Evaluación de la Alternancia Espontánea, el Reconocimiento de Objetos Novelos y la Clasificación de Miembros en Modelos de Ratón Transgénico de la Neuropatología Amiloide-β y Tau

Resumen

Se describe aquí un enfoque de detección de comportamiento escalonado que puede usarse para detectar compuestos que exhiben eficacia in vivo en comportamientos motores cognitivos y funcionales en modelos de ratón transgénicos de beta - amiloidosis y tauopatía. Estos métodos se optimizan para examinar los compuestos para la actividad en tareas de memoria de trabajo y de corto plazo.

Resumen

Aquí se describe un método de prueba de comportamiento escalonado que se puede utilizar para la detección de compuestos que muestran eficacia in vivo en los comportamientos motores cognitivos y funcionales en modelos de ratones transgénicos de β-amiloidosis y tauopatía. El paradigma incluye pruebas para la alternancia espontánea en un laberinto en Y, un nuevo reconocimiento de objetos y un agarre de miembros. Estas pruebas fueron seleccionadas porque: 1) interrogan la función de los dominios cognitivos o motores y los circuitos neuronales correlativos relevantes para el estado de la enfermedad humana, 2) tienen puntos finales claramente definidos, 3) tienen control de calidad fácilmente implementable, 4) pueden ser ejecutados en Un formato de rendimiento moderado, y 5) requieren poca intervención del investigador. Estos métodos están diseñados para los investigadores que buscan examinar compuestos para la actividad en tareas de memoria a corto plazo y de trabajo, o comportamientos motores funcionales asociados con los modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer. Los métodos descritos aquí utilizan pruebas de comportamiento que engEdad una serie de diferentes regiones del cerebro, incluyendo el hipocampo y varias áreas corticales. Los investigadores que desean pruebas cognitivas que evalúan específicamente la cognición mediada por una sola región del cerebro podrían usar estas técnicas para complementar otras pruebas de comportamiento.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo que resulta en debilitante deterioro cognitivo que afecta a aproximadamente 44 millones de personas en todo el mundo. Actualmente no existen tratamientos disponibles para la EA que sean modificadores de la enfermedad, haciendo hincapié en la necesidad urgente de descubrir preclínicamente nuevas estrategias terapéuticas para esta enfermedad. Se han creado varios modelos de ratones transgénicos diferentes que recapitulan varios aspectos de AD ^{1 , 2} , incluyendo déficit en dominios cognitivos alterados en pacientes ³ . Estos modelos de ratón representan una herramienta útil para facilitar la selección eficiente in vivo .

Cuando se evalúa un compuesto para la eficacia potencial in vivo , se debe tomar un enfoque escalonado que analiza la eficacia en dominios cognitivos apropiados y también monitorea comportamientos que podrían influir en los puntos finales específicosSsess cognición. Muchos modelos de ratones transgénicos de AD exhiben hiperactividad y otros comportamientos que pueden interferir con una determinada prueba cognitiva, y prohibir su uso en la detección de drogas ⁴ . Además, para que un enfoque se implemente en un entorno de detección de fármacos, las pruebas particulares utilizadas deben mantener al menos un rendimiento moderado, tener puntos finales claramente definidos y un procedimiento que requiere una intervención mínima de los investigadores. Utilizando estos criterios, se pueden implementar pantallas de comportamiento que exhiben la reproducibilidad, la baja varianza intra e inter-ensayo y los tamaños de efecto necesarios para el cribado compuesto. Detallado aquí son los métodos que hemos empleado para la detección de compuestos eficaces en la mitigación de los fenotipos cognitivos y motores presentes en los modelos de ratones transgénicos de β-amiloidosis y tauopatía [ ^{5 , 6]} . Los métodos descritos se adaptan de los paradigmas de comportamiento comúnmente usadosIteratura ⁷ , con optimizaciones específicas y controles de control de calidad para que puedan ser utilizados en modelos de ratones transgénicos relevantes para AD. Este protocolo puede usarse con una variedad de sistemas de adquisición y análisis de datos y asume que el investigador tiene un conocimiento práctico del software asociado.

Protocolo

Los métodos detallados en esta publicación fueron revisados ​​por el comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) en Hilltop Laboratory Animals para asegurar el cuidado apropiado, el uso y el trato humano de los animales de acuerdo con las leyes y regulaciones federales, estatales y locales aplicables. Como los Reglamentos federales sobre bienestar de los animales, o AWRs (CFR 1985), y la Política de Servicios de Salud Pública sobre Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio, o PHS Policy (PHS 1996).

1. Directrices generales para toda evaluación conductual

1. Antes de cualquier manipulación de animales, cubra las tarjetas de jaula existentes con una nueva tarjeta de jaula que indique solamente el identificador de animal único, cegado.
   NOTA: Los investigadores que manejan ratones durante la dosis rutinaria de compuesto / placebo no están autorizados a manejar ratones para la evaluación del comportamiento.
2. Dim o apagar las luces de arriba y ajustar la iluminación de tal manera que la iluminación en el piso de la arena o el laberinto es 30-35 lux.
3. FO estudios que abarcan varias semanas, registrar el peso corporal semanalmente como una medida indirecta de la salud en general.
   NOTA: Se pueden incluir controles adicionales de la jaula para la calidad de la capa, la postura, la marcha y la locomoción espontánea si se justifican controles médicos más sólidos.

2. Habituación de los ratones a la manipulación por los investigadores

1. Dos días antes de cualquier prueba de comportamiento, habituar a los ratones a la manipulación. Retire la jaula del estante de la jaula y colóquela sobre una superficie nivelada.
2. Retire la tapa de la jaula. Maneje el ratón exactamente como sería manejado durante la ejecución de la próxima prueba de comportamiento. Coloque el ratón en una mano ahuecada por encima de la jaula de casa.
3. Mida la latencia para saltar de la mano del investigador de nuevo a la jaula de casa. Mantenga los ratones durante un máximo de 5 s.
   NOTA: Los ratones que exhiben latencias de ≥ 2 s se consideran "habituados". Los ratones que exhiben latencias <2 s durante el primer ensayo sufren 2 habituatio adicionalesN sesiones ese día.
4. Haga que los ratones se sometan a 2 días consecutivos de manejo habituación. Anote cualquier ratón que no esté habituado al final del ^segundo día.

3. Evaluación de la memoria de trabajo espacial midiendo la alternancia espontánea en un laberinto en Y ⁸

1. Antes del uso inicial, limpie completamente el laberinto en Y con una toallita germicida no blanqueada, 70% de EtOH, seguida de dH2O9. Designe claramente los brazos del laberinto como "A", "B" y "C" u otros identificadores únicos comparables.
2. Antes del inicio de una sesión de pruebas, configure el sistema de adquisición de datos o cámaras de video y configure el seguimiento adecuado de los ratones en el laberinto. Calibre la distancia en el laberinto usando imágenes de video capturadas de una regla u otro objeto de longitud conocida.
   NOTA: Los métodos de comportamiento en este procedimiento trabajarán con una variedad de sistemas de adquisición de datos y los autores asumen anyoLa realización de este procedimiento es competente en el uso de su sistema de adquisición de datos elegido. Los análisis de potencia indican que se requieren tamaños de muestra de 10-15 ratones por grupo para un β ≤0,2.
3. Retire la jaula del estante y colóquela suavemente sobre una mesa cerca del Y-laberinto. Retire el ratón de su jaula de casa y suavemente colóquelo en un brazo del Y-laberinto, mirando hacia el centro. Haga que el investigador se aleje lo suficiente del laberinto para que el ratón no pueda ver al investigador.
4. Activar el sistema de adquisición de datos / video inmediatamente después de colocar el ratón en el laberinto.
5. Pulse play y registre el comportamiento espontáneo de cada ratón durante un período de 10 min. Una vez que se haya completado la sesión, coloque suavemente el ratón en su jaula de inicio y vuelva la jaula al bastidor.
6. Limpie el laberinto a fondo entre cada sesión con una toallita germicida no blanqueada, EtOH al 70%, seguida de dH ₂ O. Repita desde el paso 3.4 para evaluar todos los micrófonosmi.
7. Una vez que todos los ratones han completado la exploración del laberinto en Y, analizar los datos del sistema de adquisición o puntuar manualmente los videos de las sesiones. Una entrada de brazo se produce cuando todas las 4 patas del ratón cruzan el umbral de la zona central y hacia el brazo y el hocico del animal está orientado hacia el extremo del brazo.
   NOTA: Los puntos finales que se analizarán incluyen: distancia total recorrida en el laberinto, distancia total recorrida dentro de cada brazo (incluida la zona central), tiempo total gastado en cada brazo (incluida la zona central), número total de entradas de brazo, Las entradas efectuadas en cada brazo y una lista secuencial de brazos introducidos para evaluar el número de alternancias realizadas.
8. Una alternancia espontánea se produce cuando un ratón entra en un brazo diferente del laberinto en cada una de las 3 entradas de brazo consecutivas. El porcentaje de alternancia espontánea se calcula entonces con la siguiente fórmula.
   
   NOTA: Por ejemplo, iF el orden de entrada del brazo fue: ABCCBABCABC, el investigador anotaría un total de 6 alternancias espontáneas (en orden: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). Con un total de 11 entradas de brazo, el% de alternancia espontánea sería 67%.
9. Realice las siguientes comprobaciones de control de calidad para asegurarse de que los datos representan una evaluación imparcial de la alternancia espontánea.
   1. Realizar una correlación de Pearson de alternancia espontánea% a la distancia total recorrida y el número de entradas de brazo realizado.
      NOTA: Si existe una correlación significativa de la alternancia espontánea% con cualquiera de los parámetros, entonces los datos deben examinarse más a fondo debido a la posible influencia de la locomoción hiperdinámica sobre el punto final cognitivo aparente ¹⁰ .
   2. Analizar el número de entradas realizadas en cada brazo con una prueba de ANOVA de 1 vía.
      NOTA: Si este análisis es significativo, entonces esto indicaría la presencia de señales en el ambiente que atrajo a ratones a un regi particularEn el laberinto.

4. Evaluación de la Memoria de Reconocimiento a Mediano Plazo por Medición del Nuevo Reconocimiento de Objetos ^{11 , 12 , 13}

1. Para cada fase de esta prueba, limpie a fondo el campo de campo abierto con una toallita germicida no blanqueada, 70% de EtOH seguida de dH2O antes del uso inicial.
2. Un día antes de la exposición del objeto, habituar a los ratones a la arena de campo abierto.
   1. Antes del inicio de la sesión de habituación, configure el sistema de adquisición de datos o cámaras de video y confirme el seguimiento adecuado de los ratones en el laberinto. Calibre la distancia en la arena usando imágenes de video capturadas de una regla u otro objeto de longitud conocida. Marque las esquinas de la arena en el software para permitir la puntuación de sesgos posicionales.
      NOTA: Los métodos de comportamiento en este procedimiento funcionarán con una variedad de sistemas de adquisición de datosY los autores asumen que cualquier persona que realiza este procedimiento es proficiente en el uso de su sistema de adquisición de datos elegido. Los análisis de potencia indican que se requieren tamaños de muestra de 15-20 ratones por grupo para un β ≤0,2.
   2. Retire la jaula de la rejilla y suavemente colocar en una mesa en las proximidades de la arena.
   3. Retire el ratón de la jaula de casa y suavemente coloque el ratón en el centro de la arena. Encienda el software de seguimiento y / o el sistema de grabación de vídeo inmediatamente después de colocar el ratón en la arena.
   4. Permita que los ratones exploren libremente la arena durante 30 min.
      NOTA: Durante este período, los investigadores no molestarán a los ratones.
   5. Después de la sesión de habituación, coloque a los ratones de nuevo en su jaula casera y limpie la arena a fondo con una toallita germicida no blanqueada, 70% de EtOH seguida de dH2O.
   6. Repita desde el paso 4.2.2 hasta que todos los ratones se han habituado a la arena.
   7. Después de que todos los ratones han sido hábitoEn la arena, analizar el video.
      NOTA: Los puntos finales para analizar incluyen la distancia total recorrida en la arena y el tiempo pasado cerca de cada esquina. Si es relevante para el modelo de ratón, se incluyen comportamientos estereotipados en estos análisis ( es decir , saltos de esquina mioclónicos, círculos, etc. ). Los ratones que exhiben prejuicios en el tiempo pasado en regiones particulares de la arena se excluyen de la experimentación adicional, ya que esto influirá en la exploración de objetos.
      NOTA: La primera fase del nuevo reconocimiento de objetos implica familiarizar a los ratones con un objeto. En este caso, esta parte del nuevo procedimiento de reconocimiento de objetos se denominará fase de Muestra.
   8. Antes del comienzo de una sesión de fase de muestra, coloque los objetos en la arena y fijarlos al suelo con una masilla de montaje para que los animales no puedan mover los objetos. Alinee dos objetos idénticos a una pared en particular con suficiente distancia entre las paredes y los objetos para que los ratones puedan explorar libremente los objetos desde cualquier ángulo.Les
   9. Configurar el sistema de adquisición de datos o cámaras de vídeo y confirmar el seguimiento adecuado de los ratones y objetos en el laberinto. Calibre las distancias en la arena usando imágenes de video capturadas de una regla u otro objeto de longitud conocida.
   10. Marque las esquinas de la arena en el software para permitir la puntuación de sesgos posicionales. Marque los objetos en el software y rastree su comportamiento exploratorio por separado para cada objeto ( es decir , "Objeto A" y "Objeto B").
   11. Retire la jaula de la parrilla y suavemente colocarlo en una mesa en las proximidades de la arena.
   12. Retire el ratón de la jaula de casa y suavemente colocarlo en el centro de la arena, frente a los objetos.
   13. Permita que el ratón explore libremente los objetos durante 15 min. Durante este período no molestar a los ratones.
   14. Al final de la sesión, coloque suavemente el ratón en su jaula de inicio. Limpie la arena y los objetos con EtOH al 70% y dH ₂ O. Coloque estos objetos en elE arena
   15. Repita el paso 4.2.11 hasta que todos los ratones estén familiarizados con un objeto.
   16. Una vez que todos los ratones han sido familiarizados con un objeto, analice los videos.
       NOTA: Las exploraciones de objetos se cuentan una vez que se cumplen los siguientes criterios: el ratón está orientado hacia el objeto, el hocico está a 2 cm del objeto, el punto medio del cuerpo del animal está a más de 2 cm del objeto y el criterio anterior Se han cumplido durante al menos 1 s. Además, si un animal ha satisfecho los criterios de exploración pero muestra inmovilidad por más de 10 s, entonces la pelea exploratoria se considera terminada.
   17. Calcular una puntuación de sesgo de objeto para cada ratón de la siguiente manera.
       
       NOTA: Los ratones que exhiben una puntuación de sesgo del objeto inferior al 20% o superior al 80% se excluyen de la experimentación adicional.
3. La fase final del nuevo reconocimiento de objetos implica evaluar el comportamiento exploratorioDirigida tanto hacia un objeto nuevo y familiar en el entorno, denominado aquí la fase de prueba. Esta fase se realiza 2-3 horas después de la finalización de la fase de muestra.
   1. Antes del comienzo de una sesión de fase de prueba, coloque los objetos en la arena y fijarlos al piso para que los animales no puedan mover los objetos.
      1. Coloque los objetos en la misma posición en la arena en relación con la fase de muestra ¹³ .
      2. Equilibrar la posición relativa de objetos nuevos y familiares a través de genotipos y grupos de tratamiento.
      3. Asegúrese de que haya suficiente distancia entre las paredes y los objetos para que los ratones puedan explorar libremente los objetos desde todos los ángulos.
   2. Configure el sistema de adquisición de datos y / o las cámaras de vídeo. Confirme el seguimiento adecuado de ratones y objetos en el laberinto. Calibre las distancias en la arena usando imágenes de video capturadas de una regla u otro objeto de longitud conocida.
   3. Marque las esquinas de la arena en el softwSon para permitir la puntuación de los sesgos de posición. Marque los objetos en el software y siga el comportamiento exploratorio de cada objeto individualmente ( es decir , "Novela" y "Familiar").
   4. Retire la jaula de la parrilla y suavemente colocarlo en una mesa en las proximidades de la arena.
   5. Suavemente colocar animales en el centro de la arena, frente a los objetos. Anote los ratones que exploran libremente los objetos durante 10 minutos.
   6. Al final de la sesión de prueba, retire los ratones de la arena y coloque los ratones de nuevo en su jaula de origen. Limpie completamente la arena y los objetos con una toallita germicida no blanqueada, 70% de EtOH y dH2O después de cada sesión.
   7. Repita desde el paso 4.4.3 hasta que todos los animales hayan sido evaluados.
   8. Una vez que la exploración de objetos se mide para todos los ratones, los videos se analizan.
      NOTA: Las exploraciones de objetos se cuentan una vez que se cumplen los siguientes criterios: el ratón está orientado hacia el objeto, el hocico está a 2 cm del objeto, el punto medio deEl cuerpo del animal está a más de 2 cm del objeto y los criterios anteriores se han cumplido durante al menos 1 s. Además, si un animal ha satisfecho los criterios de exploración pero muestra inmovilidad por más de 10 s, entonces la pelea exploratoria se considera terminada.
   9. Evaluar el reconocimiento de objetos noveles comparando el tiempo dedicado a explorar la novela con un objeto familiar. Tres métodos se informan comúnmente en la literatura.
      1. Analizar el tiempo crudo dedicado a explorar objetos noveles y familiares usando una prueba de medida repetida. Este método se utiliza mejor cuando el genotipo y / o el tratamiento no afectan el tiempo total de exploración.
      2. Calcular preferencia de novedad, utilizando la ecuación:
         
         NOTA: Esto proporciona el porcentaje de tiempo dedicado a explorar el objeto novedoso en relación con el tiempo total que explora objetos. Los valores van desde 0% (sin exploración de objeto novedoso) hasta 100% (exploración sólo de la novela obJect), con un valor de 50% indicando tiempo equivalente explorando objetos novedosos y familiares.
      3. Calcular el índice de discriminación ¹¹ , utilizando la ecuación:
         
         NOTA: Esto produce la diferencia en el tiempo dedicado a explorar los objetos noveles y familiares relativos al tiempo total dedicado a explorar objetos. Los valores van desde -1 (exploración sólo del objeto familiar) hasta +1 (exploración sólo del objeto novel, con un valor de 0 indicando el tiempo equivalente que se gasta explorando objetos nuevos y familiares.
   10. Eliminar los animales que no participan en la sesión de prueba debido a la locomoción hiperdinámica u otras estereotipias, de la consideración ¹¹ .
       NOTA: Los criterios utilizados para la remoción deben ser objetivos y determinados a priori para el modelo de ratón ( es decir , < ^5º percentil para el tiempo total de exploración y> 100 promedioÁngulo de giro durante la sesión de prueba o> 50 percentil tiempo que muestra el salto de esquina mioclónica).

5. Evaluación de la función corticospinal en ratones con cierre de extremidades ¹⁴

1. Video documento toda la sesión. Grabe el video usando un dispositivo portátil portátil ( es decir , smartphone o equivalente).
   NOTA: Los análisis de potencia indican que se requieren tamaños de muestra de 10-15 ratones por grupo para un β ≤0,2.
2. Retire la jaula de la estantería y colóquela sobre una mesa. Documente el ID de animal en el video antes del paso siguiente.
3. Suavemente retire el ratón de su jaula y suspender por la cola durante 5-10 s. El video debe grabar las patas traseras del animal mientras está suspendido.
4. Después de capturar al menos 5 s de vídeo, coloque el ratón de nuevo en su jaula de inicio, y regrese la jaula al bastidor.
5. Limpia la mesa. Repita desde el paso 5.2 hasta que todos los ratones hayan sido recorde re.
6. Puntuación de la extremidad que abrocha de los videos de los ratones suspendidos por su cola en una escala de 0-4 (véase la Tabla 1 para la descripción de anotar). Inspeccionar videos de ratones suspendidos y luego asignar una puntuación basada en los siguientes criterios.
   1. Ninguna extremidad abrazando. Extensión de escape normal. Una de las extremidades posteriores muestra un juego incompleto y una pérdida de movilidad. Los dedos del pie exhiben el splay normal.
   2. Ambos miembros posteriores exhiben una rotura incompleta y pérdida de movilidad. Los dedos del pie exhiben el splay normal.
   3. Ambas extremidades traseras muestran abrazarse con los dedos enroscados y la inmovilidad.
   4. Forelimbs y las extremidades posteriores muestran abrazados y se cruzan, los dedos enrrollados y la inmovilidad.
7. Todos los ratones son calificados por 2 investigadores independientes. Cualquier ratón en el que las 2 puntuaciones difieren en más de 1 punto se vuelve a marcar una vez más.
   1. Las puntuaciones que difieren se promedian.

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Tabla 1: Descripción de las puntuaciones de agarre de las extremidades.

Resultados

Los ratones Tg2576 envejecidos presentan déficits robustos en las alternancias espontáneas hechas dentro de un laberinto en Y ^{15 , 16} , un fenotipo que puede replicarse usando los métodos detallados aquí ( Figura 1A ). Mientras que en estos ratones se observa una tendencia a incrementar las entradas de brazos ( Figura 1B ), la hiperactividad observada en esta línea de ratones no afectó la tasa de alternancia espontánea ( Figura 1C ). Por el contrario, los ratones rTg4510 envejecidos parecen mostrar una alternancia espontánea incrementada cuando se colocan en un laberinto en Y ( Figura 1D ). Esto se debe a la hiperactividad extrema ( Figura 1E ) y la estereotipia ¹⁰ , que interfieren significativamente con la medición de la alternancia espontánea ( Figura 1F ). Al evaluar inicialmente a los ratones en esta tarea, es fundamental asegurarse de que las entradas de brazo y / o la distancia recorrida no seanSignificativamente correlacionada con la tasa de alternancia espontánea.

Antes de la evaluación del reconocimiento de nuevos objetos, los ratones están habituados a la arena donde se realizará la prueba. Durante la habituación, se puede evaluar la hiperactividad ( Figura 2A ) y otros comportamientos estereotipados relevantes para el modelo de ratón. Durante la fase de muestreo, es crítico medir la exploración de cada objeto por separado para que los ratones que muestran sesgos significativos en el comportamiento exploratorio pueden ser excluidos de la evaluación adicional ( Figura 2B , círculos abiertos). El reconocimiento de objetos nuevos se evalúa comparando la exploración de un objeto familiar y novedoso, y se analiza comúnmente de tres maneras diferentes. Si el tiempo exploratorio total es comparable entre los genotipos y / o los grupos de tratamiento, entonces el tiempo crudo que explora cada objeto y las pruebas de medidas repetidas apropiadas se pueden usar para determinar si había diferencias en el nuevo objeto rEcognición ( Figura 2C ). Si una cepa de ratón particular presenta diferencias en el tiempo exploratorio total, se puede evaluar el reconocimiento de nuevos objetos utilizando la preferencia de novedad ( Figura 2D ) o el índice de discriminación ( Figura 2E ).

Clasp de las extremidades es una prueba motora funcional que cuantifica los déficits en la función corticospinal. El estrechamiento de miembros, que no es una medida cognitiva, se observa en varios modelos de ratones tau transgénicos ^{6 , 17 , 18 , 19} y recapitula algunos de los déficits motores funcionales observados en pacientes con DA tardía. La suspensión de ratones por la cola provoca una respuesta de escape ( Figura 3A , "0"). Los déficits en la capacidad de esparcir las extremidades posteriores y extender los dedos de los pies se ponen de acuerdo con su gravedad en una escala de 0-4 ( Figura 3A). Utilizando el procedimiento descrito en la presente memoria, se puede observar la unión significativa de miembros en ratones rTg4510 ( Figura 3B ).

Figura 1: Alternancia espontánea en el Y-laberinto. ( A ) Cuando se colocan en un laberinto en Y, los ratones adoptan una estrategia de búsqueda de pérdida de turno que da como resultado un patrón de exploración mediante el cual cada brazo es explorado sólo una vez por cada entrada de 3 brazos. Los ratones Tg2576 envejecidos presentan un déficit significativo en la alternancia espontánea. Utilizando los procedimientos esbozados en este método, se observó una restauración significativa de la alternancia espontánea después del tratamiento con un compuesto patentado. Los datos se analizaron utilizando ANOVA de 1 vía y las comparaciones post-hoc con Tg-PBS se realizaron usando la prueba de Dunnett. ** p & lt; 0,01. Las barras de error indican SEM. ( B ) El número de entradas de los brazos no fue significativamente diferenteDe los grupos monitorizados en este experimento. Los datos se analizaron mediante una prueba de ANOVA de 1 vía. Las barras de error indican SEM. ( C ) No hubo correlación entre la alternancia espontánea y el número de entradas de brazo realizadas, lo que indica que las diferencias en la actividad locomotora espontánea no afectaron la cuantificación de la alternancia espontánea. La prueba de correlación se realizó utilizando el análisis de correlación de Pearson. ( D ) Cuando se colocan en un laberinto en Y, los ratones rTg4510 (6 meses) parecen presentar una alternancia significativamente más espontánea en relación con los ratones WT littermate. Los datos se analizaron por ANOVA de 1 vía y las comparaciones post-hoc con Tg-PBS se realizaron usando la prueba de Dunnett. ** p & lt; 0,01. Las barras de error indican SEM. ( E ) ratones rTg4510 hizo significativamente más entradas de brazo debido a su locomoción hiperdinámica extrema. Los datos se analizaron por ANOVA de 1 vía y las comparaciones post-hoc con Tg-PBS se realizaron usando la prueba de Dunnett. *** p <0,001. Las barras de error indican SEM. ( F ) El comportamiento de la alternancia espontánea correlacionó significativamente con las entradas del brazo, indicando el fenotipo locomotor hyperdynamic obscurecido la alternación verdadera espontánea. La prueba de correlación se realizó utilizando el análisis de correlación de Pearson (r = 0,7, p <0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Reconocimiento de objetos noveles. ( A ) Habituación Arena permite la medición de la locomoción espontánea y otros comportamientos estereotipados relevantes para un modelo de ratón en particular. En este caso, envejecido Tg2576 ratones (22 meses) muestran significativamente más espontánea locomoción en relación con littermate WT ratones. Los datos se analizaron por ANOVA de 1 vía y las comparaciones post-hoc con Tg-Veh se realizaron usando Dunnett 'S prueba. ** p & lt; 0,01. Las barras de error indican SEM. ( B ) Durante la fase de muestra, la exploración de dos objetos idénticos fue rastreada por separado. Los ratones que exhiben sesgos grandes hacia la exploración de uno de los dos objetos (círculos abiertos) fueron excluidos de la fase de prueba. ( C - E ) El reconocimiento de nuevos objetos se evaluó midiendo la exploración de un objeto nuevo y familiar. El reconocimiento de nuevos objetos se evaluó utilizando ( C ) tiempo de exploración crudo, ( D ) preferencia de novedad o índice de discriminación ( E ). Los datos en el panel C se analizaron usando un ANOVA de 2 vías con medidas repetidas y se hicieron comparaciones por parejas usando la prueba de Sidak. Los datos en los paneles DE se analizaron con un ANOVA de 1 vía y las comparaciones post-hoc con Tg-Veh se hicieron usando la prueba de Dunnett. * P <0,05, ** p <0,01. Las barras de error indican SEM. Por favor haz clickAquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ajuste de las extremidades. ( A ) Las imágenes representativas de ratones que exhiben diversos grados de unión de miembros como se describe en la Tabla 1. ( B ) Los ratones rTg4510 (6 meses) presentan un agarre significativo de miembros con respecto a ratones WT littermate según se puntúa usando estos métodos. Los datos se analizaron utilizando un ANOVA de 1 vía y las comparaciones post-hoc con Tg-PBS se realizaron usando la prueba de Dunnett. *** p <0,001, **** p <0,0001. Las barras de error indican SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Significado de la técnica con respecto a los métodos existentes
Este procedimiento ha sido diseñado para detectar la actividad in vivo de compuestos en modelos de ratón transgénicos de beta - amiloidosis y tauopatía. El enfoque escalonado empleado aquí asegura la detección de compuestos eficaces en los dominios cognitivos relevantes para AD ³ . Además, el enfoque detallado aquí utiliza pruebas de comportamiento que tienen puntos finales claramente definidos, controles de control de calidad fácilmente implementables, se pueden ejecutar en un formato de rendimiento moderado y requieren poca intervención del investigador. Estas características resultan en ensayos que muestran una buena reproducibilidad dentro de los animales y entre cohortes, lo que resulta en una varianza intra e inter-ensayo baja y tamaños de efecto (2 ≤ f ≤6) suficientemente robustos para soportar el perfil conductual en un ambiente de descubrimiento de fármacos.

Pasos críticos dentro del PrOtocolo
Muchos modelos de ratón en uso para el descubrimiento de fármacos de AD muestran comportamientos consistentes con una mayor ansiedad y agresividad. Esto hace que la habituación de manejo sea esencial para realizar cualquiera de las pruebas de comportamiento descritas aquí. Como estas pruebas se basan en comportamientos desmotivados, el manejo brusco por el investigador debido a un ratón hiperactivo y ansioso o agresivo puede influir significativamente en el rendimiento. El aumento de la ansiedad podría resultar en la falta de realización de la tarea, reduciendo el poder general de la prueba. Además, los niveles de luz en la arena son esenciales para facilitar la locomoción espontánea necesaria para cada prueba. Luz brillante tiende a aumentar la ansiedad y suprimir la locomoción en los roedores, por lo tanto, se debe tener cuidado de ajustar los niveles de luz ambiente a 30-35 lux en la arena.

Otro aspecto crítico del procedimiento es la minimización de señales ambientales fuertes que podrían interferir con la capacidad de un animal para realizar las tareas. Limpieza delArena y objetos entre las carreras es esencial ya que los ratones son atraídos a nuevos aromas en el medio ambiente. Si no se limpia a fondo la arena y los objetos, la actividad espontánea del ratón puede ser sesgada y se puede enmascarar el verdadero rendimiento cognitivo. Los investigadores también deben minimizar el uso de productos de higiene personal y colonias / perfumes al realizar estos procedimientos. Por último, los roedores presentan fuertes cambios diurnos y circadianos en muchos comportamientos abiertos ^20, incluyendo el aprendizaje y la memoria ²¹ . Por lo tanto, para minimizar la varianza debido a los ritmos diurnos en los comportamientos basales y el rendimiento cognitivo, todas las pruebas deben hacerse a la misma hora del día entre cohortes y estudios.

Además, específicamente con respecto al nuevo reconocimiento de objeto, el intervalo de retardo entre la muestra y la fase de prueba, y la selección y colocación de objetos en el entorno son parámetros críticos. La memoria existe en 3 formas distintas: mem(STM), memoria de término intermedio (ITM) y memoria a largo plazo (LTM) ^{22 , 23} . Cambiar el intervalo entre la muestra y las fases de prueba de minutos (STM) a horas (ITM) o días (LTM) cambiará el tipo de memoria probada por el procedimiento ¹² . Además, antes de ejecutar la nueva prueba de reconocimiento de objetos, muchos objetos deben ser examinados en una cohorte de pruebas de ratones para sesgos potenciales en la exploración. Un objeto que es excesivamente atractivo o repulsivo para la cohorte de prueba no puede ser utilizado al evaluar el reconocimiento de objetos nuevos. Idealmente, todos los objetos que se emplearán en la prueba, cuando se colocan en una arena, obtendrán tiempos de exploración iguales de una cohorte ingenua de ratones. Pruebas inadecuadas y optimización de objetos pueden reducir significativamente el poder del nuevo reconocimiento de objetos.

Modificaciones y solución de problemas
Hay varios factores que podrían aumentar laAparente variabilidad en las pruebas cognitivas aquí descritas. Muchos modelos de ratón de AD exhiben locomoción hiperdinámica ³ que puede enmascarar o alterar comportamientos medidos como el punto final cognitivo. Además, hay evidencia creciente de que el sexo ^{24 , 25 , 26} e incluso el genotipo ²⁷ materno pueden influir en el desarrollo y progresión de neuropatología y fenotipos cognitivos en modelos de ratones AD. La variabilidad inesperada o el fracaso en la implementación de una tarea de comportamiento podría deberse a cualquiera de estos factores. Cuando se implementa una prueba conductual en particular, los resultados deben estratificarse siempre por sexo, edad y, si procede, genotipo materno. Además, los controles de calidad descritos en este procedimiento siempre deben realizarse para asegurar que la hiperactividad u otros comportamientos estereotipados no interfieran con la cuantificación de los puntos finales cognitivos.

EnvEl endurecimiento también puede influir en el comportamiento exploratorio espontáneo de los roedores. Los olores o sonidos que son indetectables para los investigadores podrían atraer o repeler a los ratones, sesgando los resultados de las pruebas cognitivas que se basan en el comportamiento espontáneo. Al establecer inicialmente el laberinto en Y o el reconocimiento de objetos novedosos, el desempeño de las medidas de control para asegurar que no hay sesgos de posición en la exploración de objetos y / o el ambiente es esencial. Si se observan sesgos de posición, los investigadores deben examinar minuciosamente el ambiente y potencialmente ajustar la iluminación, la colocación de la arena, la ubicación de la sala de pruebas en relación con otras salas de la instalación ( es decir , no cerca de un área de tráfico alto o equipo pesado)

La habituación al entorno de prueba es clave para lograr un rendimiento óptimo en la nueva prueba de reconocimiento de objetos. Por ejemplo, los tiempos de exploración totales bajos pueden deberse a una habituación inadecuada. Como alternativa al proc(Sección 2) y la ambientación (sección 4.2), la habituación a la manipulación y el ambiente de prueba se pueden realizar como sesiones de 3, 5 minutos por día durante 2 días consecutivos.

Limitaciones de la técnica
Como con cualquier procedimiento, estas pruebas de comportamiento tienen limitaciones. Estos procedimientos se han empleado porque prueban la función de varias regiones corticales y el hipocampo. Si el modelo de ratón no presenta déficit funcional en las regiones del cerebro probadas por estas pruebas, entonces estas técnicas no serán útiles. Además, hemos elegido pruebas cognitivas que sondean la memoria a corto plazo. Si no se espera que el mecanismo de acción del compuesto bajo evaluación preclínica afecte la memoria a corto plazo, estos procedimientos deben ser modificados en consecuencia ( es decir , aumentando el intervalo de fase de prueba de muestra para probar la memoria a largo plazo). Por último, estas pruebas usan comportamientos desmotivados. Por lo tanto, si un modelo de ratón es excesSivamente hiperactiva o muestra otros comportamientos estereotipados que impiden la exploración del medio ambiente, entonces estos procedimientos podrían no ser óptimos. Como alternativa, se podría utilizar el miedo acondicionado para Tg2576 u otros β-amiloidosis ratón modelos, o el laberinto de agua espacial para rTg4510 u otros modelos de ratones de tauopatía [ ^3] .

Aplicaciones futuras
Una vez que estos procedimientos se han adoptado con éxito en el laboratorio, se pueden hacer varias modificaciones o extensiones para evaluar las medidas motoras cognitivas y funcionales adicionales. Por ejemplo, cambiar la tarea de reconocimiento de objetos noveles para determinar si un ratón puede reconocer un cambio en la colocación de un objeto ¹³ . Alternativamente, en lugar de usar objetos, uno podría usar otros ratones e implementar una prueba de reconocimiento social. Con respecto a la sujeción de las extremidades y la función motora, se podría complementar esa prueba con las pruebas de resistencia al agarre y / o de la tensión del cable. Los exámenesDetalladas en este método forman una base sólida para cribar compuestos que tienen eficacia in vivo en modelos de ratón de traducción para AD y pueden adaptarse o modificarse de muchas maneras para interrogar mejor un modelo de ratón particular o satisfacer las necesidades de un programa único de descubrimiento de fármacos .

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Topscan Lite-High Throughput	Cleversys		Análisis de comportamiento automatizado. Incluye cámaras y sistema de adquisición de video, computadora portátil.
ObjectScan	Cleversys		Módulo de software para la cuantificación precisa de la exploración de objetos
Campo abierto para ratón	Cleversys	CSI-OF-M	Arena para el reconocimiento de objetos novedosos
Laberinto en Y para ratón	Brazos personalizados		: paredes de 30 cm de largo, 10 cm de ancho, 20 cm de alto, colocadas a 120 grados de distancia.
Soporte de cámara para campo abierto	Custom Custom	76	cm de alto, 115 cm de ancho, cámaras montadas @ 30 cm adentro desde cualquier lado. Dos soportes, cada uno cubre dos cajas.
Soporte de cámara para Y-maze	Custom Custom	76	cm de alto, 115 cm de ancho, cámaras montadas @ 30cm desde cualquier lado.  Una montura cubre dos laberintos.
Mármoles	Inperial Toy	8565	Standard (15,5 mm Dia) mármoles de vidrio.
Dados	Cardinal Industries	770	Standard (0.650 inch) dados blancos con puntos negros.
LOCTITE Fun-Tak	Henkel	B018A3AG0W	Estándar azul pegajoso
tak EtOH	Nexeo Solutions	82452	100% Etanol Diluido al 70% usando agua destilada
dH2O	Tulpenhocken Spring Water Co.	-	PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320
Toallas de papel	Procter & Gamble		B019DM86LA Bounty,
cámara de video de mano	Apple, Inc.	MKV92LL/A	Adquisición de vídeo de agarre de extremidades, Iphone 6S Plus (o equivalente funcional).
Guantes	SafePOINT, L.L.C.	GL640-2	Estándar, Guantes de látex sin polvo, Medidor de luz medio
	Dr. Meter	LX1330B	Iluminación @ la parte inferior de Campo abierto = 35 LUX, Iluminación @ parte inferior de Y-Maze = 32 LUX
Toallitas germicidas con lejía	Clorox		Esterilización del equipo durante y después de su uso