Este protocolo describe un modelo de ratón con cateterismo central de enfermedad crítica prolongada. Combinamos el método de ligadura cecal y punción para inducir sepsis con el uso de una vía venosa central para la administración de líquidos, fármacos y nutrientes para imitar el entorno clínico humano.
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Artículo de método
El uso de una línea venosa central para fluidos, Drogas y Administración de nutrientes en un modelo de ratón de la enfermedad crítica
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Resumen
Resumen
Este protocolo describe un modelo de ratón cateterizado centralmente de enfermedad crítica prolongada. Combinamos la ligadura cecal y punción método para inducir la sepsis con el uso de una línea venosa central para fluidos, medicamentos y administración de nutrientes para imitar el entorno clínico humano. Los pacientes críticos requieren apoyo médico intensivo con el fin de sobrevivir. Mientras que la mayoría de los pacientes se recuperan al cabo de unos días, alrededor de una cuarta parte de los pacientes necesitan cuidados intensivos prolongados y se encuentran en alto riesgo de morir por no resolver un fallo multiorgánico. Además, la fase prolongada de la enfermedad crítica hallmarked por la debilidad profunda del músculo, y los cambios endocrinos y metabólicos, de los cuales la patogénesis está comprendido de forma incompleta. El modelo animal más ampliamente utilizado en la investigación de cuidados críticos es la ligación y punción cecal modelo para inducir la sepsis. Este es un modelo muy reproducible, con cambios inflamatorios y hemodinámicos agudos similares a SEP humanasis, que está diseñado para estudiar la fase aguda de la enfermedad crítica. Sin embargo, este modelo hallmarked por una alta letalidad, que es diferente de la situación clínica humana, y no se ha desarrollado para estudiar la fase prolongada de la enfermedad crítica. Por lo tanto, hemos adaptado la técnica mediante la colocación de un catéter venoso central en la vena yugular que nos permite administrar tratamiento de soporte clínicamente relevante, para imitar mejor la situación clínica humana de la enfermedad crítica. Este modelo de ratón requiere una intervención quirúrgica extensa y cuidados intensivos diaria de los animales, pero el resultado es un modelo relevante de la fase aguda y prolongada de la enfermedad crítica.
Introducción
enfermedad crítica es un estado de enfermedad en el que la función de uno o más sistemas de órganos se ve obstaculizada en la medida en que el paciente morirá, a menos que se administra apoyo médico intensivo. Mientras que la causa inicial de ingreso en la unidad de cuidados intensivos (UCI) puede variar, desde el trauma, cirugía complicada, quemaduras, exacerbaciones de la enfermedad a la sepsis, todos los pacientes críticamente enfermos sufren de daño celular causado por la hipoperfusión, la hipoxia y la inflamación excesiva entre otros , que conduce a la insuficiencia de órganos. La mayoría de los pacientes sobreviven a su lesión aguda, pero una fracción importante de los pacientes no se recuperan inmediatamente y necesitan cuidados intensivos prolongados. Ellos están en alto riesgo de muerte debido a la no resolución de un fallo multiorgánico. Además, la fase prolongada de la enfermedad crítica hallmarked por la debilidad profunda muscular y endocrino y cambio metabólico, de la que la patogénesis está comprendido de forma incompleta.
varios rOdent modelos están siendo utilizados en el marco de la investigación de cuidados críticos. Los dos modelos más utilizados son la administración exógena de lipopolisacárido (LPS) y la ligadura cecal y punción (CLP). Ambos modelos se desarrollan para imitar la fase aguda de la sepsis, definida como una disfunción de órganos potencialmente mortal causada por una respuesta del huésped a la infección desregulada, y una de las principales razones para la admisión en la UCI en todo el mundo 1, 2. El modelo de LPS tiene varias desventajas, ya que sólo transitoriamente afecta a la liberación de citoquinas y el estado hemodinámico del animal 3. A diferencia de los seres humanos, roedores también son particularmente resistentes a la endotoxina y el uso de altas dosis '' de la endotoxina es necesaria para producir la hipotensión y la mortalidad, por la presente elevando aún más preocupaciones de la validez de este método 4, 5. El otro modelo, la ligadura cecal y el modelo de punción (CLP)características de una ligadura de una porción del ciego seguido de una punción con aguja a través de-y-a través. Este procedimiento causa una infección polimicrobiana abdominal con daño tisular, seguido de una translocación de las bacterias en el compartimento de sangre. Esto dará lugar a una respuesta inflamatoria sistémica y el desarrollo de sepsis. El modelo CLP ha sido ampliamente reconocido como un modelo animal de la enfermedad aguda crítica que reproduce las características principales de sepsis: hiperinflamación, vasodilatación, hipotensión y aumento del gasto cardíaco 6, 7. Sin embargo, este modelo no permite el estudio de la insuficiencia no resolver múltiples órganos, pérdida de masa muscular, y endocrinas y metabólicas, que son típicas de la fase prolongada de la enfermedad crítica. Por otra parte, recientemente la validez de los modelos de ratón de la enfermedad crítica ha sido cuestionada, ya que los resultados de los modelos de ratón no siempre pueden ser traducidos a establecer el humano 8, 9, 10. Una posible explicación podría ser que la atención de apoyo que se proporciona a los pacientes críticamente enfermos humanos difiere sustancialmente de la atención que se proporciona a los ratones en estado crítico.
Por lo tanto, se asemejan a la configuración humana más de cerca y para permitir la investigación de la fase prolongada de la enfermedad crítica, hemos desarrollado un modelo de ratón que imita la de cuidados intensivos aguda como se da a los seres humanos, tales como extensa administración de líquidos por vía intravenosa y el tratamiento con antibióticos, y que permite para administrar tratamiento de soporte con el fin de sobrevivir a la fase prolongada de la enfermedad crítica, como el soporte nutricional. Para este propósito, se adaptó el modelo de ratón de sepsis CLP-inducida, siendo el estándar de oro para la sepsis, y colocamos una línea venosa central, que permite la administración de fluidos, la nutrición y las drogas.
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Protocolo
El protocolo fue aprobado por la Universidad de Lovaina Junta de Revisión Ética de Investigación Animal.
1. Preparación de la línea venosa
- Preparar la punta del catéter venoso sumergiendo rápidamente la parte media del tubo de 60 cm microrenathane (MRE) en aceite de sésamo caliente (> 220 ° C). estirar Posteriormente la parte media del tubo para producir un diámetro estrecho (diámetro exterior (OD) <0,5 mm) moviendo suavemente los extremos de la tubería de distancia unos de otros.
- Utilice una hoja de bisturí para cortar el tubo en dos partes de 30 cm cada una (véase la Figura 1, Tabla 1).
- Conectar el tubo de ERM al polietileno PE10 de mangueras mediante conector PE50 polietileno y conectar este tubo PE10 a la parte inferior de la pieza giratoria. Conectar la parte superior de la pieza giratoria a un tubo de PE10, y conectar esta a una aguja stub Luer con un tubo conector PE50 según la Figura 1.
- Aplicar fuerte rápido acting pegamento adhesivo a todas las conexiones y probar el catéter de fugas mediante el lavado con aire. Gas esterilizar el catéter antes de su uso.
Figura 1: Construcción de venoso Line. Líneas venosas se preparan por estirar el tubo MRE a un diámetro pequeño y de la conexión a través de un tubo de polietileno a un dispositivo de roedor giratoria. Véase la Tabla 1 para obtener instrucciones sobre longitudes de las diferentes partes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Leyenda | Longitud | Volumen |
| 1) de la aguja Luer stub 22GRAMO | ||
| 2) PE50 - polietileno de 0,023" x 0,038" | 5 cm | 13 l |
| 3) PE10 - polietileno de 0,011" x 0,024” | 50 cm | 30 l |
| 4) Roedor giratorio 20 G | ||
| 5) PE-10 | 15 cm | 9 l |
| 6) PE-50 (conector) | 5 cm | 13 l |
| 7) MRE025 Tip extendió microrenathane 0,025" x 0,012" | 30 cm | 27 l |
| Suma total | 105 cm | 92 l |
Tabla 1: Construcción de la línea venosa. Esta tabla proporciona una leyenda para la Figura 1.
2. Anestesia y Manejo pre-cirugía
- Use 24-semanas de edad C57BL / 6J (27 - 32 g).
NOTA: Nosotros usamos ratones de 24 semanas de edad (adulto maduro), ya que la edad se corresponde mejor con la edad media de los pacientes de cuidados intensivos. Utilizamos sólo los ratones machos para evitar la influencia cíclica de estrógenos. La técnica también se puede utilizar en los animales más jóvenes (probado en ratones de edad de 16 semanas) y hembras, si se prefiere. - Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos antes de su uso. Enjuague el catéter venoso hecho en casa estéril con solución salina para eliminar las burbujas de aire y para la prueba de permeabilidad y fugas potenciales.
- Cortar un alambre de metal (0,8 mm de diámetro) de 80 cm de longitud, el doble que por plegado y hacer un bucle. Lead 3 perlas sobre el alambre doblado al bucle. Una el catéter hasta el alambre de metal, guiando la punta del catéter a través de los 3 perlas.
NOTA: El alambre de unión de metal es necesario para la rotación de la pieza giratoria a la que está conectado el catéter. Como tal, el ratón se puede mover libremente, sin bloquear la línea venosa. - Anestesiar al mouse por una inyección intraperitoneal (IP) de una mezcla de 0,03 ml de ketamina (100 mg / kg) y 0,02 ml de xilazina (13 mg / kg). Asegúrese de que la anestesia es adecuada comprobando la ausencia de reflejos. Tire suavemente de la lengua del ratón fuera con pinzas para evitar la asfixia por la ingestión de la lengua.
NOTA: Si después de 10 min, el ratón todavía intenta retirar sus extremidades dan ketamina adicional como mL bolus 0,01. - Afeitar el área quirúrgica incluyendo abdomen, lado ventral del cuello (triángulo entre la barbilla, el esternón y la clavícula), y entre los omóplatos en la base de la cabeza).
- Coloque el ratón en la posición de decúbito prono sobre una almohadilla de calefacción precalentado, la desinfección de la piel con 70% de etanol y aplicar una pequeña cantidad de lubricante oftálmica para proteger los ojos de la desecación. Infiltrarse en los sitios quirúrgicos (abdomen, cuello-frente y parte posterior) con 0,2 ml de ropivacaína (0,67 mg / kg).
- Mientras que el ratón está todavía en posición de decúbito prono, hacer una pequeña incisión en la base de la cara dorsalde la cabeza con bisturí o tijeras. Exponer los músculos cervicales posteriores, y atar el músculo al bucle del alambre de fijación con 3,0 nylon, llevando un hilo 3,0 de nylon bajo el músculo.
- Coloca el ratón sobre su lado derecho. Hacer una pequeña incisión vertical en la piel de la parte ventral del cuello con un bisturí o tijeras. Bajo la guía visual, túnel una vía subcutánea aguja de calibre 18 a través de esta incisión ventral hacia la incisión en la parte posterior hecha previamente y enroscar el catéter a través de la aguja para exteriorizar que en el lado ventral.
- Coloca el ratón sobre su espalda. Pasar un hilo 3,0 de nylon detrás de los dientes incisivos superiores del ratón y la cinta hacia abajo a la almohadilla de calefacción. Fije la cabeza en una máscara de la cara para la entrega de oxígeno (2 L / min). Fijar el ratón en una posición estirada con cinta adhesiva por la cola y las dos patas delanteras.
NOTA: Si la anestesia de ketamina-xilazina sola no es suficiente, isoflurano inhalado (0,5 - 1,5%) puede ser entregado durante la cirugía.
- Coloca el ratón bajo el microscopio de disección. En la incisión hecha previamente en el cuello ventral, se burlan suavemente el tejido adiposo y glándulas de distancia con una pinza hasta la vena yugular puede ser visualizado.
- Sin rodeos diseccionar para liberar la vena yugular del tejido conectivo y subcutánea encima del recipiente y alrededor colocando la punta de las pinzas entre la vena y el tejido conectivo y la apertura de las pinzas repetidamente en paralelo con la vena. Como tal, se evitará el daño a la vena.
- Aislar la vena yugular mediante la colocación de pinzas romas bajo la vena. Alimentar a tres trozos de hilo de seda 3.0 bajo la vena, la posición de una pieza proximal a la bifurcación de la vena yugular (ligadura craneal) y una pieza cerca del músculo esternocleidomastoideo (caudal ligadura). Apretar la ligadura craneal y la ligadura caudal para estirar la vena y prevenir el sangrado excesivo mientras que la colocación del catéter. Tes decir, una ligadura floja con el hilo medio para asegurar la fácil fijación del catéter más adelante.
- El uso de micro tijeras, hacer una incisión a lo largo de la vena entre las ligaduras craneal y caudal y lo suficientemente grande para pasar el catéter. Coge el catéter con fórceps, e insertar el catéter 11 mm en la vena. Sin apretar asegurar el catéter por la ligadura de la ligadura media y confirmar la colocación correcta enjuagando suavemente con solución salina estéril.
- Asegurar el catéter por firmemente la ligadura de la ligadura media y caudal alrededor del vaso y el catéter. Tie termina de ligadura caudal y medio juntos para sujetar firmemente el catéter. Asegúrese de que los nudos no ocluyen la vena, por lavado del catéter después de cada nudo hecho. Por último, atar el caudal y ligaduras craneales. Cerrar la incisión con suturas de seda 5,0.
4. La ligadura y punción cecal
- Se practica una incisión en la línea media de 1 cm a través de la piel de la mitad inferior del abdomen con el escalpelo o las tijeras;tener cuidado de no penetrar en la cavidad peritoneal.
- Identificar la línea alba de la musculatura abdominal y hacer una incisión intermuscular para ganar la entrada a la cavidad peritoneal. Localizar el ciego, y el uso de fórceps anatómicas contundentes para aislar el ciego y exteriorizar ella.
- Ligar el ciego en 50% de su longitud con suturas de seda 3,0. Asegúrese de no ligar la válvula íleo-cecal de manera que se mantiene la continuidad intestinal.
- Perforar el ciego con una aguja de calibre 18 por un solo a través de-y-a través de la mitad de punción entre la ligadura y la punta del ciego. Después de retirar la aguja, extruir una pequeña cantidad de heces desde el agujero para asegurar la permeabilidad.
- Volver a colocar el intestino en la cavidad abdominal, y cerrar el peritoneo y la piel con suturas de seda 5,0.
NOTA: En promedio, un nuevo aprendiz requiere de 10 a 15 animales para ser capaz de colocar suavemente el catéter venoso y realizar CLP dentro de 45 min. Después del período de entrenamiento, una anestesia / cirugía relaTed mortalidad del 10% se puede esperar.
5. El tratamiento post-quirúrgico y la reposición de líquidos
- Coloque el ratón en la posición supina y asegurar el catéter al cable de unión con cinta adhesiva. Mover el ratón a una jaula individual. Utilice un soporte con la abrazadera ajustable para sostener el dispositivo de giro 25 cm por encima del ratón y cinta firmemente la parte libre del cable de fijación de metal hasta el punto de la pieza giratoria en rotación.
- Adjuntar una jeringa que contiene la mezcla de coloides y cristaloides equilibradas (1: 4) a la línea venosa para iniciar la reposición de líquidos.
- Coloque la jaula en una temperatura controlada (27 ° C) gabinete animal con 12 h ciclos de luz y oscuridad y empezar la reposición de líquidos por vía intravenosa (10 ml / kg / h) a través de una bomba de infusión de jeringa impulsada precisa. Proporcionar enriquecimiento jaula tal como material de anidación y un bloque de madera.
6. Cuidados Intensivos
- A las 6 h después de la operación, por vía subcutánea inyectar medicamen dolorn y antibióticos (0,3 ml buprenorfina (0,15 mg / kg) y 0,2 ml imipenem (16.67mg / kg)). NOTA: Siguiendo la práctica estándar de medicina de animales de laboratorio, la primera dosis de medicamentos para el dolor se administra antes de la incisión quirúrgica inicial y luego según las indicaciones de las políticas veterinarias de la institución. Las inyecciones subcutáneas se deben inyectar cuidadosamente en el espacio subcutáneo.
- Después de 20 - 24 h de la reanimación con líquidos, reemplazar los cristaloides / coloides de nutrición parenteral total (6,67 ml / kg / h).
NOTA: la nutrición parenteral total administrada (5,8 kcal / 24 h) cubre alrededor de 40% de las necesidades calóricas diarias de ratones, similar a la ingesta calórica precoz de los pacientes en la unidad de cuidados intensivos. - Por vía subcutánea administrar medicación para el dolor y antibióticos (0,6 ml buprenorfina (0,3 mg / kg) y 0,2 ml imipenem (16,67 mg / kg) cada 12 h durante todo el período de enfermedad crítica.
- Compruebe los animales al menos cada 3 h durante el día. Evaluar sufrimiento dando un dolorpuntuación basada en la escala de ratón mueca validado 11. Intensificar la vigilancia de los animales con una alta puntuación de dolor.
7. final del experimento
NOTA: La aprobación de las recomendaciones sobre el nivel de gravedad del modelo y las directrices y políticas para puntos finales humanos deben buscarse desde la ética local de la Directiva de Revisión Institucional para la Investigación Animal.
NOTA: En caso de una línea venosa no funcional tal como el catéter bloqueado, deslocalización del catéter, problemas con la bomba de jeringa, el animal se excluyeron del estudio y se sacrificaron.
- Al final del período experimental, profundamente anestesiar el ratón utilizando una mezcla de 0,03 ml de ketamina (100 mg / kg) y 0,02 ml (13 mg / kg) xilazina. La eutanasia el ratón mediante la retirada de sangre por punción cardiaca. Tienda complemento muestras de tejido congelado de interés a -80 ° C.
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Resultados
ratones C57BL / 6 se hicieron críticamente enfermo como se describe anteriormente. Se realizó dos experimentos para evaluar la supervivencia post-CLP hasta dos puntos de tiempo: la supervivencia hasta el día 5 (n = 15) y la supervivencia hasta el día 7 (n = 22) post-CLP. Las curvas de supervivencia de los dos experimentos no fueron significativamente diferentes (en comparación hasta el día 5), lo que indica la reproducibilidad de la configuración experimental. animales no se encontraro...
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Discusión
Hemos desarrollado un modelo de ratón clínicamente más relevante de la enfermedad crítica, combinando el método de ligación y punción cecal para inducir sepsis con el uso de una línea venosa central para fluidos, medicamentos y administración de nutrientes. Este montaje experimental es reproducible, permite estudiar la fase prolongada de la enfermedad crítica y da como resultado una tasa de mortalidad estable, por este medio que imita la situación clínica humana 1.
Li...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
GVdB, a través de la Universidad de Lovaina (KU Leuven), recibe apoyo a largo plazo para la investigación estructural del Programa Methusalem financiado por el Gobierno flamenco (METH08/07) y posee una Beca Avanzada del Consejo Europeo de Investigación AdvG-2012-321670 del Programa Ideas del séptimo programa marco de la Unión Europea. SET recibió una beca de asistente de investigación de la Fundación de Investigación-Flandes (FWO).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina | Ecuphar | Vetergesic 0,3 mg/mL | |
| C57BL/6 | Janvier labs | C57BL/6JRj | |
| coloides, | Fresenius, Kabi | , Volulyte, 6% | |
| crystalloids | , Baxter | , Plasmalyte, a viaflo | |
| Ethilon 3.0 | Ethicon | F3211 | |
| Imipenem | , MSD, | Tienam 500 mg polvo para líquido inyectable | |
| Isoflurano | Eurovet | Iso-vet | |
| Ketamina | Eurovet | Nimatek 100 mg/mL | |
| LocTite Super glue3 todos los plásticos | Rectavit | 119818 | |
| Mersilk 3.0 | Ethicon | L192 | |
| Mersilk 5.0 | Ethicon | F682 | |
| Microrenathane .025" O.D. x .012" I.D. | Bioseb | MRE-025 | |
| olimel N7E | Baxter | ||
| PE10 - Polietileno .011" x .024" | Instech Solomon | BTPE-10 | |
| PE-50 tubo .023" x.038" | Instech Solomon | BTPE-50 | |
| Roedor Giratorio 20 G | Bioseb | RS-20G | |
| Ropivacaï ne | Astrazenica | Naropin 2 mg/mL | |
| Xilacina | VMD | Clorhidrato de xilacina 2% |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
