Artículo de método

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

DOI:

10.3791/55498

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1 de abril de 2017

 ,  ,  , 
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mayoría de las proteínas actúan en asociación con otras; por lo tanto, es crucial caracterizar estas unidades funcionales para comprender completamente los procesos biológicos. La purificación por afinidad acoplada a la espectrometría de masas (AP-MS) se ha convertido en el método de elección para identificar las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, los estudios convencionales de AP-MS proporcionan información sobre las interacciones de las proteínas, pero la información organizacional se pierde. Para abordar este problema, desarrollamos una estrategia para desentrañar los distintos ensamblajes funcionales en los que podría estar involucrada una proteína, mediante la resolución de complejos de proteínas purificadas por afinidad antes de su caracterización por espectrometría de masas. Los complejos proteicos aislados a través de la purificación por afinidad de una proteína de cebo utilizando una etiqueta de epítopo y elución competitiva se separan mediante electroforesis nativa azul. La comparación de los perfiles de migración de proteínas a través de perfiles de correlación mediante espectrometría de masas cuantitativa permite la asignación de proteínas que interactúan a distintas entidades moleculares. Este método es capaz de resolver complejos de proteínas de pesos moleculares cercanos que podrían no resolverse con técnicas cromatográficas tradicionales, como la filtración en gel. Con poco más trabajo que el AP-geLC-MS/MS convencional, demostramos que esta estrategia puede ser adecuada en muchos casos para obtener información topológica compleja de proteínas concomitantemente con la identificación de interacciones proteicas.

Introducción

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En las células, la mayoría de las proteínas realizan sus funciones a través de interacciones proteína-proteína transitoria o mediante la formación de conjuntos de proteínas estables. La caracterización de las interacciones proteína es crucial para los procesos celulares entender por completo. La purificación por afinidad en combinación con espectrometría de masas (AP-EM) es una de las estrategias más comúnmente aplicados para identificar interacciones proteína nativa. Mejoras significativas en las capacidades del instrumento logrados en la última década han hecho que este enfoque extremadamente potente. Es importante señalar que las interacciones identificadas por experimentos de AP-EM incluyen una mezcla de asociaciones directas e indirectas entre cebo y presas. Además, a menudo las proteínas toman parte en varios complejos diferentes dentro del mismo contexto celular, que pueden tener diferentes funciones biológicas, y por lo tanto los interactores que se identifican por AP-MS podrían representar una mezcla de los conjuntos de proteínas distintas o entidades funcionales. No es posible derivardicha información topológica a priori de la lista de mono-dimensional de las proteínas generadas por simples experimentos AP-EM. Sin embargo, la técnica puede aprovecharse más para definir la arquitectura de complejos de proteínas mediante la combinación con uno o más métodos para resolver estos conjuntos.

Con el fin de resolver la topología de las interacciones de las proteínas identificadas a través de la AP-EM, se han aplicado varias estrategias. Un enfoque consiste en realizar iterativos experimentos AP-EM usando las presas identificadas en una ronda previa de experimentos como cebos 1. Aunque muy informativo, esta es una tarea intensiva bastante trabajo tanto a nivel experimental y analíticamente. Protein reticulación en combinación con espectrometría de masas se utiliza cada vez para derivar información topológica sobre complejos de proteínas 2, 3, 4, 5. Sin embargo, computatioanálisis nal de péptidos reticulados sigue siendo una tarea difícil y por lo tanto es el cuello de botella en el flujo de trabajo. El advenimiento de reactivos MS-escindibles de reticulación debe facilitar el mapeo de los residuos de aminoácidos que se encuentran en estrecha proximidad en las proteínas que interactúan 6, 7. Otra alternativa es la combinación de la purificación por afinidad con técnicas de separación ortogonales anteriores 8, 9. El fraccionamiento cromatográfico por filtración en gel o de intercambio iónico, o fraccionamiento en gradiente de sacarosa han recientemente también se ha utilizado en combinación con espectrometría de masas cuantitativa para describir complejos multiproteicos en un nivel de todo el sistema, sin pasar por el complejo etapa de aislamiento 10, 11, 12, 13. electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) ha sido ampliamente aplicado ainvestigar las interacciones de proteínas nativas, típicamente los que implican complejos de proteínas de membrana mitocondrial 14. Esta técnica de separación también se utilizó recientemente en combinación con la cuantificación de proteínas libre de etiqueta y de perfiles de correlación, no sólo en complejos mitocondriales 15, 16, 17, sino también para desentrañar otros complejos de proteínas de células enteras 18, 19. La hipótesis de que la combinación de la purificación por afinidad con los enfoques de fraccionamiento nativos posteriores y MS cuantitativa debe proporcionar una estrategia útil para la resolución de múltiples conjuntos de proteínas que contienen una proteína particular.

Aquí se describe un método que combina la purificación por afinidad basada en el epítopo genérico con azul electroforesis en gel de poliacrilamida nativo de los complejos aislados, seguido por sp masa cuantitativaectrometry y la proteína de perfiles de correlación, para resolver los múltiples conjuntos de una proteína podría estar involucrado en. Empleamos las células madre embrionarias de ratón, donde una proteína de interés fusionada a una etiqueta de epítopo se expresa a partir del locus endógeno de lograr cerca de abundancia fisiológica y asegurar nativa eficiente aislamiento compleja. Este enfoque se desenreda las múltiples interacciones una proteína participa en, la solución de ellos en conjuntos distintos basados en sus perfiles de correlación, mientras que no requiere más trabajo que convencional GELC-MS 20.

Protocolo

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1. Aislamiento de complejos de proteínas nativas por bandera purificación por afinidad

  1. Preparativos
    1. Establecer un baño de agua C 37 ° para descongelar el sedimento celular.
    2. Enfriar una microcentrífuga a 4 ° C.
    3. Coloque varios tubos de microcentrífuga de diferentes tamaños (1,5 ml, 15 ml) y un homogeneizador en hielo.
    4. Preparar 10 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) y mantenerse en hielo. Justo antes de usar el tampón, añadir 10 l de DTT 1 M y una tableta triturada de inhibidores de proteasa libre de EDTA.
  2. Preparación de perlas de anticuerpo ligado
    NOTA: Las perlas recubiertas de anticuerpos se pueden preparar hasta una semana de antelación y guardar en la nevera hasta que se necesite. Proteína G tiene mayor afinidad que la proteína A para la mayoría de las especies de inmunoglobulina subtipos, a excepción de IgG de conejo, para los que la proteína A tiene una afinidad más alta.
    1. Lavar 50 l de perlas magnéticas recubiertas con Proteína G: Transferencia 50 y# 956; L de suspensión de perlas a un tubo de microcentrífuga, se coloca el tubo en el imán para recoger las perlas en el lado del tubo y eliminar el líquido. Resuspender las perlas en 0,5 ml de PBS-0,01% de Tween-20.
    2. Colocar el tubo en el imán para recoger las perlas en el lado del tubo y eliminar el líquido. Resuspender las perlas en 40! L de PBS-0,01% de Tween-20. Añadir 10 g (10! L de 1 mg / ml de solución madre) de anticuerpo anti-FLAG M2. Incubar con rotación durante 20 min a temperatura ambiente.
    3. Colocar el tubo en el imán para recoger las perlas en el lado del tubo y eliminar el líquido. Lavar las perlas con 0,5 ml de PBS-0,01% de Tween-20.
    4. Para la reticulación del anticuerpo a las perlas, lavar las perlas dos veces con 1 ml de 0,2 M trietanolamina pH 8,2. Entonces, resuspender las perlas en 1 ml de DMP 20 mM (pimelimidato de dimetilo) en M trietanolamina pH 8,2 0,2 ​​(solución DMP debe estar preparado fresco inmediatamente antes de su uso). Incubar con rotación a temperatura ambiente durante 30 min.
      5. Se coloca el tubo en el imán. Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 0,5 ml de Tris-HCl 50 pH 7,5. Incubar con rotación a temperatura ambiente durante 15 min.
  3. Lavar las perlas 3 veces con 0,5 ml de PBS-0,1% de Tween-20. Deja cuentas en el último lavado hasta que se necesite.
  • purificación por afinidad basada en FLAG
    NOTA: Tenga cuidado de no dejar los talones sin necesidad de búfer durante un largo periodo de tiempo. Todos los tampones y los tubos deben mantenerse en hielo en todo momento. El siguiente protocolo se ha optimizado para la purificación de complejos de proteínas de 2-5 x 10 8 células (10-20 mg de proteína de lisado) que expresa niveles endógenos de una proteína marcada con FLAG 20.
    1. Descongelar el pellet de células en un baño de agua a 37 ° C hasta que empieza a derretirse. Tome el tubo fuera de la bañera, se agita suavemente hasta que el sedimento se descongeló completamente, e inmediatamente colocar el tubo que contiene la suspensión de células en hielo.
    2. Añadir 5 ml de tampón de lisis enfriado en hielo(Que contenía DTT e inhibidores de proteasa) a la suspensión de células y agitar para mezclar. Incubar en hielo durante 10 min.
    3. Transferir el lisado a un homogeneizador Dounce frío. Lisan con 20-30 golpes utilizando la mano del mortero apretado (hasta que no haya viscosidad apreciable). Transferir el homogeneizado a tubos de microcentrífuga fríos.
    4. Centrifugar a 18.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
    5. Transferir el lisado aclarado a un tubo frío limpio. Deja 50 l de lisado atrás. Tomar una parte alícuota de 35 l de lisado para medir la concentración de proteína y monitorear la purificación.
    6. Retire el PBS-0,1% de Tween-20 a partir de las perlas. Resuspender las perlas con 1 ml de lisado y mezclar con el resto del lisado. Incubar la mezcla en una rueda giratoria a 4 ° C durante 1-2 h.
    7. Recoger las perlas en el lado del tubo con el imán. Se recoge una alícuota de 30! L de sobrenadante y desechar el resto del sobrenadante. Resuspender las perlas en 0,5 ml de IPP150 tampón (mM Tris-HCl 10 pH 8, 15NaCl 0 mM, 1 mM de EDTA, 0,1% NP-40) pipeteando 4-6 veces. Transferir a un tubo frío de 1,5 ml.
    8. Repetir los lavados con 0,5 ml de tampón IPP150 dos veces más.
    9. Lavado de perlas de tres veces con 0,5 ml de tampón de elución nativo FLAG (20 mM Bis-Tris pH 7, NaCl 20 mM, 0,02% de Nonidet P-40, EDTA 1 mM, ácido 200 mM ε-aminocaproico). Con el último lavado, la transferencia de las perlas a un nuevo tubo frío. Eliminar el tampón a fondo.
    10. Resuspender las perlas en 100! L de 200 mg / péptido FLAG ml 3x en tampón de elución nativo. Se incuba a 4 ° C durante 10 minutos con rotación suave.
    11. Recoger las perlas con el imán y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo frío.
    12. Repita los pasos 1.3.10-1.3.11 dos veces. En común todos los eluidos.
    13. Se concentra el eluato hasta 25 l en una unidad de filtro centrífugo (10 kDa límite de peso molecular nominal de corte, PES) por centrifugación a 10.000 xg a 4 ° C. Transferir el eluato se concentró a un nuevo tubo frío y añadir 50% glycerol para una concentración final de 5%. El eluato se concentró puede mantenerse a 4 ° C durante la noche si es necesario.

    • 2. Azul nativo PÁGINA

    1. Preparativos
      1. Preparar 1 litro de 1x PAGE natural ánodo Buffer, 1x PAGE natural oscuro Azul cátodo y búfer 1x PAGE natural Light Blue Buffer cátodo.
      2. Retire el peine de un gel PAGE nativa prefabricado 3-12% y lavar los pocillos dos veces con 1x PAGE nativa oscuro Azul Cátodo Buffer. Llenar los pocillos con 1x PAGE natural oscuro Azul cátodo Buffer. Configurar el gel en el tanque en funcionamiento pero no agregue azul oscuro cátodo Buffer al cátodo cámara (en el interior).
    2. corrida electroforética
      1. Preparar la muestra: Para los 25 l concentrados eluato añadir volumen apropiado de tampón de carga de muestra nativo 4x y de 0,5% G-250 aditivo muestra para concentraciones finales de 1x y 0,005%, respectivamente.
      2. Cargar la muestra y los marcadores de peso molecular nativas dejando un pozo vacío between ellos. Carga 10-20 l de tampón de carga de muestra 1x nativa en todos los pocillos vacíos.
      3. Llenar la cámara catódica (en el interior) con 200 ml de 1x PAGE natural oscuro Azul cátodo Buffer con cuidado para no molestar a las muestras. Llenar la cámara de ánodo (exterior) con 550 ml de 1x PAGE nativa Ánodo Buffer.
      4. Ejecutar el gel a 150 V durante 30 min. Detener la ejecución, eliminar el azul oscuro del cátodo Buffer con una pipeta serológica y reemplazar con 1x Buffer luz azul cátodo. Continuar la carrera por 60 min. El gel se puede ejecutar a temperatura ambiente o a 4 ° C; la temperatura puede tener un efecto sobre la estructura compleja de proteínas.
    3. tinción de gel
      1. Abra la casete de gel y descartar una de las placas de cassette. El gel permanece unida a la otra placa de cassette. Transferir el gel en una bandeja o receptáculo que contiene suficiente solución de fijación (metanol al 40%, 2% de ácido acético) para cubrir el gel y se incuba durante 30 min con agitación suave.
      2. Retire el fijador solutiones y añadir agua suficiente para cubrir el gel. El gel se puede escanear para referencia futura.

    Análisis 3. Espectrometría de Masas

    Nota: Todas las etapas posteriores se deben realizar en una campana de flujo laminar, si es posible para asegurar la limpieza de las muestras. Todas las soluciones deben ser preparados con agua de grado HPLC. Discutir este protocolo con el laboratorio de espectrometría de masas que llevará a cabo el análisis.

    1. Preparativos
      1. Colocar una placa de 96 pocillos de fondo cónico en la parte superior de otra placa de 96 pocillos para recoger los residuos. Pierce la parte inferior de los pocillos de la placa de 96 pocillos de fondo cónico con una aguja 21 G.
      2. Lavar los pocillos de la placa de 96 pocillos perforado.
        1. Añadir 200! L de ácido fórmico al 50% de acetonitrilo-0,25% a los pocillos de la placa perforada. Incubar la pila de placas en un agitador durante 10 min.
        2. Centrifugar a 500 xg durante 1 min para que el líquido fluye a través de los agujeros en la placa de recogida de residuos. Desechar el wlíquido aste.
        3. Repita los pasos 3.1.2.1-3.1.2.2 dos veces más.
        4. Rellena los pocillos de la placa de 96 pocillos perforado con 150 l de bicarbonato de amonio 50 mM (recién hecho).
      3. Lavar los pocillos de una filtración centrífuga placa de 96 pocillos.
        1. Colocar una placa normal de 96 pocillos debajo de la placa de filtración centrífuga para recoger los residuos. Añadir 200! L de ácido fórmico al 50% de acetonitrilo-0,25% a cada pocillo de la placa de filtración centrífuga.
        2. Centrifugar la pila de placas a 200 xg durante 1 min. Desechar los residuos.
        3. Repita los pasos 3.1.3.1-3.1.3.2 dos veces más.
    2. la escisión en gel y en la digestión-gel
      NOTA: Mientras ablación del gel, identificar y hacer una nota de la sección de gel alineados a cada uno de los patrones de proteínas. Los patrones de proteína se pueden utilizar para estimar los pesos moleculares aproximados para todos los cortes de gel.
      1. Colocar el gel con la placa de vidrio sobre una superficie limpia. Cortar el carril contieneing la muestra en 48 rodajas idénticas (1,5 mm x 5 mm). Cortar cada rebanada en 2-3 trozos más pequeños (excepto los últimos cinco rebanadas en la parte superior del gel) y colocar cada rebanada secuencialmente en un pocillo de la perforado y se lavó la placa de 96 pocillos.
      2. Añadir 50 l de acetonitrilo a cada pocillo. Se incuba la placa con agitación durante 30-60 min. Retirar el líquido por centrifugación como en el paso 3.1.2.2.
      3. Añadir 200! L de TCEP 2 mM en bicarbonato de amonio 50 mM a cada pocillo. Se incuba la placa con agitación durante 30 min a temperatura ambiente. Retirar el líquido por centrifugación como en el paso 3.1.2.2.
      4. Añadir 200! L de 4 mM yodoacetamida en 50 mM de bicarbonato de amonio a cada pocillo. Se incuba la placa con agitación durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. Retirar el líquido por centrifugación como en el paso 3.1.2.2.
      5. Añadir 150! L de bicarbonato de amonio 50 mM más 50 l de acetonitrilo y se incuba la placa con agitación durante 30 min a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado unas muchas veces como sea necesario hasta que todo el color azul se retira de las piezas de gel.
      6. Deshidratar las piezas de gel mediante la adición de 200 l de acetonitrilo puro y se incuba con agitación a temperatura ambiente durante 20 min hasta que las piezas de gel son de color blanco y opaco. Eliminar el acetonitrilo.
      7. Añadir 150! L de 0,001 mg / ml de tripsina (grado de secuenciación) en bicarbonato de amonio 50 mM frío a cada pocillo. Se incuba la placa con agitación a 37 ° C durante 2 h. Después de 1 h, comprobar que las piezas de gel se cubren con el líquido; si este no es el caso, añadir otro 50-100 l de bicarbonato de amonio 50 mM. Después de 2 h a 37 ° C, continuar la digestión a 25 ° C durante la noche.
      8. Colocar una placa de fondo cónico limpia debajo de la placa que contiene el gel, lo que garantiza la correcta orientación de las placas. Recoger el líquido que contiene los péptidos por centrifugación a 200 xg durante 1 min.
      9. Coloque la placa de péptidos que contienen en un evaporador de centrífuga y se evapora el líquido mientras se realizaba tque el próximo paso.
      10. Añadir 150! L de ácido fórmico al 50% de acetonitrilo-0,25% a las piezas de gel. Incubar con agitación a 37 ° C durante 30 min.
      11. Recoger el líquido en la placa parcialmente seco de la etapa 3.2.9 por centrifugación a 200 xg durante 1 min. Continuar la evaporación de la placa de péptidos que contienen durante la realización de la siguiente etapa.
      12. Repita los pasos 3.2.10-3.2.11.
      13. Añadir 200? L de acetonitrilo puro a cada pocillo de la placa que contiene las piezas de gel. Incubar con agitación a temperatura ambiente durante 15 min.
      14. Recoger el líquido en la placa de péptidos que contienen por centrifugación a 200 xg durante 1 min.
      15. Asegúrese de que la concentración final de acetonitrilo en todos los pozos es superior al 55%. Si es necesario, añadir acetonitrilo puro extra.
      16. Transferencia de las soluciones de péptidos a la placa de filtración centrífuga se lavó. Colocar una placa de fondo cónico limpia por debajo de ella para recoger los péptidos. Centrifugar la pila de placas a 200 xg durante 1 min.
      17. evaporcomió el líquido en la placa de fondo cónico hasta que los pozos estén completamente secas. La placa puede ser cubierto con una tapa de silicona y se almacenó a -20 ° C en esta etapa.
      18. Re-disolver péptidos en 32 l de ácido fórmico al 0,5% con agitación vigorosa durante 15 min. Añadir 8 l de bicarbonato de amonio 400 mM y se incuba con agitación vigorosa durante 15 min. Centrifugar la placa a 200 xg durante 1 min. Cubrir con una tapa de silicona y almacenar la placa a -20 ° C hasta que el análisis de espectrometría de masas.
    3. Espectrometría de masas
      NOTA: Analizar los péptidos en un espectrómetro de masas de alta resolución utilizando métodos compatibles con la proteómica escopeta. adquisición dependiente de datos es el LC-tándem más utilizada MS puesta a punto para este tipo de análisis y debe ser optimizada para la identificación de péptidos eficiente, minimizando secuenciación redundante y selección de candidatos sobre el ruido de fondo. Los espectros de masas en la exploración análisis de masas primera etapa (MS1) debe ser registrada en el modo de perfil. Es recomiendaed para seleccionar preferentemente iones con carga doble y triplemente para análisis de masas etapa segunda (MS2). Un rango de masas de m / z 400-1,600 es adecuado para identificar la mayoría de los péptidos entre 8-30 gama aminoácidos. Aquí, se proporciona un protocolo para el análisis utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap.
      1. Inyectar 20 l de muestra por análisis utilizando el muestreador automático de un sistema de nanoLC-MS / MS. Desalar y concentrar los péptidos en una columna de fase inversa C18 (100 m Identificación, 2 cm).
      2. péptidos separados sobre una columna C18 analítica (75 micras ID, 15 cm) utilizando un gradiente lineal de 30 min de ácido fórmico 4-28% de acetonitrilo / 0,1% a 300 nL / min.
      3. Analizar los péptidos en un espectrómetro de masas con un método de adquisición 10 depende de los datos de arriba con los siguientes parámetros: m / z gama 380-1,600, resolución de 30.000 a m / z 400, ancho de aislamiento de 2 Th, la exclusión dinámica a ± 10 ppm durante 45 s , objetivo de control automático de ganancia a 1 x 10 6 para MS y 5000 para MS / MS, el tiempo de inyección máxima de 150 ms para la EM y100 ms para MS / MS.

    Análisis 4. Datos

    1. Identificación de proteínas y cuantificación usando MaxQuant
      1. Utilice el software MaxQuant libremente disponibles para identificar y cuantificar las proteínas en cada fracción de gel a partir de los datos en bruto de espectrometría de masas.
        NOTA: MaxQuant trabaja en los datos generados por la proteómica enfoques escopeta de adquisición de datos dependiente. Los datos de EM de la Blue fracciones gel nativo deben ser analizados en lote como experimentos separados y no como fracciones de un experimento que combina todos los cortes de gel. Marque la casilla valor iBAQ para realizar cálculos estequiométricos. Los protocolos detallados para la búsqueda de base de datos y la proteína cuantificación usando MaxQuant se describen en 21, 22.
    2. Análisis del perfil de proteína usando Perseo
      1. Utilice el software de libre disposición Perseo para mostrar los perfiles de migración de las proteínas identificadas y compararlas utilizandoanálisis estadístico.
        NOTA: Documentación general sobre el uso de Perseo está disponible en http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Una muestra de datos está disponible como datos complementarios.
      2. Subir el archivo proteingroups.txt devuelto por el análisis MaxQuant que contiene las identificaciones de proteína y los valores de cuantificación para todas las fracciones de gel. Rellenar los valores de intensidad en la caja principal (Figura 1). Aparecerá una matriz que contiene todas las identificaciones de proteína en filas, con las fracciones de gel como columnas.
      3. Eliminar entradas correspondientes a los accesos inversa, proteínas únicamente se han identificado por sitio y posibles contaminantes mediante la selección de filas filtro basado en la columna categórica en el menú desplegable filas de filtro (Figura 2).
      4. Normalizar las intensidades fracción de cada proteína a través del perfil frente a la intensidad total de proteínas mediante la selección de Divide en el menú desplegable Normalizar, entonces Sum (Figura 3). Un nuevo maparece Atrix.
      5. Visualizar las parcelas perfil de migración de todas las proteínas mediante la selección de perfil Parcela en el menú de visualización desplegable (Figura 4).
      6. Seleccionar filas filtro basado en valores válidos en el menú desplegable filas filtro. Introduzca 1 en el número de valores válidos requeridos.
      7. Realizar agrupación jerárquica de las proteínas identificadas a través de todas las fracciones de gel nativos azules seleccionando agrupación jerárquica en el menú desplegable Clustering / PCA. Desactive la casilla Columnas árbol (Figura 5). Los racimos se visualizan en un mapa de calor en la pestaña Clustering al lado de la matriz (Figura 6).
      8. Busque el clúster que contiene la proteína de cebo en el dendrograma. Otros componentes de la agrupación representan proteínas co-migran con el cebo y, por tanto, son posibles proteínas que interactúan / subunidades del mismo complejo.

    figure-protocol-1 r /> Figura 1. Captura de Perseo ventana de carga de datos. La figura muestra las etapas para la carga de la identificación de proteínas y datos de cuantificación en Perseo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figure-protocol-2
    Figura 2. Captura de pantalla de ventana de Perseus para el filtrado de las entradas correspondientes a los contaminantes, los accesos y las proteínas identificadas por sitio revertir. Selección de filas de filtro de columna categórica abre una nueva ventana para seleccionar los tipos de entradas de proteínas a ser eliminado del conjunto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Figura 3. Imagen de pantalla de ventana normalización Perseo. Divide la selección en el menú de Normalización abre una nueva ventana, con diferentes opciones. Selección de Sum divide el valor de intensidad de una proteína en cada fracción por la intensidad total de esa proteína a través de todas las fracciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Figura 4. Captura de Perseus que muestra gráficos de perfil de migración. Las proteínas se pueden seleccionar en la matriz por debajo de los perfiles para resaltar su perfil correspondiente. La barra de herramientas se puede utilizar para editar y exportar los perfiles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


    Figura 5. Imagen de Perseo ventana agrupación jerárquica. La figura muestra la configuración de la agrupación jerárquica de proteínas usando Manhattan (L1) distancia métrica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Figura 6. Imagen de pantalla de Perseus que muestra dendrograma y las intensidades de proteínas heatmap. El flujo de trabajo en el lado derecho del panel principal muestra cada paso llevado a cabo y la matriz resultante, y se puede utilizar para deshacer cualquier paso. El flujo de trabajo también puede bifurcarse de cualquier matriz intermedia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    1. Cálculo de la estequiometría relativa
      1. Seleccionar las subunidades de un complejo de proteínas en función de su co-agrupación con la proteína cebo y delimitar el pico (s) perfil en el que aparecen.
      2. Utilice los valores iBAQ devueltos por análisis MaxQuant para cada subunidad en cada fracción por separado y normalizar por el valor iBAQ cebo correspondiente en esa fracción.
      3. Representar gráficamente los iBAQs normalizados para el cebo y la proteína subunidades complejos a través de las fracciones de pico seleccionado y aplicar regresión lineal. Calcular la cantidad relativa de la subunidad complejo de cebo mediante la comparación de las tendencias de sus valores iBAQ normalizados.
    2. Estimación de proteína tamaño complejo
      1. Usa los estándares de proteína para calcular los pesos moleculares predichos de los azules alineación de cortes de gel nativas del carril de la muestra. De estos, generar un modelo de regresión lineal mediante el trazado de las porciones de gel en el eje x y pesos moleculares en el eje y.
        2. Utilizar el modelo para estimar el rango de peso molecular observado de la proteína compleja (es), basado en la rebanada nativo azul (s) de la que fueron identificados.

    Resultados

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    El flujo de trabajo de la purificación por afinidad azul perfiles de proteínas de correlación nativo por espectrometría de masas (ABC-MS) estrategia se representa en la Figura 7. complejos de proteína nativa alrededor de una proteína de interés se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando anticuerpos contra un epítopo etiqueta (en este caso FLAG) y la elución competitiva. Los complejos se resolvieron por BN-PAGE, y todo el carril de gel se corta en 48 secciones, y se prepararon para la escopeta LC-MS / MS. La información cuantitativa MS se utiliza para generar un perfil de migración para cada proteína identificada a través de la separación nativa azul. Las proteínas que interactúan para formar una presentación compleja distintos perfiles de migración similares con picos superponibles. Cuando una proteína de interés toma parte en más de un montaje, múltiples picos se observan en su perfil de migración, dadas las sub-complejos están dentro del poder de resolución del gel nativo azul. Una comparación sistemática de los MiGperfiles de racionamiento pueden lograrse por correlación proteína de perfiles utilizando la agrupación jerárquica. El dendrograma y las intensidades de pico para todas las fracciones se visualizan en un mapa de calor, facilitando la identificación de proteínas que interactúan que pertenecen a los complejos de proteínas distintas (Figura 8).

    Se utilizó esta estrategia para analizar los socios que interactúan de MTA2, una subunidad central de la cromatina NuRD remodelación compleja 20. Como se muestra en la Figura 9, el perfil de migración de MTA2 muestra dos picos de intensidades distintas entre 700 kDa y 1,2 MDa, con el pico de masa inferior presentan mayor abundancia. Otras subunidades de núcleo NuRD, incluyendo MTA1 / 3, HDAC1 / 2 y Mbd3, mostraron patrón de separación idéntica, aunque los picos para algunas de las subunidades, a saber CHD4, Gatad2a / b y rbbp4 / 7, tenían la distribución abundancia inversa (Figura 9A, B). En contraste, el perfil de Cdk2ap1, un factor regulador que recluta el complejo NuRD a promotores de genes Wnt 23, sólo se muestra el mayor pico de masa (Figura 9C), y lo mismo hizo Sall4, un represor transcripcional que también se ha demostrado que se unen NuRD 20, 24, 25. Por lo tanto, el fraccionamiento de las proteínas MTA2 asociada purificados por afinidad mediante PAGE nativa azul fue capaz de resolver dos formas diferentes del complejo NuRD.

    ABC-MS también permite la identificación de nuevos interactores mientras asignándolos a entidades proteína particular. A través del examen de los grupos de proteínas e intensidades fracción representada en un mapa de calor se detectó una fuerte correlación entre subunidades NuRD y WDR5, una subunidad reguladora del complejo metiltransferasa MLL 26, con WDR5 que muestran dos picos de migración coincidentes con los dos NuRD pEaks (Figura 8), sugiriendo una nueva interacción entre WDR5 y NuRD. Se confirmó esta interacción por la co-inmunoprecipitación y co-migración en la cromatografía de exclusión por tamaño 20.

    La elección del cálculo de la métrica de distancia en la agrupación jerárquica influirá en la forma de los clusters y por lo tanto las correlaciones. Recomendamos experimentar con las diferentes métricas para lograr el mejor ajuste con el conocimiento existente interacción de la proteína o complejo de interés. Generalmente hemos conseguido los mejores resultados con la distancia métrica Manhattan (L1) 20. Correlación de Pearson o métricas de distancia euclidiana también se han reportado para la identificación de complejos basados en técnicas de fraccionamiento alternativo 10, 11, 12.

    el Quandatos cuanti- MS obtenidos a partir de las fracciones nativos azules también se pueden utilizar para determinar la estequiometría de los complejos de proteínas. El valor (cuantificación absoluta basada intensidad) iBAQ proporciona una medida de la abundancia relativa de las proteínas identificadas 27, 28. Los valores iBAQ para los miembros del complejo de proteínas en todas las fracciones dentro de un pico perfil de migración se normalizan a la de la proteína cebo para obtener cantidades relativas. Los iBAQs normalizados a través de un pico de perfil para un miembro de complejo proteína dada deben seguir una tendencia horizontal, y los valores de tendencia reflejar la estequiometría de las proteínas que interactúan con relación a la proteína de cebo. Para una representación más detallada de los cálculos de estequiometría, ver 20.

    figure-results-1
    Figura 7: flujo de trabajo que resume esquemática el ABC-MS sESTRATEGIA. Esta cifra se modificó a partir de 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figure-results-2
    Figura 8. La agrupación jerárquica de los perfiles de migración BN-PAGE de interactores MTA2. proteínas MTA2 asociada se agruparon sobre la base de la similitud de sus perfiles de migración. Sólo se muestra un subconjunto de la mapa de calor que contiene el complejo NuRD (encerrado en la caja azul). El cuadro amarillo destaca la fuerte correlación de WDR5 con el complejo NuRD. Los pesos moleculares anotados se estimaron a partir de las distancias de migración de los patrones de proteína se ejecutan en el mismo gel. Esta investigación fue publicado originalmente en Molecular y Cellular Proteomics 20 la Sociedad Americana de Bioquímica y Mo Biología lecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figure-results-3
    Figura 9. perfil de migración BN-PAGE de subunidades NuRD y proteínas asociadas. A) MTA2 y NuRD subunidades presentes en un patrón de intensidad similar. B) MTA2 y NuRD subunidades con el patrón de intensidad inversa. C) MTA2 y cdk2ap1, que está presente sólo en la mayor entidad NuRD peso molecular. Los pesos moleculares anotados se estimaron a partir del perfil de migración de los patrones de proteína. Esta investigación fue publicado originalmente en Molecular y Cellular Proteomics 20 la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular._blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figure-results-4
    Datos suplementarios: conjunto de datos de muestra. MaxQuant derivado de archivo proteingroups.txt que contiene la identificación de proteínas y los valores de cuantificación de un experimento ABC-MS. Esta investigación fue publicado originalmente en Molecular y Cellular Proteomics 20 la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Haga clic aquí para descargar este archivo.

    Discusión

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    A continuación, describimos el uso de purificación por afinidad seguido de electroforesis en gel nativo azul en combinación con espectrometría de masas cuantitativa para resolver los complejos de proteínas. Este enfoque ofrece un método para desentrañar listas de interacción de proteínas unidimensionales en conjuntos de proteínas funcionales.

    Demostramos el método basado en el uso de proteínas etiquetadas con epítopo. Sin embargo, si una línea celular que expresa una proteína etiquetada no está disponible, una alternativa podría ser el uso de anticuerpos contra la proteína de interés, siempre que haya un péptido disponible para lograr elución competitiva nativo. podría tener que ser modificada en función del nivel de expresión de la proteína diana La cantidad de material y la cantidad de granos de partida. Típicamente Realizamos este protocolo con 2-5 x 10 8 células material de partida, y esto es suficiente incluso para las proteínas con bajo nivel de expresión. La composición de tampón de lisis debe ser elegido empíricamente para lograrcerca para completar la solubilización del cebo. Esto podría ser un reto para algunos tipos de proteínas, en particular, la unión de la cromatina o proteínas de membrana. Las opciones alternativas incluyen el aumento de la cantidad de sal, siempre que el complejo de la proteína en estudio es estable en alta sal, o el uso de sonicación y / o tratamiento de nucleasa para proteínas de unión a la cromatina 20, 29. En el caso de proteínas de membrana, el cambio de detergente a DDM o digitonina puede ser aconsejable 30. En el caso de las proteínas de unión a ADN, es útil incluir una nucleasa tal como Benzonase durante la etapa de purificación 20. La eliminación completa de los ácidos nucleicos asegura que las interacciones detectadas se producen entre las proteínas y no están mediadas por ADN.

    Un elemento crítico a considerar cuando se utiliza este enfoque es la estabilidad del complejo bajo investigación. El procedimiento es largo y puede implicar preserving la proteína durante la noche complejo. Hemos logrado un buen éxito con dos complejos de remodelación de la cromatina (D. Bode y M. Pardo, datos no mostrados), pero esto debe ser evaluado. La etapa de purificación por afinidad se puede acortar si es necesario.

    Las técnicas alternativas que permiten fraccionamiento nativa, tales como cromatografía de exclusión de tamaño, se han utilizado ampliamente desde hace más de 50 años para caracterizar los complejos de proteínas. Nosotros y otros han demostrado que la resolución de PAGE nativa azul es superior a la conseguida usando la cromatografía de exclusión de tamaño 20, 31, 32, 33. Otra ventaja de PAGE natural azul es que no requiere sistemas de cromatografía, que son caros, sino que utiliza las proteínas equipos de electroforesis que está muy extendida en los laboratorios. En cuanto a la práctica en el tiempo, este método no implica más trabajo que el tradicional GELC-MS / MS de unanfoque o fuera de línea de cromatografía de fraccionamiento. Sin embargo, como la mayoría de las técnicas de fraccionamiento hacen, que tiene un límite a su resolución. Complejos que son muy homogéneos o cerca de la masa y la forma puede estar más allá de la resolución ofrecida por PAGE nativa azul, y por lo tanto el protocolo como se informó aquí no se universalmente éxito en la resolución de complejos con distintas subunidades compartidas. Alentador, hemos tenido éxito en la separación de dos complejos tetrámeros muy similares que comparten tres subunidades (M. Pardo, manuscrito en preparación).

    Desde la espectrometría de masas se ha convertido cada vez más sensible, incluso pequeñas cantidades de interactores y contaminantes no específicos pueden ser detectados en muestras AP-EM. El enfoque presentado aquí podría ayudar en la discriminación de los interactores reales de contaminación de fondo en la purificación por afinidad, centrándose la atención en las proteínas con picos de migración que coinciden con los picos de migración cebo en peso molecular mayor que el delas proteínas monoméricas.

    Varios grupos han utilizado técnicas de fraccionamiento seguido de proteína de perfiles de correlación para delinear los complejos de proteínas a escala celular sin la necesidad de aislamiento anterior 10, 11, 12, 34. Sin embargo, esto puede resultar en una falla para detectar interacciones sub-estequiométrica. La incorporación de una etapa de enriquecimiento a través de la purificación por afinidad puede ayudar a superar esto. El enfoque descrito aquí debe ser generalmente útiles para la exploración de la topología de complejos de proteínas y desentrañar los múltiples complejos de una proteína dada toma parte en dentro del mismo contexto celular. La estrategia es simple y susceptible a los laboratorios que pueden no tener el equipo de fraccionamiento cromatográfico caro para resolver los complejos de proteínas.

    Divulgaciones

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    Los autores no tienen nada que revelar.

    Agradecimientos

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    Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust (WT098051).

    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    Proteína G DynabeadsLife Technologies10003D
    FLAG anticuerpo M2Sigma-AldrichF1804
    Tween-20, grado proteico, solución al 10%Millipore655206
    DimetilpilimidatoSigma-Aldrich80490
    0,2 M Tampón de trietanolamina, pH 8,2Sigma-AldrichT0449
    3x Péptido FLAGSigma-AldrichF4799
    Vivaspin 5K NMWCO, PESSartoriusVS0112
    NativePAGE 3-12% Bis-Tris gelLife TechnologiesBN1001
    20x NativePAGE Running BufferLife TechnologiesBN2001
    20x NativePAGE Aditivo de cátodoLife TechnologiesBN2002
    4x Búfer de carga de muestras NativePAGELife TechnologiesBN2003
    NativeMARKLife TechnologiesLC0725
    NativePAGE 5% G-250 aditivo de muestra Life TechnologiesBN2004
    Nunc placa de 96 pocillos con fondo cónico, polipropilenoThermo249944
    Multiscreen HTS Sistema de filtración de 96 pocillosThermoMSDVN6550
    Nunc Tapón de 96 pocillos naturalThermo276002
    TCEP (Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina)Sigma-Aldrich646547
    YodoacetamidaSigma-AldrichI1149
    Acetonitrilo, grado HPLCFisher ScientificA/0627/17
    Tripsina, grado de secuenciaciónRoche11418475001
    MaxQuant (software)N.A.N.D.http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
    Perseo (software)N.A.N.D.http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus

    Referencias

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