Summary
Selektiv markierte fluoreszierende GnRH-I, -II und -III - Derivate sind zuverlässige Werkzeuge für die Verfolgung und ihre zelluläre Aufnahme zu quantifizieren. Diese Handschrift stellt Experimente zu visualisieren, zu quantifizieren und die Aufnahmeeffizienz dieser GnRH-Konjugate in verschiedenen Zelllinien zu vergleichen.
Abstract
GnRH-Analoga sind effektive Targeting-Einheiten und in der Lage Anti-Krebs-Mittel, die hoch express GnRH-Rezeptoren selektiv in malignen Tumorzellen zu liefern. Allerdings sind die quantitative Analyse der GnRH-Analoga "zelluläre Aufnahme und die untersuchten Zelltypen in GnRH-basierten Wirkstoffabgabesysteme derzeit begrenzt. Zuvor eingeführt, selektiv markierte fluoreszierende GnRH-I, -II und -III-Derivate bieten große Nachweisbarkeit, und sie haben geeignete chemische Eigenschaften für reproduzierbare und robuste Experimente. Wir fanden auch, dass die entsprechenden up-to-date Methoden mit dieser markierten GnRH-Analoga neue Informationen über die GnRH-basierte Drug-Delivery-Systeme bieten konnte. Dieses Manuskript stellt einige einfache und schnelle Experimente in Bezug auf die zelluläre Aufnahme von [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II und [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III auf der EBC-1 (Lunge), die BxPC-3 (Pankreas) und auf der Detroit-562- (Pharynx) maligne tumor Zellen. Parallel zu diesen GnRH-FITC-Konjugate wurde die Zelloberflächenpegel von GnRH-I-Rezeptoren auch auf diese Zelllinien untersucht vor und nach der Behandlung durch GnRH konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Die zelluläre Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate wurde durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung quantifiziert. In diesen Experimenten geringfügige Unterschiede zwischen den GnRH-Analoga und die wichtigsten Unterschiede zwischen den Zelltypen beobachtet. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Zelllinien sind mit ihrer ausgeprägten Maß an Zelloberflächen-GnRH-I-Rezeptoren korreliert. Die vorgestellten Experimente enthalten praktische Methoden zu visualisieren, zu quantifizieren und die Aufnahmeeffizienz von GnRH-FITC-Konjugate in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise auf verschiedenen adhärenten Zellkulturen vergleichen. Diese Ergebnisse könnten die Drug-Targeting-Effizienz von GnRH-Konjugate auf der gegebenen Zellkultur vorhersagen, und bieten eine gute Grundlage für weitere Experimente bei der Untersuchung von GnRH-basierte Drug-Delivery-Systeme.
Introduction
Peptid - basierten gezielten Wirkstoffabgabesysteme haben eine schnelle Entwicklung und vielversprechender Bereich in der Krebstherapie in den letzten Jahren zu 1, 2. Menschliche Gonadotropin - Releasing - Hormon - Rezeptor Typ I (GnRH-IR) wird in erster Linie in der Hypophyse befindet , sondern auch in verschiedenen anderen Geweben , die für die Selbstreproduktion 3 verantwortlich sind. GnRH-IR ist auch in einer Reihe von Krebsgewebe, im Zusammenhang oder in keinem Zusammenhang mit dem Fortpflanzungssystem 4, 5 ausgedrückt. Die hohe Expression von GnRH-IR bei verschiedenen malignen Tumorzellen im Vergleich zu gesunden Geweben bietet die Möglichkeit für eine zielgerichtete Therapie 5, 6.
Viele Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Analoga wurden in den letzten Jahrzehnten entwickelt, die als Targeting-Einheiten verwendet werden könnte,f "> 7, 8, 9. Diese Peptide sind in der Lage Antikrebsmittel mit hoher Selektivität in maligne Tumorzellen zu liefern , die überexprimieren GnRH-IR 6. Mehrere GnRH konjugierten anti-Tumor - Arzneimittel mit höherer Selektivität und eine bessere Wirksamkeit als das entsprechende nicht - konjugiertem freie Arzneimittel wurden 7 berichtet, 8, 9.
Zurück Publikationen zu GnRH - Peptide und deren Rezeptoren berichtet , dass die GnRH-IR verschiedene Konformationen annehmen kann , die unterschiedliche Selektivität für GnRH - Analoga 10. Die hochvariable GnRH-IR ist komplex und verschiedene Signalwege mit unterschiedlichen Aktivität gegen ihre natürlichen und künstlichen Liganden 11 dotiert. Diese Tatsachen machen Untersuchung von GnRH-basierte Systeme eine Herausforderung. Auf der anderen Seite, die y besitzen vielversprechendes therapeutisches Potential. Mehrere Experimente mit radioaktiv markierten GnRH - Peptide zuvor 12 gemeldet wurden, 13, 14, 15, aber Versuche , bei denen fluoreszenzmarkierte wurden GnRH - Analoga verwendet werden , sind noch begrenzt. Während die radioaktive Markierung eine hohe Empfindlichkeit bietet, hat die Fluoreszenzmarkierung einige andere Vorteile, beispielsweise die einfachere Handhabung und die Möglichkeit, mit unterschiedlichen Fluorophoren Gegenfärbung. Drei gemeinsame GnRH - Analoga , die erfolgreich für die Arzneimittelzufuhr verwendet wurden , sind die [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II und GnRH-III, aber die Wirksamkeit dieser Peptide als Targeting - Einheiten ist , selten 16 verglichen wird , 17. Auf der anderen Seite ergibt sich aus verschiedenen Experimenten, in denen verschiedene Krebszellen und GnRH-Analoga verwendet wurden, ist vielfältig.
ntent "> Basierend auf diesen Überlegungen konzentrierten wir uns auf die Tumor - Targeting und Arzneimittelabgabepotential dieser GnRH - Peptiden und dadurch synthetisiert und charakterisiert den [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II und [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III 18 - Peptid - Konjugate dieser Analoga sind mit FITC an der Seitenkette ihrer Lys oder D-Lys (Peptid-FITC Verhältnis 1 selektiv markiert: 1 bei jedem. Konjugat). die Idee war, dass die selektive Fluoreszenzmarkierung neue Informationen über diese Peptide bieten können, und ermöglicht ihre gute Tracking und zuverlässige Quantifizierung. Diese Konjugate haben eine sichere Handhabung und zuverlässige Erkennbarkeit, die es einfacher machen, ihre Tumor-Targeting die Effizienz zu vergleichen, und die Screening von zahlreichen Arten von bösartigen Tumorzellen. Wir hoffen, dass auf dem neuesten Stand Experimente mit diesen Peptid-Konjugate auf die Entwicklung neuer Krebs beitragen könnten, GnRH-Wirkstoff-Konjugate Targeting und dazu beitragen, neue therapeutische Teer zu identifizierenals auch bekommt.Die vorliegende Manuskript zeigt einige gut reproduzierbare und schnelle Experimente mit GnRH-FITC-Konjugate. Die Zelloberflächenexpression von GnRH-R ist eine bestimmend Bedingung hinsichtlich GnRH-Aufnahme, daher gleichzeitig wir die Zelloberflächenniveau GnRH-IR auf den getesteten Zelllinien untersucht. Wir visualisiert die GnRH-IR und GnRH-FITC-Konjugate durch konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM) und quantifiziert die zelluläre Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate unter Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS).
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Protocol
1. Herstellung von Zellkulturen und Reagenzien
- Pflegen Sie die Zellkulturen in dem vom Hersteller empfohlenen Medium, ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und Antibiotika (genannt komplettes Medium). Halten der Zellkulturkolben in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C. Folgen Sie der Proliferation und Konfluenz der Zellen durch inverses Mikroskop (mit 10X Phasenkontrastobjektiv).
- Wenn Zellen ausreichende Konfluenz erreichen, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Kultur mit 2-3 ml, sterile phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS und 0,5 mL, sterile 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zur Zellkultur und Inkubation bei 37 ° C, bis die Zellen lösen (ca. 10 min).
- Die Zellen in 3-4 ml sterile Komplettmedium Trypsin zu stoppen und sie in ein steriles Zentrifugenröhrchen übertragen. Zentrifugieren der Zellen bei 150 g für 4 min bei Raumtemperatur (RT). Überstand vorsichtig verwerfen und die Aussetzung der pEllet in 2-3 ml sterile Komplettmedium.
- Nehmen Sie 100 ul der Zellsuspension und mischen sich mit 100 ul 0,4% (m / V) Trypanblaulösung, die toten Zellen zu färben. Last 10 ul dieser Mischung in einem Hämozytometer und bestimmen die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch inverses Mikroskop.
- Verdünne die erforderliche Menge an Zellsuspension hergestellt in Schritt 1,3 bis 10 ml mit sterilem Komplettmedium, enthaltend 4 x 10 4 Zellen / mL.
- Nach Eintragen von 250 & mgr; l Zellsuspension (hergestellt in Schritt 1.5) pro Vertiefung (10 4 Zellen / Vertiefung) in sieben Vertiefungen der ersten Glasboden 8-well Objektträger. Verwenden Sie diese Folie in der GnRH-Aufnahme-Methode.
- In 250 ul der Zellsuspension (hergestellt in Schritt 1.5) pro Vertiefung (10 4 Zellen / Vertiefung) in fünf Vertiefungen der zweiten 8-Well - Objektträger. Diese Folie wird in der GnRH-IR Expressionsverfahren verwendet werden.
- 1 ml Zellsuspension (hergestellt in Schritt 1.5) pro Mulde (4 x 10 4 Zellen / Vertiefung) in sieben wells einer 12-Well-Platte. Diese Platte wird in der GnRH Quantifizierungsverfahren eingesetzt werden.
- Lassen Sie die Zellen auf den beiden Objektträger und der Platte haften. Inkubieren sie in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 48 h.
- Nach der Inkubation überprüfen Sie die Zellen durch inverses Mikroskop (10fach Phasenkontrastobjektiv verwendet wird). Wenn die Zellen gesund und befestigt sind, mit den folgenden Schritten fort.
- Herstellung von 10 mM GnRH-FITC - Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) von jedem der drei Konjugate 18. (Verwenden Sie diese Verdünnung Konzentrationen: 16,43 ug / ul [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 ug / ul [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II und 16.47 ug / ul [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Bewahren sie diese Stammlösungen in einem dunklen Ort bei RT und innerhalb von ein paar Wochen.
- Verdünnen Sie 1,7 ul jeder der drei 10 mM GnRH-FITC-Stammlösungen in 1,7 ml Vollmedium. Schütteln Sie diese Lösungen. (These sind die 10 uM GnRH-FITC Medien zu behandeln.) verdünnt 150 & mgr; l jeder der drei 10 uM GnRH-FITC Behandlungsmedium in 1,35 ml vollständigem Medium. Schütteln diese Lösungen als auch (dies sind die 1 uM GnRH-FITC Behandlungsmedium).
HINWEIS: Alle GnRH-FITC Behandlungsmedium enthalten, sollten vor Licht und innerhalb von wenigen Stunden geschützt werden. - Vorwärmen der sechs GnRH-FITC Behandlungsmedium (hergestellt in Schritt 1.12) und 4 ml vollständigem Medium bis 37 ° C.
- Verdünnte 3 ul 5 mM fluoreszierenden Sondenlösung (nuclear Gegenfärbemittel in der Materialliste angegeben) in 3 ml PBS auf 5 & mgr; M. Diese Lösung sollte vor Licht geschützt werden, ist es bei RT halten und es innerhalb weniger Stunden verbrauchen.
2. konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM)
- GnRH - Aufnahme - Methode
- Nehmen Sie die erste in Schritt hergestellten Objektträger 1.6 und Pipette aus dem vollständigen Medium aus jedem der sieben gut. In 250 ul vorgewärmte komplett medium in die erste gut. Verwenden Sie diese als negative Kontrolle. Nach Eintragen von 250 & mgr; l des vorgewärmten GnRH-FITC Behandlungsmedien (von 1,13) zu jedem der nächsten sechs Vertiefungen (3 Vertiefungen mit 1 & mgr; M und 3 mit 10 & mgr; M). Inkubieren des Objektträgers in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 5 h.
- Pipette aus dem Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. Fügen Sie 250 ul der Fixier-Lösung (10% neutral gepuffertem Formalin) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 10 min.
- Pipette aus der Fixier-Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. In 250 ul PBS, das 5 uM Fluoreszenzsonde Lösung, hergestellt in Schritt 1.14 in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 10 min.
- Pipette aus der Fluoreszenzsonde Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die zweimal Zellen mit 250 & mgr; l PBS vorsichtig. 3-4 Tropfen Eindeckmedium in jede Vertiefung, endlich. Halten Sie die Folie in Dunkeln bei RT bis zur Bildgebung.
- GnRH-IR - Expressionsverfahren
- Nehmen Sie die zweite 8-Well-Dia mikroskopisch in Stufe 1.7 und Pipette aus dem vollständigen Medium aus jedem der fünf Brunnen.
- In 250 ul vorgewärmte Komplettmedium in den ersten gut, verwenden Sie diese als negative Kontrolle. In 250 ul vorgewärmte Komplettmedium in die zweite gut zu, und verwenden Sie diese GnRH-IR-Expression vor der GnRH-Behandlung zu untersuchen.
- In 250 ul jeder der drei vorgeheizten 10 uM GnRH-FITC Behandlung von Medien in den nächsten drei Brunnen. Verwenden Sie diese Vertiefungen, die die Zellen mit GnRH-FITC-Konjugate vorzubehandeln, bevor der GnRH-IR-Expression zu untersuchen. Inkubieren des Objektträgers in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 1 h.
- Pipette über das Behandlungsmedium aus jeder der drei Vertiefungen, die verwendet wird, GnRH-IR-Expression nach der GnRH-Behandlung zu untersuchen und zu waschen, diese Vertiefungen mit 250 & mgr; l vorgewärmtem komplettem Medium. In 250uL vorerhitzt Komplettmedium in jede der drei Vertiefungen. Inkubieren des Objektträgers in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 1 h.
- Pipette über das Medium aus jedem der fünf Vertiefungen und wasche die Zellen mit 250 & mgr; l PBS. Fügen Sie 250 ul der Fixier-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 10 min.
- Pipette aus der Fixier-Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 & mgr; l PBS. In 250 ul PBS, das 5% Rinderserumalbumin (BSA) Blocking-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie bei RT für 1 h.
- Verdünne 10 & mgr; l von GnRH-IR primären Antikörper in 1 ml PBS (1: 100-Verhältnis). Halten Sie es bei RT und verwenden Sie es innerhalb von wenigen Stunden.
- Pipette aus der BSA Blocking-Lösung aus jeder Vertiefung mit Ausnahme der Negativkontrolle (erste gut). Waschen Sie die Zellen mit 250 & mgr; l PBS (mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefung). In 250 ul PBS, die GnRH-IR primäre in Schritt 2.2.7 in eac vorbereitet Antikörperh gut (mit Ausnahme der Negativkontrolle). Inkubieren Sie die Folie bei RT für 1 h in einem dunklen Ort.
- Verdünne 2,5 & mgr; l Alexa 546 markierten sekundären Antikörper in 1,25 ml PBS (1: 500-Verhältnis).
HINWEIS: Diese Lösung sollte vor Licht geschützt werden, ist es bei RT halten und es innerhalb weniger Stunden verbrauchen. - Pipette aus Lösungen von jedem der fünf Brunnen und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. In 250 ul PBS, das AF-546 markierten Sekundär in Schritt hergestellten Antikörper 2.2.9 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Folie bei RT für 1 h in Dunkelheit.
- Pipette aus der Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen mit 250 ul PBS. In 250 ul PBS, das 5 uM Fluoreszenzsonde Lösung, hergestellt in Schritt 1.14 in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Folie für 10 min bei RT.
- Pipette aus der Fluoreszenzsonde Lösung aus jeder Vertiefung und waschen Sie die zweimal Zellen mit 250 & mgr; l PBS vorsichtig. 3-4 Tropfen Eindeckmittel in jede Vertiefung, danach. Halten Sie die Folie in dunklenbei RT bis zur mikroskopischen Abbildung.
- Imaging
- Bild die Zellen durch invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (mit 63X -Ölimmersionsobjektiv)
- Verwenden Sie die folgenden Anregungs- / Emissionswellenlängen. GnRH-Konjugate: 488/514 nm, Alexa 546 markierte Antikörper: 488/546 nm (Verwendung nur für die GnRH-IR-Expression-Methode), DRAQ5 Fluoreszenzsonde: 633/680 nm.
- Stellen Sie die Bildparameter, die negativen Kontrollzellen verwendet wird. Verwenden Sie diese Parameter zu Bild behandelten Zellen (Abbildung 3). Nachjustieren Abbildungsparameter auf jedem Objektträger zu Beginn der Analyse. Feinabstimmung und Export von Bildern mit der Software, die vom Hersteller zur Verfügung gestellt, wenn nötig.
- Bild die Zellen durch invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (mit 63X -Ölimmersionsobjektiv)
3. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
- GnRH Quantifizierungsmethode
- Nehmen Sie die Platte in Stufe 1.8 und Pipette aus dem vollständigen Medium von each der sieben Brunnen. 1 ml vorgewärmten Komplettmedium in den ersten gut. Verwenden Sie diese als negative Kontrolle. 1 ml jeder der sechs vorgewärmten Medien (3 Vertiefungen mit 1 & mgr; M und 3 Vertiefungen mit 10 & mgr; M) in den nächsten sechs Vertiefungen behandeln. Inkubieren der Platte in einer befeuchteten, 5% CO 2 -Atmosphäre Inkubator bei 37 ° C für 5 h.
- Pipettieren Sie das Medium aus jedem Well. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS vorsichtig. Fügen Sie 500 ul von Trypsin-EDTA-Lösung in den einzelnen Wells. Inkubieren der Platte bei 37 ° C, bis die Zellen zu lösen (etwa 10 min).
- 1 ml komplettes Medium in jedem Well Trypsin zu stoppen. Schütteln Sie die Platte. Suspend die Zellen vorsichtig mit einer Pipette, und übertragen Sie die Suspension aus jeder Vertiefung in FACS-Röhrchen. Zentrifugiere die Röhrchen bei 150 xg für 4 min, bei 4 ° C.
- Gießen Sie die Überstände vorsichtig heraus, mit einem Zug. In 500 ul eiskaltem PBS in jedes Röhrchen FACS und die Zellen vorsichtig wieder auszusetzen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis bis zum Endedes Experiments.
- Analyse und Berechnung
- Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Zur Anregung verwenden 488 nm Argon-Laser-Wellenlänge und für die Detektion 530 nm Wellenlänge verwenden. Stellen Sie den Durchflusszytometer Parameter nach oben durch die negativen Kontrollzellen ausgeführt wird. Verwenden Sie diese Parameter zu behandelten Zellen (4A) zu analysieren. Werten Sie die Daten mit der Software des Herstellers bestimmen mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) Werte und berechnen die relativen MFI-Werte.
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Representative Results
Bilder von konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) bieten spektakuläre Informationen über die Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate auf der gegebenen Zellkultur in einer Zeit und konzentrationsabhängig. Parallel zu diesen GnRH-FITC-Konjugaten ist die Anwesenheit des GnRH-IR von der Zelloberfläche auch überprüfbare durch die CLSM Experiment. Weiterhin kann durch eine weit rote Färbung DNA Fluoreszenzsonde verwendet wird, ist es möglich, die Kerne von Zellen neben GnRH und GnRH-IR zur Gegenfärbung. Während jedoch das konfokale Bild nicht quantifizierbar ist, kann die einfache "GnRH-Aufnahme-Methode" leicht abzuschätzen, ob die getesteten Zellen enthalten höhere oder geringere Menge an GnRH-FITC-Konjugate. Die applizierten GnRH-FITC-Konjugate, deren Konzentrationen und die Dauer der Behandlung sind variabel in diesem Verfahren, wie erforderlich. Wie in Figur 1 verschiedene Krebszellen verschiedene Ebenen von GnRH-FITC in einer konzentrationsabhängigen Weise enthalten gezeigt. Die erweiterte "GnRH-IR Expressionsverfahren" beschreibt die Visualisierung der Zelloberfläche GnRH-IR durch Immunzytochemie, vor und nach der GnRH-FITC Behandlung. Im ersten Teil dieses Verfahrens (vor dem GnRH-FITC-Behandlung), zu visualisieren wir GnRH-IR durch Immunzytochemie, ohne GnRH-FITC Behandlung. Im zweiten Teil dieses Verfahrens (nach der GnRH-FITC-Behandlung) behandeln wir Zellen für 1 h mit 10 & mgr; M GnRH-FITC. Nach der Behandlung inkubieren wir die Zellen in komplettem Medium für weitere 1 h und GnRH-IR durch Immunzytochemie visualisieren. Wie in 2A gezeigt ist , weisen unterschiedliche Krebszellen verschiedene Ebenen von GnRH-IR auf ihrer Oberfläche vor dem GnRH-FITC Behandlung. Wie in 2B gezeigt, nach der GnRH-FITC Behandlung, halten die GnRH-IR - exprimierenden Zellen (EBC-1) oder erhöhen (Detroit-562) GnRH-IR - Ebene auf ihren Membranen. An dieser Stelle ist zu beachten, dass wir zuvor bestätigt, dass BxPC-3 - Zellen GnRH-IR auch zum Ausdruck bringen, aber präsentieren sie nicht auf ihre Membran 18. GnRH-IR kann innerhalb der BxPC-3-Zellen durch Immunzytochemie sichtbar gemacht werden, wenn ihre Membranen durchlässig gemacht werden. Dieses Phänomen erklärt sich die relativ geringere GnRH Aufnahmeeffizienz von BxPC-3-Zellen. hier Auf der Grundlage dieser Aussage konzentrieren wir uns nur auf der Zelloberfläche GnRH-IR. Vergleicht man Figur 1 auf 2 bestätigt , dass der Grad der Zelloberfläche GnRH-IR korreliert mit der Menge an GnRH-FITC in den entsprechenden Zellen. Darüber hinaus verdeutlicht Figur 3C dass GnRH-FITC in Zellen internalisiert wird , da die Lokalisierung von GnRH-FITC aus dem Signal von Zelloberflächen GnRH-I-Sparren 1 h des GnRH-FITC - Behandlung abgetrennt wird. Wir schließen daraus, dass "GnRH-IR-Ausdruck-Methode", die von der "GnRH-Aufnahme-Methode" erhalten Informationen unterstützt.
Es ist wichtig, gut angepasste Satz verwendenstellungen während der Bildgebung. Wie bei der Emissionswellenlänge von FITC in 3A dargestellt (514 nm) und dem Fluorophor markierten Sekundärantikörper (546 nm), weisen die unbehandelten negativen Kontrollzellen auch eine geringe Eigenfluoreszenz. Diese unerwünschte Fluoreszenz können falsch positive Ergebnisse liefern. Dadurch wird zu Beginn der Bildgebung ist es wichtig , die Fluoreszenzintensität auf den Kontrollzellen einzustellen , wie in 3B gezeigt. Es wird erwartet, dass ein klares Signal der Kerne bei der Emissionswellenlänge des Kernfärbung (680 nm), mit dem Fluoreszenzsignal an den beiden anderen Wellenlängen beobachten wird, ist gerade sichtbar oder in der Nähe von Null. Alle anderen Zellproben sollten mit diesen gut angepasst und feste Parameter abgebildet werden. Auf diese Weise wird das Signal bei 514 nm beobachtet wird , von dem Signal von FITC-GnRH abgeleitet nur bei 546 nm aus dem Signal des GnRH-IR und insbesondere bei 680 nm von dem Signal von Kernen , wie in 3C gezeigt. Bilder könnten fi seinne Abstimmung nach der Imaging-Software bei Bedarf verwenden.
Durchflusszytometrie Experimente bieten quantifizierbare Informationen über die Menge der GnRH-FITC-Konjugate, die von den Zellen aufgenommen wurden. Die applizierten GnRH-FITC-Konjugate, deren Konzentrationen und die Dauer der Behandlung sind ebenfalls in diesem Verfahren variabel, je nach Bedarf. Die unbehandelten Zellen als negative Kontrolle für die Einstellung der Durchflusszytometrie Parameter und zur Bestimmung ihrer mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) zu Beginn der Analyse verwendet. Wie veranschaulicht auf 4A wurde der MFI für jede Probe bestimmt die gleichen Parameter verwenden. Die relativen MFI - Werte werden aus den MFI - Werte berechnet , die Berechnungsformel in 4B verwendet wird . Unter Verwendung dieser Formel ist die relative MFI-Wert von Kontrollzellen immer Null. Die berechneten relativen MFI-Werte Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von GnRH-FITC-Konjugate, die ihre ein proportional sindverage Konzentrationen in den Zellen. Wie in Abbildung 5 dargestellt ist , mit diesen Daten kann man zeigen und vergleichen , wie effizient diese Krebszellen , die GnRH-FITC - Konjugate aufzunehmen. Somit ist es durch Strömung erhaltenen Ergebnisse Zytometrie ergänzen und die Bilder durch konfokale Mikroskopie erworben unterstützen.
Abbildung 1: Die konfokale Bilder der unbehandelten und der [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III behandelten Krebszellen. Blau-Färbung: Kerne; Grün - Färbung: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. Diese Bilder werden erhalten, die "GnRH-Aufnahme-Methode". (A) Die Fluoreszenzsignale von den unbehandelten Zellen werden auf nahe Null bei 514 nm (grün) auf jede Zelllinie eingestellt. Die DRAQ5 weit rot fluoreszierende Sonde wird verwendet, um die Kerne von Zellen zu färben. (B) Nach Anwendung der Einstellungen, die EBC-1 Lungenkrebs und die Detroit-562 MenschenRachen Krebszellen zeigen nachweisbar, aber Low - Signal bei 514 nm (grün) nach 5 h Behandlung mit 1 & mgr; M [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. (C) Nach 5 h Behandlung mit 10 uM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III, jeder der drei Zelllinien vorhanden höheres Fluoreszenzsignal. Ergebnisse aus diesem Experiment zeigen, dass die BxPC-3-Zellen mit viel geringerer Effizienz im Vergleich nahm GnRH-FITC Bauchspeicheldrüsenkrebs zu den anderen beiden Zelllinien, die durch GnRH-Konjugate leicht anzielbare sind. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die konfokale Bilder von Zelloberflächen - GnRH-IR vor und nach [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I - Behandlung. Blau-Färbung: Kerne; Grün - Färbung: [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I; roter Fleck : GnRH-IR. Diese Bilder werden erzeugt, um die "GnRH-IR-Ausdruck-Methode". (A) vor der GnRH-FITC Behandlung BxPC-3 - Zellen haben GnRH-IR nicht auf der Membran jedoch EBC-1 - Zellen zeigen eine hohe und bestimmte Detroit-562 - Zellen zeigen moderate Level von GnRH-IR. (B) Nach dem GnRH-FITC Behandlung BxPC-3 - Zellen immer noch nicht GnRH-IR auf ihrer Membran aufweisen. EBC-1-Zellen behalten ihre GnRH-IR-Expression und GnRH-FITC in ihnen erscheint. Detroit-562-Zellen scheinen höhere GnRH-IR nach der Behandlung ausstellen und sie nehmen GnRH-FITC, wie gut. Dieses Experiment zeigt, dass verschiedene Arten von bösartigen Tumorzellen weisen unterschiedliche Niveau der GnRH-IR auf ihrer Oberfläche und die GnRH-FITC-Aufnahme scheint eng mit dem GnRH-IR Expressionszelloberfläche in Verbindung stehen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Konfokale Bilder von EBC-1 Lungenkrebszellen. Blau-Färbung: Kerne; Grün - Färbung: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; roter Fleck: GnRH-IR. Diese Bilder werden durch die "GnRH-IR-Ausdruck-Methode" hergestellt. (A) Unbehandelte negative Kontrollzellen (ohne GnRH-FITC und Alexa 546) haben nachweisbar und unerwünschte Fluoreszenz bei 514 nm und 546 nm , wenn über verstärkten Geräteeinstellungen verwenden. (B) Anpassen der Geräteeinstellungen auf den unbehandelten negativen Kontrollzellen, die grün (514nm) und Rot (546 nm) Signal ist in der Nähe von Null. (C) Das bereinigte Parameter ergeben eine klare und zuverlässige Signale für die GnRH-FITC behandelt und GnRH-IR - gefärbten Zellen. Nach der GnRH-FITC Behandlung Lokalisierung von GnRH-FITC (grün) von der Zelloberfläche GnRH-IR (Rot) getrennt.529fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Auswertung der Durchflusszytometrie Daten. (A) Histogramm der unbehandelten und der behandelten Detroit-562 - Zellen. MFI-Werte der Zellproben werden aus dem Histogramm bestimmt. Die x-Achse stellt die Fluoreszenzintensität von Zellen, und die y-Achse zeigt die Zählwerte. Schwarze Linie: MFI vor dem GnRH-FITC-Behandlung; grün gepunktete Linie: MFI nach dem 5 h Behandlung mit 1 & mgr; M [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; rot gestrichelte Linie: MFI nach dem 5 h Behandlung mit 10 & mgr; M [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. (B) Berechnungsformel der relativen MFI - Werte. Die relativen MFI-Werte werden aus den MFI-Werte berechnet. Mit Hilfe dieser Berechnung ist die relative MFI-Wert der unbehandelten Kontrollprobe immer Null. Die relat ive MFI-Werte der behandelten Proben repräsentieren die Menge der GnRH-FITC-Konjugate, die in den Zellen sind. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Relative MFI - Werte von Krebszellen nach 5 h Behandlung mit 1 & mgr; M von GnRH-FITC - Konjugaten. Relative MFI-Werte sind vergleichbar und definieren, wie effizient die gegebenen Zelltypen GnRH-Analoga einnehmen könnte. Die GnRH-IR nicht ausstellenden BxPC-3-Zellen enthalten nur Spuren dieser GnRH-Analoga. Die GnRH-IR EBC-1 Lungenkrebszellen exprimiert enthalten moderate und die Detroit-562 Rachen Krebszellen enthalten hohe Menge an GnRH-Analoga. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD, N = 3 dargestellt."_blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hierin beschriebenen Experimente selektiv markierten GnRH-Analoga für das Screening adhärenten verwenden Zellkulturen in vitro. Konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie Methoden geeignet sind zum Verfolgen und Quantifizierung der zellulären Aufnahme dieser GnRH-FITC-Konjugate in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise. Diese Experimente haben die folgenden kritischen Schritte: 1) halten eine sterile, gesunde Zellkultur; 2) GnRH Peptide müssen von hoher Qualität sein; 3) angemessenen Konzentrationen und Inkubationszeiten müssen befolgt werden; 4) Behandlung und Waschschritte; 5) gut angepasste Geräteeinstellungen.
Zellen werden in dem vom Hersteller empfohlenen Medium gehalten, das mit 10% (V / V) fötalem Rinderserum und Antibiotika (vollständiges Medium). Zellen sollten in einer sterilen Umgebung, bis die Behandlungsschritte (mit GnRH-FITC-Konjugate) gehalten und gehandhabt werden. Vor den Experimenten, überprüfen Sie die Zellen ein umgekehrtes Mikroskop. Sie sollten gesund seinangebracht ist, und müssen die erforderlichen Mengen erreichen.
Es ist wichtig, GnRH-Peptiden mit hoher Qualität und Reinheit zu verwenden. Wir synthetisierten diese Peptide und gereinigt sie zu über 98% 18. Das Peptid kann in einem Kühlschrank als lyophilisiertes Pulver bei -25 ° C gelagert werden. Die 10 mM GnRH-FITC-Stammlösungen in DMSO sollte in einem dunklen Ort bei Raumtemperatur und innerhalb von ein paar Wochen aufbewahrt werden. Wir untersuchten die Stabilität dieser Konjugate und fanden heraus, dass sie stabil sind in DMSO und ihre Fluoreszenzintensität nach 1 Monat sachgemäßer Lagerung gehalten. Die Konzentration der GnRH-FITC-Konjugate und die Zeit der Behandlungen sind variabel in diesen Experimenten, die große Vorteile bietet, aber mit gewissen Einschränkungen (siehe unten). Die verwendeten Konzentrationen und Inkubationszeiten in diesem Protokoll sind nur Empfehlungen, sondern sie bieten eine gute Grundlage für die ersten Versuche.
CLSM Experimente erfordern durchtrennenal Waschschritte. Diese Schritte müssen sorgfältig durchgeführt werden. direkt auf die Zellen nicht Flüssigkeit übertragen. Vielmehr nutzen die Seite oder die Ecke der Brunnen für diesen Zweck. Dies kann Abwaschen minimieren und die anhaftenden Zellen zu verlieren. Es ist auch direktes Licht zu vermeiden, während des gesamten Experiments empfohlen, da es die fluoreszierenden Proben (Photobleaching-Effekt) desensibilisieren. Halten die behandelten Proben an einem dunklen Ort oder mit einem Stück Aluminiumfolie während des Versuchs abgedeckt. Basierend auf früheren Befunden, bemerkten wir, dass die Endkonzentration DMSO in der aufgebrachten Behandlungsmedien ist vernachlässigbar (0,1% (V / V) DMSO in 10 uM Behandlungsmedien) und hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse, wodurch DMSO freien Komplettmedium ist auch als negative Kontrolle.
Es ist wichtig, gut angepasste Geräteparameter während der CLSM und FACS-Experimente zu verwenden. Diese Parameter müssen auf jeden Zelltyp neu kalibriert werden, bevor beide Analysen. Im CLSM Experiment wird die signal Intensität von konfokalen Bildern hängt von den folgenden Parametern: Laserintensität, Detektor Gain und Offset und Pinholegröße. Wenn diese Parameter eingestellt wird, verwenden Sie die niedrigste Laserleistung ein akzeptables Bild zu erzeugen und Photobleichens vermeiden. Festlegen der Abbildungsparameter , die Hintergrundfluoreszenz von ungefärbten negativen Kontrollzellen auf nahezu Null (3B) einzustellen. Bild behandelten Zellen mit diesen eingestellten Parameter falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Zusatzsignale aus den behandelten Zellen bei 514 nm und 546 nm emittiert die erforderlichen Informationen über GnRH oder GnRH-IR enthalten. Diese Schritte erfordern Erfahrung in der CLSM Experimente. Im FACS Experiment, eine Standard-Vorwärtsstreuung seitige Streudiagramm (lineare Skala) erstellen und Spannungen auf den Wohnzellpopulation in der Mitte des Grundstücks einzustellen. Zeichnen Sie eine Region um lebende Zellen. Erstellen Sie ein Histogramm, setzen Abszisse auf Kanal ein (FL1-530 nm, logarithmische Skala) und stellen Sie den vorher definierten Bereich als Gatefür dieses Histogramm. Stellen Sie FL1 Spannung unter das Signal von ungefärbten negativen Kontrollzellen zu bringen , 10 1 (4A). Analysieren Sie behandelten Zellen mit diesen eingestellten Parameter.
Ferner ist es wichtig, die Mycoplasma Status der Zellkulturen von Zeit zu Zeit zu überprüfen. Verschiedene Assays sind für diesen Zweck zur Verfügung. Bei Mycoplasma Positivität, verwerfen Zellen und beginnen mit einer neuen Kultur zu arbeiten. Es wird empfohlen, eine antibiotische Mischung in dem Kulturmedium zu verwenden, das Mycoplasma zu verhindern optimiert ist. Die aufgebrachte Konzentration von GnRH-FITC-Konjugate, und die Zeit der Behandlungen sind in diesen Experimenten variable, jedoch geringen Konzentrationen und kurze Inkubationszeiten Anwendung in zu schwache Signale für Fluoreszenzdetektion führen.
Bei der Abbildung der GnRH-IR parallel mit GnRH-Analoga, höhere GnRH-FITC-Konzentration empfohlen (10 & mgr; M ist optimal). Der Grund für die höhere Konzentrationist die kurze Inkubationszeit (1 Stunde) und die relativ hohe Fluoreszenzsignal des Antikörpers markiert, wie im Vergleich zu GnRH-FITC-Konjugaten. Auf der anderen Seite, eine geringfügige Überlappung zwischen den beiden Fluoreszenzfarbstoff-Emissionen (514 nm und 546 nm) wurde festgestellt, die nur bei 546 nm auftritt und aus dem Signal des GnRH-FITC-Konjugate abgeleitet. Die relativ höhere Fluoreszenzsignal von Alexa 546 und den gut eingestellten Parameter konnte diesen Effekt jedoch minimieren, wie in Abbildung 3 gezeigt. Eine andere mögliche Lösung, um die Überschneidungen zu vermeiden, ist sekundär Antikörper markiert anzuwenden, die unterschiedliche Anregungswellenlänge und / oder besser getrennt Emissionsspektrum zu FITC verglichen hat (wenn die CLSM technischen Parameter dies zulassen). Diese Möglichkeit bietet große Vorteile für die CLSM-Methode, die mit GnRH-FITC-Konjugate mit optionalen Fluoreszenzsonden parallel ermöglicht. Beispielsweise könnte diese alternative Fluoreszenzsonden für Gegenfärbung anderen Organellen, wie erforderlich, verwendet werden.
Die angewandte Konzentration von GnRH-FITC-Konjugate gelten die folgenden Einschränkungen. Maximale Konzentrationsgrenze von GnRH-FITC - Konjugate wird auf der Basis ihrer Löslichkeit 18. Diese Werte sind die folgenden in PBS bei Raumtemperatur: GnRH-I: 90 uM; GnRH-II: 40 uM; GnRH-III: 200 uM. Auf der anderen Seite, in früheren Experimenten sollten wir, dass die Aufnahme dieser GnRH-Peptiden Stelle von anderen Rezeptoren als menschliche GnRH-I-Rezeptoren nehmen könnte; diese Aufnahme scheint bei höheren Konzentrationen an Bedeutung zu sein (über 10 & mgr; M) 18. Die untere Nachweisgrenze von GnRH-FITC-Konjugate wird auf einer Vielzahl von Parametern basiert, aber in idealen Einstellungen ist es etwa 1 & mgr; M für CLMS Experimente. Wir fanden Zytometrie, dass der Fluss bietet eine bessere Empfindlichkeit als die konfokale Mikroskopie. Bei idealen Einstellungen könnte die Bestimmungsgrenze von GnRH-FITC-Konjugate niedriger sein als 1 & mgr; M. Die Nachweisgrenze oder Quantifizierung konnteanders in jedem Experiment, weil sie nach Zelltyp und Inkubationszeit abhängig sind. Man beachte, dass durch FACS erhaltenen Daten ist zuverlässiger als CLSM, weil es berechnet Tausende von Zellen pro Probe und das Durchschnittssignal von Zellen erkennt. Jedoch in dem Protokoll, FACS enthält keine Informationen über die zelluläre Lokalisation von GnRH-FITC-Konjugate und die Zelloberflächenexpression von GnRH-IR. Basierend auf diesen Überlegungen schließen wir, dass die CLSM und FACS-Experimenten deutliche Vorteile, und sie ergänzen sich. Auf der anderen Seite, hohen Gehalt Bildanalyse könnte eine interessante und eine gute Alternative für FACS und CLSM Analyse sein.
Zusammenfassend bestätigen die Daten aus diesen Experimenten erhalten, daß jeder der drei GnRH-FITC-Konjugate in Zellen eindringen kann, die Zelloberflächen-GnRH-IR exprimieren. Diese GnRH-Analoga haben ähnliche Targeting Potenz bei den gleichen Konzentrationen. Allerdings Ebene der GnRH-IR auf der Oberfläche verschiedener Dosecer Zellen ist sehr variabel. Ergebnisse aus den Daten der Durchflusszytometrie-Analyse berechnet ermöglicht den Vergleich von Zelllinien oder GnRH-Analoga. Zur gleichen Zeit, durch konfokale Mikroskopie erhaltenen Bilder konnte das Niveau der Zelloberfläche GnRH-IR-Expression zeigen und bestätigen, dass diese Konjugate in die Zellen internalisiert werden. Basierend auf diesen Ergebnissen kann man bestätigen, dass die eingeführten Experimente enthalten praktische und variable Methoden zur Untersuchung von GnRH-basierten Wirkstoffabgabesysteme und bieten eine gute Grundlage für weitere Experimente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
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