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Artículo de método

Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de

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⸱

DOI:

10.3791/55558

⸱

28 de marzo de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la extracción de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus y su posterior análisis por cromatografía de líquidos y espectrometría de masas.

Resumen

En un esfuerzo para frustrar los patógenos bacterianos, anfitriones a menudo limitan la disponibilidad de nutrientes en el sitio de la infección. Esta limitación puede alterar las abundancias de metabolitos clave a los que factores reguladores responden, ajustando el metabolismo celular. En los últimos años, un número de proteínas y ARN han surgido como importantes reguladores de la expresión del gen de virulencia. Por ejemplo, la proteína CodY responde a niveles de aminoácidos de cadena ramificada y GTP y es ampliamente conservada en bajo de G + C bacterias Gram-positivas. Como un regulador global en Staphylococcus aureus, Cody controla la expresión de la virulencia y de genes metabólicos decenas. Se postula que el S. aureus utiliza Cody, en parte, para alterar su estado metabólico en un esfuerzo para adaptarse a las condiciones de nutrientes limitantes potencialmente encontradas en el entorno de acogida. Este manuscrito describe un método para la extracción y el análisis de metabolitos a partir de S. aureus utilizando cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masastrometry, un protocolo que fue desarrollado para probar esta hipótesis. El método también destaca las mejores prácticas que garanticen el rigor y la reproducibilidad, tales como mantener el estado de equilibrio biológico y aireación constante y sin el uso de cultivos continuos quimiostato. Con relación a la USA200 susceptibles a la meticilina de S. aureus aislar UAMS-1 cepa parental, la isogénica mutante Cody exhibió incrementos significativos en aminoácidos derivados de aspartato (por ejemplo, treonina e isoleucina) y disminuye en sus precursores (por ejemplo, aspartato y O -acetilhomoserina ). Estos hallazgos se correlacionan bien con los datos de la transcripción obtenidos con el análisis de RNA-seq: genes en estas vías fueron reguladas entre 10 y 800 veces en el mutante nulo Cody. El acoplamiento de los análisis globales del transcriptoma y el metaboloma puede revelar cómo las bacterias alteran su metabolismo cuando se enfrentan a estrés ambiental o nutricional, proporcionando una visión potencial en los Physcambios IOLÓGICA asociados con el agotamiento de nutrientes experimentaron durante la infección. Tales descubrimientos pueden allanar el camino para el desarrollo de nuevos agentes antiinfecciosos y la terapéutica.

Introducción

Los patógenos bacterianos deben enfrentarse a muchos desafíos en el entorno de acogida. Además de ataque directo por las células inmunes, el anfitrión también secuestra nutrientes esenciales para la supervivencia y replicación bacteriana, generando inmunidad nutricional 1, 2. Para sobrevivir a estos ambientes hostiles, los patógenos bacterianos se despliegan factores de virulencia. Algunos de estos factores permiten que las bacterias para evadir la respuesta inmune; Otros factores incluyen las enzimas digestivas, tales como hialuronidasa, termonucleasa, y lipasa, que pueden permitir a las bacterias para reponer los nutrientes que faltan por el consumo de constituyentes derivadas de tejido 3, 4, 5 secretadas. De hecho, las bacterias han evolucionado los sistemas de regulación que atan el estado fisiológico de la célula para la producción de factores de virulencia 6, 7, hasta class = "xref"> 8, 9, 10.

Un cuerpo creciente de evidencia apunta a Cody como un regulador crítico que une el metabolismo y la virulencia. Aunque primero descubierto en Bacillus subtilis como un represor del gen dipéptido permeasa (dpp) 11, Cody ahora se sabe que se produce en casi todas las bacterias G + C Gram-positivos bajos 12, 13 y regula docenas de genes implicados en carbono y nitrógeno metabolismo 14, 15, 16, 17, 18, 19. En las especies patógenas, Cody también controla la expresión de algunos de los genes de virulencia más importantes 20, 21,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 CodY se activa como una proteína de unión a ADN por dos clases de ligandos: aminoácidos de cadena ramificada (BCAA; isoleucina, leucina, y valina [ILV]) y GTP . Cuando estos nutrientes son abundantes, Cody reprime (o en algunos casos, estimula) la transcripción. Como estos nutrientes se vuelven limitado, se reduce progresivamente la actividad Cody, que resulta en una respuesta transcripcional graduada que rutas de re precursores a través de diversas vías metabólicas conectados a metabolismo central 28, 29, 30.
Cromatografía líquida de Tandem acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) es una técnica poderosa que puede identificar con precisión y cuantificar de molécula pequeña metabolitos intracelulares 31. Cuando se combina con transcriptasaanálisis riptome (por ejemplo, RNA-Seq), este flujo de trabajo analítico puede dar una idea de los cambios fisiológicos que se producen en respuesta al estrés ambiental o nutricional. A continuación, presentamos un método para la extracción de metabolitos a partir de células de Staphylococcus aureus y el análisis posterior mediante LC-MS. Este enfoque ha sido utilizado para demostrar los efectos pleiotrópicos de CodY en S. aureus fisiología.

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Protocolo

1. Preparación de tampón Soluciones

  1. Prepare la solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4) mediante la dilución de una solución madre de 10x PBS a una concentración final de 1x con ultrapura (destilada y desionizada) agua.
  2. Preparar la solución de temple mediante la combinación de 2 ml de acetonitrilo, 2 ml de metanol, 1 ml de ultrapura H 2 O, y 19! L (0,1 mM concentración final) de ácido fórmico.
  3. Prepare LC-MS disolvente A mediante la adición de ácido fórmico (0,2% [v / v] de concentración final) a agua ultrapura.
  4. Preparar LC-MS disolvente B mediante la adición de ácido fórmico (0,2% [v / v] de concentración final) a acetonitrilo.
    NOTA: Todas las soluciones deben prepararse usando los reactivos de la más alta pureza disponible (generalmente de alto rendimiento de grado de cromatografía líquida). Las soluciones deben prepararse fresco antes de cada experimento y se almacenan en hielo antes de su uso.

2. Establecimiento de Crecimiento S. aureus en estado estacionario

  1. Nodriza de S. aureus cepas de interés para el aislamiento en agar tríptico de soja (TSA) de un stock de glicerol congelado. Incubar a 37 ° C durante 16-24 h.
  2. Inocular 4 ml de caldo de soja tríptico (TSB) u otro medio adecuado en tubos de incubación de vidrio estériles con colonias individuales de cada cepa. Incubar inclinada (~ 70 ° de ángulo) con rotación a 60 revoluciones por min (rpm) a 37 ° C durante 16-20 h.
    NOTA: cultivos de una noche son propensos a gradientes de oxígeno cuando se usan métodos estándar, incluyendo los descritos en el paso 2.2, que afectan a la fisiología celular. Por lo tanto, emplear una estrategia de back-dilución múltiple para asegurar el estado de equilibrio biológico (véanse los pasos 2.4-3.2, a continuación).
  3. Use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica de los cultivos de la etapa 2.2 a 600 nm (OD 600). Usar medio estéril como una referencia óptica (en blanco). Diluir estas células a un OD 600 de 0,05 en 50 ml de medio TSB estéril (previamente calentada a 37 ° C) en separada, matraces de 250 mL DeLong.
  4. Incubate los cultivos a 37 ° C en un baño de agua con agitación a 280 rpm.
  5. Cada 30 min, tomar OD 600 mediciones; a medida que aumentan las densidades ópticas, puede ser necesario diluir los cultivos con TSB para que permanezcan dentro del rango de absorbancia lineal del espectrofotómetro.
  6. Cuando los cultivos de la etapa 2.5 a alcanzar un OD 600 de ~ 0,8-1,0, subcultivo ellos en 50 ml de 37 ° C TSB a un OD 600 de 0,01-0,05 y repita los pasos 2.4 y 2.5.

3. Configuración de la muestra Colección

  1. Preparar un lecho de hielo seco triturado en un recipiente apropiado (por ejemplo, el plato de cristal, cubo de hielo, o más fría).
  2. A medida que las densidades ópticas de los cultivos se aproximan al punto de cosecha se desea, añadir 1 ml de solución a un 35 mm sin tratar placa de Petri y pre-enfriar en hielo seco temple para ≥5 min.
    NOTA: El "punto de cosecha deseada" variará en función de los objetivos experimentales. Por ejemplo, si uno fuera a examinar metabolites durante el crecimiento aeróbico, indicadores clave de este estado incluyen la excreción de etilo y re-asimilación del acetato durante la fase de crecimiento post-exponencial 32, 33. En general, este punto debe estar dentro de una etapa de crecimiento específico (por ejemplo, fase exponencial). Los específicos OD 600 valores asociados con esta fase pueden variar entre las diferentes cepas bacterianas y medios de cultivo.
  3. Coloque una frita de filtro de acero inoxidable (enfriado previamente a -20 ° C) en un tapón de goma y colocarlo encima de un frasco de vacío unido a un vacío de la casa o bomba de vacío.
  4. Aplicar el vacío y colocar una membrana de éster de celulosa mixto (0,22 tamaño micras de poro) en la parte superior.
    NOTA: Es crítico utilizar un filtro con un diámetro igual a la de la frita y para centrar correctamente este filtro para asegurar que la muestra se extrae a través del filtro en lugar de sobre el borde. La humectación de la membrana con enfriado con hielo, H 2 O estéril puede ayudarCon el posicionamiento de la membrana.

4. La muestra de la cosecha

  1. A una OD 600 de ~ 0,4-0,5, utilizar una pipeta serológica para eliminar 13 ml de cultivo del matraz y para aplicar la muestra al filtro.
  2. Después de toda la muestra se ha filtrado, lavar inmediatamente el filtro con ≥5 ml de PBS enfriado en hielo para lavar metabolitos asociados medianas.
  3. Desconectar el vacío y el uso de un par de pinzas estériles para quitar el filtro de la frita. Invertir el filtro (-células hacia abajo) en la solución de enfriamiento rápido pre-enfriada.
    Nota: Es importante realizar los pasos anteriores rápidamente (es decir, en cuestión de segundos) y tan pronto como el líquido se ha eliminado para asegurar el enfriamiento rápido de las células, la detención de la actividad metabólica.
  4. Incubar el filtro en una solución de enfriamiento rápido en hielo seco durante ≥20 min.
  5. Utilizando pinzas estériles, invertir el filtro (lado celular up) en la placa de Petri y el uso de una micropipeta para enjuagar las células fuera de tél membrana en la solución de enfriamiento rápido.
  6. Resuspenden las células en solución de enfriamiento rápido y luego transferir la suspensión celular a un tubo de 2 ml resistente a los impactos estéril que contiene ~ 100! L de perlas de sílice 0,1 mm. Almacenar esta en hielo seco o a -80 ° C.

5. Extracción de metabolitos

  1. Descongelar las muestras en hielo húmedo y romper las células en un homogeneizador con cuatro 30 s ráfagas a 6.000 rpm, con 2 min periodos de enfriamiento en hielo seco entre ciclos.
  2. Aclarar los lisados durante 15 minutos en un pre-refrigerado, de microcentrífuga refrigerada a la velocidad máxima (es decir, 18.213 xg en ≤4 ° C).
  3. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.
  4. Usando una micropipeta, transferir una pequeña porción de la muestra a un tubo de microcentrífuga para la cuantificación del contenido de péptido residual en el paso 6; almacenar el resto a -80 ° C.
    NOTA: El volumen de muestra reservado varía, dependiendo del ensayo BCA utilizado en la etapa 6.1. Estamuestra debe ser almacenado en hielo húmedo para su análisis inmediato o se congeló a -80 ° C.

6. del ácido bicinconínico (BCA) Ensayo

  1. Realizar un ensayo de BCA como se recomienda por el fabricante del kit, usando muestras procedentes de la etapa 5.4 para determinar la concentración de péptido residual para cada muestra.

7. LC-MS

  1. Mezclar 75 l de extracto de S. aureus con 75 l de LC-MS disolvente B, preparado en la etapa 1.4.
  2. Vórtice para mezclar y centrifugado a 13.000 xg durante 5 min.
  3. Coloque 100 l de sobrenadante en un vial de cromatografía líquida (LC) y la tapa él. Asegúrese de que no hay burbujas de aire atrapadas en la muestra.
  4. Cargar los viales en el inyector automático LC-MS y LC editar la lista actualizada en el software "Desconectado lista de trabajo Editor".
    1. Rellene la "Nombre de ejemplo" (por ejemplo, de tipo salvaje-1), "Posición de ejemplo" (por ejemplo, P1-A1), "método" (por ejemplo, fórmico Acid-Negativo Método), y (por ejemplo, de tipo salvaje-1) columnas "del archivo de datos". Haga clic en el botón en el botón "Guardar lista de trabajo". Abra el software de "Espectrometría de Masas de adquisición de datos de estaciones de trabajo" y la entrada de la lista de trabajo previamente guardado. Haga clic en el botón "Inicio Lista de trabajo Ejecutar" para iniciar la medición continua de LC-MS.
  5. Separar las muestras en una columna, la columna vincular a un tiempo de vuelo espectrómetro (TOF), y acoplar el espectrómetro de TOF con el sistema LC. Utilice un gradiente de fase móvil de la siguiente manera: 0-2 min, 85% de disolvente B; 3-5 min, 80% de disolvente B; 6-7 min, 75% de disolvente B; 8-9 min, 70% de disolvente B; 10-11.1 min, 50% de disolvente B; 11,1 a 14 min, 20% de disolvente B; y 14,1 a 24 min, 5% de disolvente B; terminar con un período de re-equilibrado de 10 min a 85% de disolvente B y un caudal de 0,4 ml min -1.
  6. El uso de una bomba isocrática, infundir una solución masa de referencia con la carrera para permitir la calibración del eje masa simultánea.
    NOTA: Este pasose basa en el manual de espectrómetro de TOF estándar.
    1. Usar la mezcla de ácido acético y D4 hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxi) fosfazina como la solución masa de referencia para realizar la calibración en tiempo real. Utilice la bomba isocrática con la velocidad de flujo de 2,5 ml min-1 durante la infusión.

8. lotes Corrección de Counts Ion

  1. Designe a cualquier muestra para servir como una muestra de referencia para la corrección por lotes (por ejemplo, de tipo salvaje, replicar 1).
  2. Calcular la suma de los recuentos de iones para todos los metabolitos dentro de la muestra de referencia. Repetir este cálculo para todas las muestras.
  3. Divida el recuento de iones total de cada muestra por el recuento total de iones de la muestra de referencia para generar una relación.
  4. Divida el recuento de iones para cada metabolito dentro de una muestra por la relación de muestra / referencia para obtener un recuento de iones lote corregido para cada metabolito.

9. Péptido Normalización

  1. reivide los valores de recuento de iones de lote corregido para cada muestra obtenida en la etapa 8 por la concentración de péptido determinado con el ensayo de BCA en el paso 6 para producir un valor normalizado para cada metabolito.
    NOTA: Los recuentos de iones, corregido por lotes por lotes normalizados para cada metabolito obtenido en la etapa 9.1 se puede comparar directamente entre cepas y se sometió a análisis estadístico (por ejemplo, una U de Mann-Whitney-test). Alternativamente, un metabolito conocido de ser sin cambios, ya sea por el tratamiento o fondo genético puede ser utilizado como un normalizador para detectar cambios debidos a la metabolito descomposición. La inclusión de una cantidad conocida de L-norvalina o ácido gluraric en el tampón de extracción se puede utilizar para corregir la pérdida durante el procesamiento de la muestra 34.

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Resultados

Hemos analizado piscinas de metabolitos intracelulares en S. aureus durante el crecimiento in vitro en un medio rico y complejo. Como prueba de principio, se compararon los perfiles de metabolitos entre el S. osteomielitis aureus sensible a la meticilina aíslan UAMS-1 (de tipo salvaje [WT]) y una cepa isogénica que carece del regulador global transcripcional CodY (Δ Cody) 26. El estado de equilibrio, se establecieron cu...

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Discusión

Todos los metabolitos de molécula pequeña se conectan entre sí a través de sus orígenes comunes en las vías metabólicas centrales. Durante el crecimiento exponencial, las células bacterianas están en el estado de equilibrio biológico y metabólica, proporcionando una instantánea del estado fisiológico en condiciones específicas. CodY supervisa la suficiencia de nutrientes al responder a ILV y GTP. Como ILV y GTP piscinas gota, la actividad Cody es probable reduce progresivamente, el ajuste de la expresión de sus genes di...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por un NIH Camino a la concesión de la Independencia (GM conceder 099.893) y los fondos de inicio facultad de SRB, así como un proyecto de investigación de Grant (subvención GM 042219). Los proveedores de fondos no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recogida de datos e interpretación, o la decisión de presentar el trabajo para su publicación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material/Equipoa
DeLong Culture Maternal (250 mL)Belco2510-00250
Frasco de Brazo Lateral, 500 mLPyrex5340
Tapón de goma de 3 orificios, #7Fisher14-131E
Acero inoxidable Portafiltros/fritaVWR89428-936
Placa de Petri, 35 mmCorning430588No tratado con cultivo de tejidos
Membrana de éster de celulosa mixta, 0,22 μ m tamaño de poroMilliporeGSWP02500
Tubos resistentes a los impactos, 2 mLUSA Scientific1420-9600
Perlas de sílice, 0,1 mmBiospec Products Inc11079101Z
Homogeneizador Precellys 24Bertin InstrumentsEQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay KitPierce (Thermo Scientific)23235
Columna de hidruro de diamante tipo CCogent Agilent70000-15P-2
Tiempo de vuelo (TOF) de masa precisa LC-MS, serie 6200AgilentG6230B
, serie 1290AgilentG4204A 
Bomba de contenedor, serie 1290AgilentG4220A 
Accionamiento de válvulas, serie 1290AgilentG1107A 
Bomba isocrática, serie 1290AgilentG1310B 
TCC, serie 1290AgilentG1316C 
Muestreador, serie 1290AgilentG4226A 
Termostato, serie 1290AgilentG1330B 
Químico
sojaBecton Dickinson211825
Difco Agar, GranuladoBecton Dickinson214530El medio sólido contiene 1,5% [p/v] de agar
Salina tamponada con fosfato (pH 7,4) 10xAmbionAM9624Diluir fresco a 1x con agua ultrapura
AcetonitriloFisher ScientificA955-500Optima LC-MS
MetanolFisher ScientificA456-500Optima LC-MS; tóxico
Ácido fórmicoSigma Aldrich94318Para espectrometría de masas, 98
%Software
MassHunterAgilentG3337AA
Cepa bacterianaEspecieCepaGenotipo
SRB 337Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1tipo salvaje
SRB 372Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1Δ codY::erm
aLos productos químicos y materiales enumerados son específicos del método descrito y no incluyen productos químicos o suministros de laboratorio estándar.
Bomba cuatrimestral Triptic Caldo de

Referencias

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