Las imágenes de células vivas de las células sanguíneas etiquetadas en la circulación ocular pueden proporcionar información sobre la inflamación y la isquemia en la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Se describe un protocolo para etiquetar células sanguíneas e imágenes de las células marcadas en la circulación retiniana.
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Artículo de método
Etiquetado de colorantes fluorescentes de eritrocitos y leucocitos para estudiar la dinámica de flujo en la circulación de la retina del ratón
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
La dinámica del flujo sanguíneo retinal y coroideo puede proporcionar una visión de la fisiopatología y secuelas de diversas enfermedades oculares, como el glaucoma, la retinopatía diabética, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y otras afecciones inflamatorias oculares. También puede ayudar a controlar las respuestas terapéuticas en el ojo. El etiquetado adecuado de las células sanguíneas, junto con la obtención de imágenes de células vivas de las células marcadas, permite investigar la dinámica del flujo en la circulación retinal y coroidea. Aquí, se describen los protocolos estandarizados de 1,5% indocyanine green (ICG) y 1% fluoresceína de sodio etiquetado de ratones eritrocitos y leucocitos, respectivamente. Se aplicó una oftalmoscopia láser de exploración (SLO) para visualizar las células marcadas en la circulación retiniana de ratones C57BL / 6J (tipo salvaje). Ambos métodos demostraron distintas células marcadas con fluorescencia en la circulación retiniana del ratón. Estos métodos de etiquetado pueden tener aplicaciones más amplias en diversas enfermedades ocularesModelos.
Introducción
El estudio de la dinámica de flujo de las células sanguíneas en la retina y la circulación coroidea es imprescindible para comprender la patogénesis de las enfermedades oculares potencialmente amenazadoras de la visión y otras afecciones inflamatorias oculares. Sin embargo, las técnicas de angiografía convencionales, que implican la unión de colorantes fluorescentes a proteínas plasmáticas, no proporcionan ninguna información con respecto a la dinámica de los eritrocitos o leucocitos 1 . La dinámica del flujo retiniano eritrocitario es importante para el estudio de la circulación metabólicamente eficiente en la retina y la dinámica del flujo l....
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Protocolo
Los protocolos de animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth, Singapur y están de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el Uso de Animales en Oftalmología y Visión Investigación.
1. Etiquetado de eritrocitos y leucocitos con colorantes fluorescentes
- Preparación de reactivos
- Preparar ICG (1,5 mg / ml) disolviendo 3 mg de ICG en 1800 μl de agua destilada esterilizada. Añadir 200 μl de solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS).
- Preparar 40% 1x PBS añadie....
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Resultados
Los eritrocitos marcados con ICG al 1,5% se visualizaron en la circulación retiniana de ratones C57BL / 6J (tipo salvaje). Tanto el 1% como el 5% de hematocrito de 1,5% de eritrocitos marcados con ICG se distinguían en la circulación retiniana. Sin embargo, las células marcadas individuales se visualizaron más claramente con 1% de hematocrito de 1,5% de eritrocitos marcados con ICG ( Figura 1 ). En el 5% de hematocrito, debido al gran número de células marca.......
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Discusión
El estudio de la hemodinámica en la retina y la circulación coroidea es vital para la comprensión de la fisiopatología de muchas enfermedades oculares. La dinámica del flujo sanguíneo en la circulación de la retina puede ser estudiada por tomografía de coherencia óptica de dominio de Fourier (FD-OCT), láser speckle flowgraphy (LSFG) y oximetría de retina. Aunque estos métodos utilizan diferentes enfoques para estudiar el flujo sanguíneo total en la circulación retiniana, comparten la limitación de la incapacidad para es.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar. Ningún conflicto financiero o de interés.
Agradecimientos
El proyecto de investigación fue financiado bajo la beca New Investigator del National Medical Research Council (NMRC), Singapur. El equipo querrá agradecer el entrenamiento de investigación proporcionado al Dr. Agrawal en el Instituto de Oftalmología (IoO), University College London (UCL) bajo el Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC) Overseas Research Training Fellowship de noviembre de 2012 hasta octubre de 2014 bajo la tutoría del Prof. David Shima. El Dr. Agrawal adquirió el concepto y las habilidades para etiquetar las células y las imágenes en vivo en el laboratorio del Dr. Shima. Por lo tanto, el equipo agradecerá la supervisión y orientación durante....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colorante de polimetina Cardiogreen (verde de indocianina) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluoresceína 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10x Solución salina tamponada con fosfato (PBS) Grado ultra puro | 1ª BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Tubos de microtainer con K2E (K2EDTA) - Concentración de EDTA - 1,8 mg/mL de sangre | BD, EE. UU | REF | |
| 365974 Solución histopaca 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrífuga 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Tubos de microcentrífuga 2 mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Mezclador de vórtice | Insta BioAnalytik pte. ltd | VÓRTICE FINO | |
| Incubadora agitadora | Lab Tech | ||
| Ceva Inyección de ketamina (clorhidrato de ketamina 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Clorhidrato de xilacina 20 mg/ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Madriacil 15 mL (Tropicamida 1%) | Alcon Laboratorios, Inc. EE. UU. | NDC  0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Clorhidrato de fenilefrina 2.5%) | Alcon Laboratorios, Inc. EE. UU. | NDC  0998-0342-05 | |
| Jeringa Terumo con aguja 1 cc/mL Tuberculina | Terumo (Filipinas) Corporation, Filipinas | SS-01T2613 | |
| Gel Vidisic 10 G | Dr. Gerhard Mann, Químico-Farmacéutico, Fabrik Gmbh, Berlín, Alemania | ||
| Hisopos con alcohol | Asegure los productos médicos desechables | 7M-004-L-01 | |
| Sistema de angiografía de escaneo láser confocal (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Alemania | ||
| Software Hiedelberg Spectralis Viewing Module, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Alemania | ||
| Microscopio fluorescente | ZEISS | Modelo: axio imager z1 |
Referencias
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent lab....
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Reimpresiones y permisos
