marcado com látex azul de neoprene e os vasos com látex branco de neoprene. As fibras nervosas finas no final do ducto biliar comum e a área de papila duodenal foram claramente demonstradas com alta c Ontrast ( Figura 4 ).
Figura 1: Fibras Nervais NFP-positivas no Trato Biliar, Esófago e Estômago. As setas mostram o vago que corre ao longo do esôfago até o estômago. CBD, Common Bile Duct; Es, esôfago; St, estômago. Barra de escala = 1.300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fibras nervosas positivas para NFP na vesícula biliar. Os vasos sanguíneos da vesícula biliar foram rotulados com látex branco. Inervação abundante ocorreu no pescoço da vesícula biliar (flechas). Barra de escala = 1000 μm.Ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fibras nervosas NFP positivas no tubo biliar superior. Foram observados dois tipos de feixes nervosos. Um tipo era os feixes de nervos finos que funcionavam de forma adesiva e residiam no trato extra-hepático biliar (setas); O outro tipo foi feixes neurais mais espessos que foram distribuídos paralelamente à superfície do trato biliar extra-hepático e correu entre a vesícula biliar e o duodeno (triângulos). PV, Portal Vein. Barra de escala = 650 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fibras nervosas positivas para NFP na área de papila Duodenal. O ducto biliar comum foi rotulado com látex azul e os vasos com látex branco (*). As setas mostram a inervação do fim do ducto biliar comum, e os triângulos mostram a inervação da área da papila duodenal (P), que vem da via biliar comum e dos vasos. Barra de escala = 1000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho descreve o procedimento experimental para a visualização da inervação do trato biliar extra-hepático usando um anticorpo contra a proteína do neurofilamento. Este protocolo foi adaptado do protocolo descrito por Kuratani e Tanaka 1 , 2 , 3 .
Para esta experiência, planeje a linha de tempo para cada uma das experiências, já que a abordagem de coloração total continua por 2-3 semanas. O recipiente que contém o tecido deve ser rodado em um nutator em todos os momentos, exceto durante o processo de congelamento / descongelamento. Particularmente durante a incubação com os anticorpos primário e secundário, a amostra foi colocada em uma câmara de armazenamento fria enquanto girava em uma porca para garantir a exposição uniforme da amostra às soluções de reação. Várias soluções - 1% (p / v) de ácido ortoperiodico, 0,004% (p / v) de papaina e o tampão de diluição para o antioxidante primário / secundárioMorre - deve ser feito fresco para cada experimento. Ao longo do protocolo, para evitar tocar e danificar o espécime ao mudar as soluções, as soluções devem ser derramadas em vez de serem removidas com fórceps 15 .
Após a fixação com PFA, as amostras devem ser suficientemente lavadas com DW ou PBS. Além disso, o tratamento enzimático com a incubação de papaína é importante. O calor e a enzima utilizados para recuperação de antígenos ajudam a preparar o tecido para a penetração de anticorpos. Para aumentar a penetração das soluções, a membrana externa do tecido deve ser interrompida por um tratamento de congelação a -20 ° C durante 30 min ou -80 ° CO / N 15 .
É importante submergir completamente a amostra experimental em volumes adequados de solução tampão para garantir que a solução possa incubar todo o espécime. O tempo de incubação do anticorpo primário deve ser empiricamente determinadoD para diferentes tecidos e tamanhos de amostra. Normalmente, deve ser de 3 dias para uma amostra de 2-3 cm. A diluição ideal deve ser determinada empiricamente para cada anticorpo. Uma diluição a 1: 600 é recomendada para os anticorpos primário e secundário quando se utiliza o tampão de anticorpo apropriado.
Este trabalho descreve, em detalhes, o protocolo de uma abordagem imuno-histoquimica de montagem completa versátil para revelar a expressão da proteína neurofilamentar no trato biliar de S. murinus . Este método pode ser usado para analisar a inervação de todos os órgãos viscerais em muitas espécies. Além disso, este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronais, mas a otimização dos anticorpos deve ser realizada.
No entanto, a técnica foi limitada na rotulagem do tecido nervoso raso e na construção de um modelo tridimensional de inervação. Além disso, não conseguiu identificar as características das fibras nervosas ( ou seja, simpatizante ou parSimpático, motor ou sensorial, etc. ).
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores não têm reconhecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
References
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