Summary
En protokol til høj præcision FRET eksperimenter på det enkelte molekylniveau er præsenteret her. Derudover kan denne metode anvendes til at identificere tre konformationelle tilstande i det ligandbindende domæne af N-methyl-D-aspartat (NMDA) -receptoren. Fastlæggelse af præcise afstande er det første skridt i retning af opbygning af strukturelle modeller baseret på FRET eksperimenter.
Abstract
En protokol om, hvordan man udfører høj præcision interdye distance målinger ved hjælp af Förster resonans energi overførsel (FRET) på single-molekylen niveau i multiparameter fluorescens detektion (MFD) tilstand er vist her. MFD maksimerer brugen af alle "dimensioner" af fluorescens for at reducere fotofysiske og eksperimentelle artefakter og muliggør måling af interdyeafstand med en nøjagtighed på op til ~ 1 Å i stive biomolekyler. Denne metode blev anvendt til at identificere tre konformationelle tilstande af det ligandbindende domæne af N-methyl-D-aspartat (NMDA) -receptoren for at forklare aktiveringen af receptoren efter ligandbinding. Ved sammenligning af de kendte krystallografiske strukturer med eksperimentelle målinger var de enige om mindre end 3 Å for mere dynamiske biomolekyler. At samle et sæt afstandsbegrænsninger, der dækker hele dimensionen af biomolekylerne, ville gøre det muligt at tilvejebringe en strukturel model af dynamisk biomolekyles.
Introduction
Et grundlæggende mål for strukturelle biologistudier er at ophæve forholdet mellem biomolekylære maskineres struktur og funktion. Det første visuelle indtryk af biomolekyler ( fx proteiner og nukleinsyrer) forekom i 1950'erne gennem udvikling af røntgenkrystallografi 1 , 2 . Røntgenkrystallografi giver høj opløsning, statisk strukturel information, der er begrænset af krystalpakningen. Derfor skinner den iboende immobilitet af røntgenstrukturelle modeller biomolekylernes dynamiske natur, en faktor der påvirker de fleste biologiske funktioner 3 , 4 , 5 . Kernemagnetisk resonans (NMR) 6 , 7 , 8 tilvejebragte en alternativ løsning på problemet ved at løse strukturelle modeller i vandige opløsninger. En stor fordelAf NMR er dets evne til at genvinde den indre dynamiske natur af biomolekyler og konformationelle ensembler, hvilket hjælper med at afklare de indbyrdes forhold mellem struktur, dynamik og funktion 3 , 4 , 5 . Ikke desto mindre kræver NMR, begrænset af prøvestørrelse og store mængder af prøve, komplekse mærkningsstrategier for større systemer. Derfor er der et presserende behov for at udvikle alternative metoder inden for strukturbiologi.
Historisk har Forster-resonansenergioverførsel (FRET) 9 ikke taget en vigtig rolle i strukturbiologi på grund af den misforståelse, at FRET giver målinger med lav nøjagtighed. Formålet med denne protokol er at revidere FRETs evne til at bestemme afstande på nanometer skalaen, således at disse afstande kan anvendes til opbygning af strukturelle modeller af biomolekyler. Den første eksperimentelle verifikationAtion af R - 6 afhængigheden af FRET effektiviteten blev udført af Stryer i 1967 10 ved måling af polyproliner af forskellige længder som en "spektroskopisk lineal". Et lignende eksperiment blev udført på enkeltmolekyleniveau i 2005 11 . Polyprolinmolekyler viste sig at være ikke-ideelle, og således blev dobbeltstrengede DNA-molekyler senere anvendt 12 . Dette åbnede vinduet for præcise afstandsmålinger og ideen om at bruge FRET til at identificere strukturelle egenskaber hos biomolekyler.
FRET er optimal, når interdyeafstanden er fra ~ 0,6-1,3 R 0 , hvor R 0 er Förster-afstanden. For typiske fluoroforer, der anvendes i single-molekyle FRET-eksperimenter, er R0 ~ 50 Å. FRET tilbyder typisk mange fordele i forhold til andre metoder i sin evne til at løse og differentiere strukturer og dynamik iHeterogene systemer: (i) På grund af den ultimative følsomhed af fluorescens kan enkeltmolekylære FRET-eksperimenter 13 , 14 , 15 , 16 løse heterogene ensembler ved direkte at tælle og samtidigt karakterisere strukturerne af dets individuelle medlemmer. (Ii) Komplekse reaktionsveje kan direkte dechifteres i single-molecule FRET-undersøgelser, fordi der ikke er brug for nogen synkronisering af et ensemble. (Iii) FRET kan få adgang til en bred vifte af tidsmæssige domæner, der spænder over 10 årtier og dækker et bredt udvalg af biologisk relevante dynamikker. (Iv) FRET-eksperimenter kan udføres under eventuelle opløsningsbetingelser in vitro såvel som in vivo . Kombinationen af FRET med fluorescensmikroskopi muliggør undersøgelsen af molekylære strukturer og interaktioner direkte i levende celler 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , selv med høj præcision 20 . (V) FRET kan påføres systemer med næsten enhver størrelse ( fx polyprolin oligomerer 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV revers transkriptase 26 og ribosomer 27 ). (Vi) Endelig kan et netværk af afstande, der indeholder alle dimensioner af biomolekyler, anvendes til at udlede strukturelle modeller af statiske eller dynamiske molekyler 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .
Derfor kan single-molekyle FRET-spektroskopi anvendes til at udlede afstande, der er nøjagtige nok til at anvendes til distansbegrænset strukturel modellering 26 . Dette er muligt ved at udnytte multiparameterfluorescensdetektion (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , som udnytter otte dimensioner af fluorescensinformation ( dvs. excitationsspektrum, fluorescensspektrum, anisotropi, fluorescenslevetid, fluorescensekvantumudbytte, Makroskopisk tid, fluorescensintensiteterne og afstanden mellem fluoroforer) til præcist og præcist at tilvejebringe afstandsbegrænsninger. Derudover kombineres pulseret interleaved excitation (PIE) med MFD(PIE-MFD) 42 til overvågning af direkte excitationsacceptorfluorescens og for at udvælge enkeltmolekylehændelser, der stammer fra prøver indeholdende en 1: 1 donor-til-acceptorstøkiometri. En typisk PIE-MFD-opsætning bruger topulserede interleaved excitationslasere forbundet til et konfokalt mikroskopkrop, hvor fotonetektion er opdelt i fire forskellige kanaler i forskellige spektrale vinduer og polarisationsegenskaber. Flere detaljer findes i figur 1 .
Det er vigtigt at bemærke, at FRET skal kombineres med beregningsmetoder for at opnå atomistiske strukturelle modeller, der er i overensstemmelse med FRET-resultaterne 26 , 30 . Det er ikke målet med den nuværende protokol at gå over den tilknyttede metode til at opbygge strukturelle modeller med FRET-afledte afstande. Disse fremgangsmåder er imidlertid blevet anvendt i kombination med andre teknikker ( fx røntgenspredning med små vinklerIng eller elektron paramagnetisk resonans), der føder området for integrativ strukturel biologi 43 , 44 , 45 , 46 . Det nuværende mål er at bane vejen for FRET som et kvantitativt værktøj inden for strukturbiologi. Som et eksempel blev denne metode anvendt til at identificere tre konformationelle tilstande i det ligandbindende domæne (LBD) af N-methyl-D-aspartat (NMDA) -receptoren. Det endelige mål er at overvinde ovennævnte begrænsninger og at bringe FRET blandt de integrerende metoder, der anvendes til strukturel bestemmelse af biomolekyler ved at tilvejebringe målte afstande med høj præcision.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PBS buffer forberedelse og kammerbehandling
BEMÆRK: Brug et laboratoriejakke og engangshandsker, når der udføres våde kemiske forsøg. Brug øjenbeskyttelse, når du justerer laseren.
- PBS buffer forberedelse
- Opløs 4,5 g Na2HP04, 0,44 g NaH2P04 og 3,5 g NaCl i 400 ml destilleret vand. Sørg for en pH på 7,5 og steriliser opløsningen ved autoklavering i en væskecyklus i 1 time (afhængigt af autoklavsystemet).
- Tag 15 ml af PBS-opløsningen og bland den med 0,1 g kul. Filtrer blandingen ved hjælp af et almindeligt 20 ml sprøjtefilter med en 0,2 μm porestørrelse . Afsegl og opbevar PBS-bufferen ved stuetemperatur.
- Mikroskop kammeret dækglas behandling
- Tilsæt 500 μl destilleret vand og 5 μl polysorbat 20 nonionisk tensid (se Materialelisten)Til et kammerglas (se Materialelisten) og bland godt. Lad det bløde i 30 minutter. Fjern polysorbat 20-opløsningen og vask kammeret med destilleret vand to gange. Lad det tørre.
BEMÆRK: Kammeret er nu klar til brug.
- Tilsæt 500 μl destilleret vand og 5 μl polysorbat 20 nonionisk tensid (se Materialelisten)Til et kammerglas (se Materialelisten) og bland godt. Lad det bløde i 30 minutter. Fjern polysorbat 20-opløsningen og vask kammeret med destilleret vand to gange. Lad det tørre.
2. DNA-prøvepræparation
BEMÆRK: Brug konstruerede mærket DNA-tråde (se Materialelisten) til oprettelse af dobbeltstrengede DNA (dsDNA) standardprøver. Designede oligoer må ikke have farvestoffer i enden af en polymer for at undgå genstande der kan kompromittere den bestemte afstand. DNA-sekvensen bør vælges til at opføre sig som en stiv krop.
- Tilsæt 1,5 μL af en donormærket DNA-streng og 4,5 μl af en gratis (acceptor-mærket eller ikke-mærket) DNA-streng i et mikrofugerør og bland dem med 24 μl nukleasefrit vand.
BEMÆRK: Afhængigt af blandingen af de udvalgte oligonukleotider, vil følgende prøver blive genereret: nej FRET, loW-FRET eller high-FRET dsDNA'er. - Hybridiser DNA'et ved hjælp af en termisk mixer og følgende fremgangsmåde: 95 ° C i 10 minutter, 90 ° C i 10 minutter, 80 ° C i 10 minutter, 70 ° C i 10 minutter, 60 ° C i 10 minutter, 50 ° C I 10 minutter, 40 ° C i 10 minutter, 30 ° C i 10 minutter, 20 ° C i 10 minutter, 10 ° C i 10 minutter og hold ved 5 ° C.
BEMÆRK: De genererede dsDNA-standarder kan opbevares i en -20 ° C fryser til længerevarende opbevaring eller kan anvendes med det samme.
3. Prøveprøveforberedelse
Bemærk: Ved at starte med rekombinant DNA til ekspressionen af proteinet af interesse i bakteriesystemer er det muligt at mutere de rester, hvorfra afstande skal måles i cysteiner. For at gøre det skal du bruge standard site-directed mutagenese teknikker 47 . For at lette proteinrensning klon det rekombinante og muterede DNA i en vektor indeholdende et oprensningsmærke ( f.eks.En His-tag). Glutamat subunit 1 ligandbindende domæne (LBD) fra NMDA glutamationotrop receptor (GluN1) LBD ( dvs. NMDA GluN1 LBD klonet i pET-22b (+) vektoren) blev anvendt.
- Proteinekspression
- Transform konstruktions-DNA-plasmid i det valgte ekspressionssystem 48 .
BEMÆRK: De følgende trin vil antage, at ekspressionen af et opløseligt protein transformeres i Escherichia coli . Oprensning fra for eksempel transficerede pattedyrceller 49 eller transducerede insektceller 50 er også mulig, og detaljerede trin kan findes andre steder. Sørg for, at den valgte E. coli- stamme er passende for proteinet af interesse. Eksempelvis kræver ekspressionen af proteiner, som indeholder disulfidbroer, en stamme af kompetente celler med et mindre reducerende intracellulært rum (se Materialelisten). - Inokulere en starter <em> E. Coli-kultur ved anvendelse af en steril pipettespids til opsamling af en enkelt transformeret koloni 48 . Sæt det i 100 ml selektivt LB-medium (se Materialelisten) og lad kulturen vokse natten over ved 37 ° C.
- Forbered LB bouillon (se materialelisten). Autoklaver det for at sterilisere.
- Inokulere storskala kulturer af transformeret E. coli ved at tilsætte natten over kulturen til 2 liter selektivt LB-medium i forholdet 1: 500.
- I løbet af de næste par timer vurderer væksten af kulturen ved at overvåge kulturens absorbansaflæsninger (Abs) ved 600 nm, undertiden omtalt som den optiske densitet ved 600 nm (OD 600 ) eller ved anvendelse af en celletæthedsmåler. Bemærk, at aflæsningerne stiger over tid.
- Inducer proteinekspression med en slutkoncentration på 0,5 mM isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG), når kulturen når en OD 600 på 0,7. Shake induceret E. coli ved 20 ° C i 20-24 timer.
- Efter proteininduktion piller E. coli ved at spinde i 20 minutter ved 3.000 xg og 4 ° C. Kassér supernatanten og opbevar E. coli pellet indeholdende det intracellulære protein ved -80 ° C indtil brug.
- Transform konstruktions-DNA-plasmid i det valgte ekspressionssystem 48 .
- Proteinrensning
- Lyse E. coli ved anvendelse af en lysis metode, der vælges ( f.eks. Lydbehandling, fransk tryk, nitrogenkavitation osv. ) 51 .
- Spin ned membranen og celleaffald ved centrifugering af lysatet i 1 time ved 185.000 xg og 4 ° C.
- For et His-mærket protein skal supernatanten påføres en ækvilibreret, nikkelbelastet, immobiliseret metalaffinitetskromatografi (IMAC) søjle ved anvendelse af et fastproteinvæskekromatografi (FPLC) system (se Materialetabellen ) 52 .
BEMÆRK: Equilibreringspuffer til NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCI, 20 mM Tris og 1 mM Glycin, pH 8. Elueringsbuffer til NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCI, 20 mM Tris, 1 mM Glycin og 400 mM Imidazol, pH 8.- Vask IMAC-søjlen med buffer indeholdende en lav mængde (~ 12 mM) imidazol.
- Eliminer proteinet fra IMAC søjlen under anvendelse af en lineær gradient af imidazol fra 12 mM til 400 mM.
- Dialysér proteinet natten over i ækvilibreringsbuffer uden imidazol 53 ved at placere eluatet fra trin 3.2.3.2 i dialyserør og nedsænke det i ækvilibreringspufferen under kontinuerlig omrøring i 2-3 timer. Gentag mindst en gang til.
BEMÆRK: Trin 3.2.3-3.2.6 antager rensningen af et His-mærket protein. Hvis du renser gennem en anden metode, skal du justere protokollen i overensstemmelse hermed. - Kvantificer proteinmængden ved at tage absorbansen ved 280 nm af det dialyserede protein og ved anvendelse af Beer's Law ( Absorbance unit = E Lc , hvor ε Er udryddelseskoefficienten (M -1 cm -1), Der kan hentes her 54 ; L er lysvejslængden (cm); Og c er proteinkoncentrationen (M)).
BEMÆRK: Forskellige proteinkvantifikationsassays er tilgængelige, herunder Bradford-assayet og bicinchoninsyreassayet. Begge giver nøjagtige resultater.
- Proteinmærkning
- Tilsæt donor (maleimidreaktivt cyan-grønt farvestof) og acceptor (maleimidreaktive farfarfarvestof) fluoroforer til det oprensede protein ved et 1: 1: 8 protein: donor: acceptor molforhold.
- Inkuber protein- og fluoroforblandingen på is i 30 minutter. Længere inkubationstider er mulige.
- Pak en 0,5 ml Ni-Nitrilotrieddikesyre (Ni-NTA) agarosekolonne (se Materialelisten) og ækvilibrere den ved hjælp af samme ækvilibreringsbuffer som i trin 3.2.3, mens proteinet inkuberes.
BEMÆRK: Hold mængden af ladet protein i overensstemmelse med harpiksbindende kapacitet. - Efter 30 minKubation, indlæs protein / fluoroforblandingen på søjlen fremstillet i trin 3.3.3 og rens ved tyngdekraftstrømmen.
- Vask overskydende fluorofor med 5 ml ækvilibreringsbuffer.
- Eluk det mærkede protein ved tyngdekraft fra søjlen fire gange med 0,5 ml elueringsbuffer. Fordi proteinet allerede er blevet oprenset fra andre proteiner, er ingen gradient nødvendig.
- Tjek hvert eluat med et UV-Vis-spektrometer for at identificere, hvilken fraktion der indeholder det mærkede protein. Scan absorbansen fra 230-700 nm for at sikre, at absorbansen spidser fra proteinet (280 nm), og hver fluorofor (493 nm for den cyangrønne fluorophor og 651 nm for den farfarte fluorophore) er synlige i eluat.
BEMÆRK: Proteinet vil typisk eluere i fraktion 2. - Ekkilibrere en afsaltnings søjle (se Materialetabellen ) med trækulbehandlet PBS (trin 1.1).
- Indsæt det mærkede protein på afsaltningskolonnen ved hjælp af tyngdekraftstrømmen.
BEMÆRK: Opbevar mængden af ladet protein i overensstemmelse med den valgte desalting-søjlekapacitet 55 . - Elute ved anvendelse af 3,5 ml kulbehandlet PBS ved hjælp af tyngdekraftstrømmen og opsaml 0,5 ml fraktioner af eluatet.
- Brug et UV-Vis spektrometer til at scanne absorbansen af hvert eluat fra 230-700 nm for at identificere hvilken fraktion der indeholder mærket protein.
BEMÆRK: Trin 3.3.8-3.3.11 tjener som et bufferudvekslingstrin. Andre protokoller, der tjener dette formål, er også mulige ( fx omfattende dialyse). Alternativt kan man gå direkte til trin 3.3.8 fra trin 3.3.2.
4. Målinger, der er nødvendige i ensembleforhold (i kuvette)
- Bestemmelse af Förster-konstanten
- Scan f D , fluoroforefluorescensemissionen (cps), i et fluorimeter ved at spænde donoren ved 15 nm til sin maksimale absorbansbølgelængde for at få den fulde emuleringIssion spektrum. Overvåg emissionen, der begynder 5 nm efter excitationsbølgelængden og slutter 150 nm senere. Brug magiske vinkelforhold ved at indstille emissionspolarisatoren til 54,7 ° Og excitationspolarisatorerne til 0 ° 56 .
BEMÆRK: For den donorfluorfor, der anvendes her, forekommer Abs maksimum ved 490 nm; 475 nm anvendes som excitationsbølgelængden, og emissionen fra 480-650 nm overvåges. For acceptoren forekommer Abs maksimum ved 645 nm; 630 nm anvendes til excitationsbølgelængden, og emissionen fra 635-735 nm overvåges. - Brug fluorimetret til at udføre en excitationssøgning af acceptorfluorforen (Abs A ) i området fra 400-700 nm og anvend magiske vinkelbetingelser ved at indstille emissionspolarisatoren til 54,7 ° Og excitationspolarisatorerne til 0 ° 56 . Indstil emissionsmonokromatoren til 15 nm efter maksimalemissionens bølgelængde. Normaliser til maksimal exciTationsværdi.
- På udgivne tabeller finder du udløserkoefficienten for acceptoren, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , eller brug værdier fra producenten.
BEMÆRK: Værdien offentliggjort for acceptorfluorophoren anvendt i dette manuskript er ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 . - Beregn spektraloverlapningen ved hjælp af J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , hvor f D , Abs A og ε A er defineret ovenfor λ og er bølgelængden (nm). Brug et regneark til at liste i alle kolonner alle de bølgelængdeafhængige værdier, der er opnået i trin 4.1.1-4.1.3. Juster dem efter bølgelængde. Udfør opsummeringen fra den mindste bølgelængde af donoremissionen (λ min ) til den maksimale bølgelængde af acceptorabsorbancenE (λ max ).
- Beregn Förster-konstanten (R o ) ved hjælp af følgende formel R o 6 = 8,79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , hvor J er spektral overlapningen tidligere beregnet i trin 4.1.4, K 2 Er orienteringsfaktoren, Φ F, D Er fluorescensekvantumudbyttet af donorfluorforen, og n er brydningsindekset for mediet, hvori fluoroforet er beliggende.
BEMÆRK: Brug n = 1.33 (hvis vandig buffer anvendes) og K 2 = 2/3. - Find quantum udbyttet værdi af donor fluorophore (Φ F, D , Miljøafhængige) på offentliggjorte tabeller (se Reference 57) og brug værdien af spektraloverlapningen opnået i trin 4.1.4 for at beregne den endelige værdi af Förster-konstanten ved hjælp af eqUation fra trin 4.1.5.
BEMÆRK: Hvis kvanteudbyttet ikke er tilgængeligt, skal du følge trin 4.2 nedenfor for at beregne det. I dette tilfælde skal du bruge Φ F, D = 0.8, hvilket svarer til en donorens levetid τ D, r = 4,0 ns.
- Scan f D , fluoroforefluorescensemissionen (cps), i et fluorimeter ved at spænde donoren ved 15 nm til sin maksimale absorbansbølgelængde for at få den fulde emuleringIssion spektrum. Overvåg emissionen, der begynder 5 nm efter excitationsbølgelængden og slutter 150 nm senere. Brug magiske vinkelforhold ved at indstille emissionspolarisatoren til 54,7 ° Og excitationspolarisatorerne til 0 ° 56 .
- Bestemmelse af fluorescens kvantumudbytte
BEMÆRK: Følgende procedure forudsætter kun dynamisk slukning. For at overveje statisk slukning henvises til Reference 56. PIE-MFD-eksperimenter er imidlertid også nyttige til bestemmelse af kvantudbyttet, selv i tilfælde af statisk slukning (se resultaterne).- Vælg en referencefluorofor med tilsvarende absorptions- og emissionsprofiler for både acceptoren og de donorfluorforer, for hvilke kvantudbyttet (Φ r ) er blevet bestemt.
BEMÆRK: For donoren, Φ r = 0,8 og τ r = 4 ns, mens for acceptoren, Φ r = 0,32 og τ r = 1,17 ns, wDer svarer til Φr og τ for de cyan-grønne fluorfor- og de farfar-fluorofore-mærkede oligonukleotider, henholdsvis 57 . - Måle det tidsopløste fluorescensforfald (f (t)) ved hjælp af den tidskorrelerede single-photon counting (TCSPC) metode under magisk vinkelforhold.
- Tilpas fluorescensforfaldet med en mono- eller multi-eksponentiel henfaldsfunktion i form af f (t) = Σ i x i e -t / τ i , hvor x i Er befolkningsfraktionen og τ i Er befolkningsfluorescensens levetid.
- Beregn artens gennemsnitlige levetider, <τ> x = Σx i τ i , Hvor x i Er befolkningsfraktionen og τ i Er befolkningsfluorescensens levetid.
- Brug thE formel Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r At beregne fluorescensekvantumudbyttet af donorfluorforet ved at plugge fluorescenslevetiden og kvantumudbyttet af referencen såvel som fluorescenslevetiden for donorfluorforen.
BEMÆRK: Denne metode forudsætter dynamisk slukning. For andre Φ F, D- bestemmelser, følg Lakowicz 56 .
- Vælg en referencefluorofor med tilsvarende absorptions- og emissionsprofiler for både acceptoren og de donorfluorforer, for hvilke kvantudbyttet (Φ r ) er blevet bestemt.
5. Eksperimentjustering for PIE-MFD-enkeltmolekyledetektion (SMD)
BEMÆRK: Det er bedre at slukke lysene, når der tages målinger.
- Udstyrsjustering (Figur 1)
BEMÆRK: En hjemmebaseret MFD-opsætning afbildet i figur 1 , med to pulserende lasere og 4 detektions kanaler i et inverteret mikroskopkrop, anvendes til dette eksperiment. Der er lignende kommercielle systemer.- Tænd for 485 nm og 640 nm lasere og alle detektorer i MFD-opsætningen. Åbn den software, der styrer TCSPC-overtagelsen og laserne. Sørg for, at laserrepetitionshastigheden er 40 MHz.
- Indstil den 485 nm pulserede laserkraft til 60 μW ved et billedplan for 60 x 1,2 NA vanddypningsmål og 640 nm pulseret laserkraft til 23 μW i pulseret interleaved excitation mode (PIE-MFD) 42 .
BEMÆRK: For at indstille PIE-MFD, forsinkes de to laserimpulser i laserstyringssoftwaren. Til 485 nm laser excitation er detektion TCSPC kanaler (TAC kanaler) 1-12.499 ("prompt" kanal). Til 640 nm laser excitation er detektionskanalerne TACSPC (TAC-kanaler) 12,499-50,000 ("forsinkelseskanal"). - Tilsæt objektiv nedsænkning væske (en dråbe dobbeltdestilleret vand) mellem objektivet med mikroskop og et glasglas. For at sikre, at billedplanet er inde i løsningen og langt fra glasfladenCe, drej justeringsknappen en og en halv omgang efter at have fundet det andet lyse brændpunkt på grund af lasernes afspejling ved glas-væske-grænsefladen.
- Tilsæt 1 μl 100 nM rhodamin 110 til 50 μl destilleret vand til midten af dækglaset. Sørg for, at løsningen også er i centrum for mikroskopets mål.
- Juster pinhole (størrelse: 70 μm) positioner (x og y retning en ad gangen) under overvågning af fotonantalet på overtagelsessoftwaren for at maksimere antallet af registrerede fotoner.
- Standard måling SMD (arbejde i et mørkt rum)
- Brug prøven fra trin 5.1.4 og registrer 120 s af tællehastigheden ved at klikke på "Start" -knappen på det tidsmærkede tidsopløst (TTTR) kontrolpanel i "* .ht3" format 58 på overtagelsessoftwaren.
- Beregn offline fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( dvs. FCS-måling) til bestemmelse af den karakteristiske diffusions-tid, antallet af molekyler i det konfokale volumen, tripletstatskinetikken og den molekylære lysstyrke 62 .
- Åbn softwaren til FCS (Kristine, MFD suite). Vælg de eksperimentelle indstillinger ved at klikke på "Valg" -> "Vælg Indstil." Vælg en fil med lignende eksperimentelle indstillinger, og klik på "Få parametre fra fil" for at læse overskriftsoplysningerne på filen.
- Vælg "Operate" -> "Correlate" for at udføre FCS.
BEMÆRK: Sørg for, at kanalnumrene er korrekt angivet, og at "TAC Gate" (TCSPC-kanaler) er markeret for at vælge i overensstemmelse hermed de hurtige eller forsinkede kanaler. - Vælg "Operate" -> "Global Fit of Correlation Curves" for at åbne den tilpassede rutine. Brug "ligning # 24" på softwarenE og klik på "start".
BEMÆRK: Ligning 24 på softwaren beskriver autokorrelationsfunktionen (Gc) af frit diffuserende fluorescerende molekyler over en tredimensionel Gaussisk belysningsprofil, såsom 61 :
Hvor N er det gennemsnitlige antal molekyler i detekteringsvolumenet, er x T fraktionen af molekyler, der udøver triplet-statskinetik med den karakteristiske tid t T , tc er korrelationstiden, t diff er diffusionstiden relateret til den geometriske Parameter ω og ω beskriver den gaussiske belysnings profil. Efter pasningen tager du mærke til diffusionstiden og antallet af molekyler i det konfokale volumen.
- Tilsæt 10 μl 100 nM Rhodamine 101 i 50 μl destilleretVand og bland godt. Placer denne blanding oven på dækglaset og sørg for, at dråben er i midten af objektivlinsen. Klik på "start" knappen på TTTR kontrolpanelet for at optage 120 s af data i TTTR format.
- Tilsæt 1 μL 100 nM farrød fluorofor i 50 μl destilleret vand og bland godt. Placer denne blanding i midten af objektivlinsen. Klik på knappen "Start" og registrer 120 s data i TTTR-format.
- Anbring 50 μl destilleret vand i midten af objektivlinsen. Klik på "Start" knappen og optag 300 s data i TTTR format.
- Anbring 50 μl PBS-buffer i midten af objektivlinsen. Klik på "Start" knappen og optag 300 s data i TTTR format.
- Tag 1 μL af blandingen fra trin 5.1.4 og bland med 50 μl destilleret vand. Placer denne blanding på coverglaset. Først klikker du på knappen "Start" og samler 10 s data i TTTR-tilstand. Analyser derefter TTTR-tilstandsfil ved hjælp af Burst Integration Fluorescence Lifetime (BIFL) analyse software (Paris, MFD suite), som beskrevet i trin 5.3.
BEMÆRK: Bekræft antallet af udbrud pr. Sekund fra burstudvalget og analyseprogrammet 26 , 61 . Hvis udbrudsniveauet er omkring 35 hver 10 s, er det hensigtsmæssigt at måle enkeltmolekyler. - Fortsæt med at optage tællingsraten i TTTR-format i 1,5 timer ( dvs. TCSPC ved SMD) til behandling som en enkeltmolekylemålingsstandard.
BEMÆRK: På grund af den store filstørrelse kan du dele rå "* .ht3" filer i mindre filer for at indlæse og behandle dem ved hjælp af BIFL.
- Analyse af standardprøver ved hjælp af BIFL
- Åben BIFL-softwaren (Paris).
- Vælg opsætningen for PIE i vinduet "bekræft opsætning" automatisk og læs overskriften ved at vælge filen med lignende eksperimentelle indstillinger. Klik på "Få parametre fraM-fil. "Klik på" OK ". Bemærk at pop-up-vinduet lukkes og er integreret i Paris-fronten. Klik på" OK "under" Næste ".
- Vælg de filer, der skal analyseres ved at klikke på "Vælg" på "Data Path Array" for at vælge måling, der skal analyseres.
- Klik på "Green scatter" (for en vandmåling), "Green BG" (for en buffermåling), "Green thick" (for en 2 nM Rhodamine 110 måling), "Red scatter" (til en vandmåling) Rødt tykt "(til en 20-nM Rhodamine 101 måling)," Gul scatter "(til vandmåling)," Yellow BG "(til buffermåling) og "Yellow Thick" (til en 2 nM farrød fluorophore måling).
- Klik på "OK" under "Næste".
BEMÆRK: Den "grønne" kanal svarer til signalet fra de grønne detektorer i "prompt" TCSPC-kanalerne. Det4 "Rød" kanal svarer til signalet fra de røde detektorer i "prompt" TCSCP-kanalerne. Den "gule" kanal svarer til signalet fra de røde detektorer i forsinkelses-TCSPC-kanalerne.
- Klik på "Juster" ved siden af "Data cut Burstwise" for at justere parametre for enkeltmolekyler. I det nye pop-up-vindue vælges enkeltmolekylehændelser med to standardafvigelser fra den gennemsnitlige ankomsttid for interphoton ("dt") ved at ændre interphoton-ankomsttidspunktet under "Threshold" og det mindste antal fotoner pr. Enkeltmolekylhændelse under "min . #. " Klik på "Return" for at lukke pop op-vinduet. Klik på "OK" under "Næste".
BEMÆRK: Tærsklen i ms-enheder afhænger af baggrundsrenten. Det typiske minimum antal fotoner, der anvendes, er 60. - Juster den oprindelige fluorescenslevetid "Farvepasningsparametre" ( f.eks . Fra, til og konvolvering) til genereringenD fluorescens henfaldsparametre på "Grøn", "Rød" og "Gul" farver. I det samme vindue skal du justere værdierne "fra" og "til" for "prompt" og "forsinkelse". Klik på "Return" for at lukke pop op-vinduet. Klik på "OK" under "Næste".
BEMÆRK: Sørg for, at afkrydsningsfeltet 2-farve excitation er markeret. "Fra" og "til" svarer til begyndelses- og slutbakkerne på fluorescensforfaldshistogrammet (TAC-kanalnummer). Hvis de indledende pasformparametre vælges korrekt, tilføjes en pasningsfunktion til fluorescensforfald på hver kanal. - Vælg placeringen på harddisken for at gemme alle behandlede ascii-filer i en overordnet mappe.
BEMÆRK: Paris behandler alle udvalgte udbrud og opretter flere ASCI-uddatafiler, end det kan bruges af andre programmer til visualisering ( f.eks. Margarita MFD-suite).
6. dsDNA Standards and Sample Measurements
- Tilsæt 500 μl PBS buffer til et kammerglas og læg dråbe destilleret vand mellem kammeret og objektivlinsen. Klik på "Start" knappen på kontrolpedalen og saml 5 min data i TTTR-tilstand til brug for analyse.
- Tag en lille mængde (normalt omkring 0,1 μL, koncentration omkring 1 μM) af dsDNA-standarden, tilsæt den til PBS-bufferen og bland godt. Saml først 10 s data ved at klikke på "Start". Kontrollér derefter burst for at få 35 burst per 10 s (som i trin 5.2.7 og 5.3). Endelig indsaml> 2 h data i TTTR-format, som beskrevet ovenfor.
- Analyser de indsamlede data for dsDNA-prøverne, som i trin 5.3.3.
- Visualiser bursthistogrammerne ved hjælp af MFD-pakken (Margarita) og vis FRET-effektiviteten versus <τ D (A) > f eller F D / F A versus <τ D (A) > f .
- Åbn tHan Margarita software og vælg "File" -> "Importer alle *. ?? 4 og *. Mti filer." Vælg den overordnede mappe, der indeholder forskellige undermapper.
- Vælg de parametre, der skal visualiseres ved at klikke ved siden af "X" (abscissa) af et af parametrene afledt fra Paris ( f.eks. Tau green eller <τ D (A) > f ); Gentag dette også for ordinaten "Y" for at vælge den ønskede parameter for at visualisere ( f.eks. FRET-effektivitet, F D / F A eller S PIE PIE).
BEMÆRK: I dette tilfælde korrigerer FRET-effektiviteten, F D / F A eller S PIE for korrekt baggrundstælling i de grønne, røde og gule kanaler; For kvanteudbytter fra donor og acceptor For detekteringseffektivitetsforholdet (g G / g R ); Og for crosstalk (α). Her er g G / g R = 3,7 og a = 0,017, afhængigt af instrumentet. Baggrundsrenten satserAfhænger af den anvendte buffer, og kvantudbytteværdier er tidligere bestemt. - Tilføj en FRET-linje ved at åbne vinduet "Overlay Equation" ved at klikke på "Display" -> "Overlay Equation." Vælg den statiske FRET-linje i pop op-menuen. Vælg de rigtige donorlevetider og kvantudbytteparametre for at generere den rette FRET-linje.
BEMÆRK: FRET linjer til korrelering af forskellige FRET indikatorer kan genereres.
- Bestem korrektionsfaktoren for acceptor excitationen ved donor excitationskilden (β) ved hjælp af støkiometri parameteren ved at vise FRET effektivitet versus støkiometri (S PIE ) i Margarita (ligning 1 nedenfor).
BEMÆRK: β er valgt således, at donorprøven har en top ved S PIE = 1,0 i støkiometrisk skalaen; Den eneste acceptorprøve skal have en støkiometri på S PIE = 0,0, og dsDNA'et med begge mærker skal have en støkiometri på S PIE ~ 0,5. <BR /> BEMÆRK: Instrumentet er nu klar, og det er muligt at måle FRET-mærkede prøver. - Mål og analyser FRET-mærkede prøver fremstillet i afsnit 3 ved at følge trin 6.3-6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I typiske smFRET-eksperimenter, der anvender en MFD-opsætning (laserlinier: 485 nm ved 60 μW og 640 nm ved 23 μW, sektion 5.1) fortyndes fluorescensprøven til en lavpikomolær koncentration ( 10-12 M = 1 pM) og anbringes I et konfokalmikroskop, hvor en subnanosekund laserpuls exciterer mærkede molekyler, som diffunderer frit gennem et excitationsvolumen. Et typisk konfokalt volumen er <4 femtoliters (fL). Ved sådanne lave koncentrationer detekteres kun enkeltmolekyler en ad gangen. Den udsendte fluorescens fra de mærkede molekyler opsamles gennem målet og filtreres rumligt ved anvendelse af et pinhul. Dette trin definerer et effektivt konfokalt detektionsvolumen. Derefter deles signalet i parallelle og vinkelrette komponenter ved to (eller flere) forskellige spektrale vinduer ( fx "grøn" og "rød"). Hver foton detektor kanal er så koblet til tidskorreleret single-foton tælling (TCSPC) Elektronik til dataregistrering ( figur 1 ).
Efter at have fulgt kalibrering af MFD-opsætningen, kan en procedure opsummeret i tabel 1 (trin 5-6), måling af dsDNA-standarderne, startes. Derefter bruges PIE-MFD til at analysere flere parametre, såsom gennemsnitlig makrotid, fluorescens levetid, burst-integreret anisotropi, forholdet mellem signalet i grønt over signalet i rødt, udbrudstid i promptkanalen (T (G + R) | D ), udbrudsvarighed i den forsinkede kanal (T R | A ) og andre 65 , 66 ( Figur 2 ). Vigtigt i denne analyse er støkiometriparameteren ( S PIE ), defineret som:
Hvor F G | D = F D , F R | D = F A og F R | EN Er baggrundskorrigerede fluorescensintensiteter 63 . F.eks. F G | D = I G | D - < B G >, Hvor jeg G | D Er den detekterede intensitet i den grønne kanal fra donoren og < B G > Er den gennemsnitlige baggrundstællingsrate på den grønne kanal. Lignende korrigeringer udføres for acceptorens fluorescens fra direkte excitation af acceptoren ( FR | A ) og til den sensitiverede emission af acceptoren ( FR | D ). I ligning 1 er α korrektionsfaktoren for donor-fluoRescence crosstalk i acceptor kanal; ß er korrektionsfaktoren for acceptor excitation af donor excitationskilden; Og y , hvor
Er en funktion af donor- og acceptorkvantumudbyttet, Φ F, D Og Φ F, A , Henholdsvis og af detekteringseffektiviteterne på de grønne og røde detektorer, g G og g R. Ved hjælp af S PIE er det muligt at kalibrere de korrekte instrumentelle faktorer, såsom α, β og γ , for at tilfredsstille S PIE = 1 til den eneste donor-kun mærkede prøve, S PIE = 0 for den eneste acceptorprøve og S PIE = 0,5 for FRET-prøven. Alternativt detEr muligt at bruge:
At udlede kvantudbyttet af en anden prøve, idet kvantudbyttet af en prøve ( 
) Er kendt, og at 
og 
Bestemmes ud fra PIE-MFD-eksperimentet. I dette tilfælde antages det, at kvantudbyttet af high-FRET dsDNA er 0,32, og kvantudbyttet af low-FRET dsDNA'et bestemmes. Grunden til at gøre denne procedure er, fordi det er blevet bemærket, at S PIE er forskellig for både low-FRET og high-FRET prøver, selv om begge har en donor på samme sted og kun en acceptor, men ved diffErent placeringer. Efter bestemmelse af det korrekte kvantudbytte af standardprøverne, som beskrevet i ligning (3), var FRET-effektiviteten ( E ) versus < τ D ( A ) > f Og F D / F A versus < τ D ( A ) > f repræsentationer anvendes til yderligere evaluering. Det parametriske forhold mellem FRET-effektiviteten ( E statisk ), FD / FA og < τ D ( A ) > f Parametre er beskrevet ved følgende sæt af ligninger (ligning 4):
Her, F D | D er donorfluorescensen detekteret i donoren eller den grønne kanal; F A | D Er den acceptor-sensibiliserede emission; 
Er donorfluorescensens levetid i fravær af acceptoren; Og < τ D ( A ) > x Er artens gennemsnitlige levetid, som er relateret til fluorescensens gennemsnitlige levetid med et empirisk polynom 
56 , 57 . Disse ligninger er kendt som de statiske FRET linjer 57 , 67, fordi linjerne skal krydse begge populationer lige så godt i fravær oF dynamik ( figur 3 ).
Sidst kommer analysen af FRET effektivitetshistogrammer ( Figur 4 ) ved anvendelse af sandsynlighedsfordelingsanalyse (PDA) for de to dsDNA-prøver 68 , 69 . PDA er blevet brugt til at modellere smFRET histogrammerne med høj nøjagtighed 57 . Oplysningerne om enkelt- eller multistatiske arter kan opnås fra et enkelt histogram. Efter tilpasning af formen af den forventede fordeling til de opnåede forsøgsdata kan afstanden mellem donoren og acceptoren afsløres. Kort sagt beregnes FRET-effektiviteten eller F D / F A- fordeling ved først at opnå sandsynligheden for at observere en bestemt kombination af fotoner indsamlet i "grønne" ( G ) og "røde" ( R ) detektionskanalerne Givet en vis tid-vind ow; Brug ligning 5:
Her opnås fluorescensintensitetsfordelingen P ( F ) fra den totale signalintensitetsfordeling P ( S ) under forudsætning af, at baggrundssignalerne BG og BR fordeles i overensstemmelse med Poisson-fordelinger, P (BG) og P ( P) B R ), med kendte gennemsnitlige intensiteter for baggrundstælling, < B G > og < B R >. Den betingede sandsynlighed P ( FG , F R | F ) er sandsynligheden for at observere en bestemt kombination af grønne og røde fluorescensfotoner, FG og FR , for en given FRET-tilstand.
PDA-analyse viser, at interdyeafstanden for high-FRET dsDNA er < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å, mens for low-FRET dsDNA, Afstanden < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. I forhold til de forventede afstande ved hjælp af FRET-positionerings- og screeningssystemet (FPS) 26 var en forventet interdyeafstand < R DA > E , AV (HFRET) = 44,7 Å Fundet som afledt ved hjælp af FPS for high-FRET dsDNA og < R DA > E , AV (LFRET) = 59,1 Å for low-FRET dsDNA. AV står for den tilgængelige volumenberegning indlejret i FPS værktøjssæt. AV er en grov- Kornet Monte Carlo-simulering, hvor fluoroforer repræsenterer tre radii hårdkugle modeller forbundet med et fastgørelsessted i biomassenOlecule med en fleksibel forbindelseslinker 26 , 57 . En korrektion for kvantudbyttet for low-FRET dsDNA er påkrævet, baseret på den målte S PIE . Under disse forhold er det muligt at opnå en aftale på ~ 1 Å mellem forsøgsværdien og forventet værdi fra AV-simuleringerne.Herefter måles NMDA GluN1 LBD. NMDA-receptoren (NMDAR) er en heteromer, ikke-selektiv kationskanal, der kræver binding af glycin og glutamat til gating 70 . LBD'en, som har en clamshell-lignende struktur, er kendt for at vedtage en åben clamshell og en lukket clamshell-lignende konfiguration ved ligandbinding baseret på krystallografiske informationer 71 , 72 . For MFD-eksperimenter blev NMDA GluN1 LBD muteret ved Ser507 og Thr701 (fuld længdesekvens) på modsatte sider afKløften, som tidligere beskrevet. Det blev derefter mærket under anvendelse af FRET-paret af en cyangrøn fluorofore og en farrød fluorofor (se Materialelisten) med en R 0 på 52 Å. Denne konstruktion blev anvendt til at studere bevægelsen af det ligandbindende domæne uden kompleksiteten forbundet med at arbejde med en solubiliseret receptor. Ved anvendelse af denne konstruktion blev der fundet mindst tre konfigurationer af LBD. Det blev foreslået, at en konformationsselektionsmekanisme selektivt befolket en af de identificerede populationer på ligandbinding 73 . I den inaktiverede form eller i nærvær af antagonisten 5,7-dichlorokynurensyre (DCKA) udforskes for det meste mellem-til-lav-FRET-tilstande med en længere donorfluorescenslevetid og et større donor-til-acceptor fluorescensforhold Ved FD / F A = 3,3 ( Figur 5A ). Dette er i overensstemmelse med stabiliseringen af en åben kløftkonformation.PDA og tidsvinduesanalyse blev brugt til at identificere tre konfigurationer, som LBD kan vedtage (HF) (< R DA > E = 33,9 Å), medium-FRET (MF) (< R DA > E = 45,8 Å ) Og low-FRET stater (LF) (< R DA > E = 55,8 Å)). Imidlertid blev for det meste befolkningen mellem medium-FRET og low-FRET befolket. Dette tyder på, at high-FRET er den tilstand, der fører til aktiveringen af NMDAR. Det er værd at bemærke, at eksperimentelt afledte afstande og dem, der er afledt af FPS ved anvendelse i silico- mærkning og ved anvendelse af de krystallografiske oplysninger (Protein Data Bank Identification (PDBID): 1PB7 og 1PBQ) blev sammenlignet. Det blev konstateret, at interdyeafstanden for medium-FRET og low-FRET populationerne var < R DA > E , AV = 48,7 Å og 54,2 Å for begge strukturer ( Figur 5B). Den største afvigelse på 2,9 Å blev fundet i medium-FRET-tilstanden. Ved overvejelsen af distributionens usikkerhed, fra antagelsen om K 2 = 2/3, er der en maksimal fejl på 2,5% i den målte afstand. Kort sagt kan man konkludere, at det er muligt at nå Angstrom-nøjagtighed på eksperimentelt bestemte afstande.
Figur 1: Eksperimentel opsætning og data registrering for PIE-MFD. ( A ) En typisk multiparameterfluorescensdetekteringsopsætning er vist og består af fire detektorer der dækker to forskellige spektrale vinduer. Detektorer er forbundet med den tidskorrelerede single-photon counting (TCSPC) elektronik. ( B ) I TCSPC identificeres hver foton ved tre parametre: (i) mikro-tid eller tid efter excitationspulsen; (Ii) makro-tid eller nummeretAf excitationsimpulser fra forsøgets begyndelse; Og (iii) kanalnummer. Disse tre parametre er nødvendige for off-line analyse. ( C ) Enkeltmolekyler diffunderer frit gennem det konfokale volumen, og fotoner udsendes, hvilket efterlader et fotonstryk som en funktion af tiden. ( D ) Hver valgt brist er monteret i overensstemmelse hermed og anvendes til visning af flerdimensionale histogrammer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Burst-analyse ved anvendelse af forskellige fluorescensparametre. ( A ) FRET effektivitet versus makrotid, ( B ) FRET effektivitet versus T (G + R) | D - T R | A og ( C ) FRET effektivitet versus S PIE forLow-FRET eller 15 bp dsDNA. T (G + R) | D er sprængvarigheden i hurtigkanalen, og T R | A er sprængvarigheden i den forsinkede kanal (T R | A ) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: F D / F A og levetid for donoren versus FRET effektivitet. Todimensionelle histogrammer til repræsentation af FRET-effektivitet ( A ); Forholdet mellem donor over acceptorfluorescens, FD / FA, ( B ); Og donoranisotropi r D ( C ) i forhold til donorens gennemsnitlige fluorescenslevetid i nærvær af acceptor < τ D ( A ) > f . Den bestemte korrektionPå faktorer er: < B G > = 0,64, < B R > = 0,37, P = 0,08 (fraktionen af den direkte excitation af acceptoren med donor excitationslaseren), a = 0,017 og g G / g R = 3,7 Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: PDA sammenligninger af high-FRET og low-FRET dsDNA. Time window PDA analyse på 2 ms, med en halv bredde på 6% af den gennemsnitlige FRET effektivitetsafstand. Hver afstand er Gaussisk fordelt med 6% af < R DA > E som bredden (hw DA ). ( A ) For prøven HFRET er interdyeafstanden < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å. ( B ) For prøven LFRET er afstanden < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: PIE-MFD af det ligandbindende domæne af NMDA-receptoren i nærvær af antagonisten, DCKA. ( A ) Todimensionelt histogram af F D / F A versus donorens levetid i nærvær af acceptor < τ D ( A ) > f og donorens anisotropi versus < τ D ( A ) > f Til LBD med DCKA. One-dimensionAl fremskrivninger for F D / F A og er også vist. Den statiske FRET-linje vises rødt. Pure donor- og acceptorfluorescens ( F D og F A ) korrigeres for baggrund (< B G > = 0,940 kHz og < B R > = 0,522 kHz), spektral krydspredning (α = 1,7%) og detekteringseffektivitet Forhold (g G / g R = 3,7). På anisotropien versus < τ D ( A ) > f histogrammer har perrinens ligning en rotationskorrelation af ρ = 2,5 ns. ( B ) PDA ved et 10 ms tidsvindue At. En enkelt stat er nødvendig. Modellen passer godt til alle tidssvinduer. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Handling | Mål |
| Center laserstråle. | |
| Juster pinhullet. | FCS-eksperiment (afsnit 5). |
| Juster detektorer. | Maksimere CPM. |
| Juster objektiv korrektionsring. | Minimer t diff og maksimere CPM. |
| Bestem instrumentresponsfunktion (IRF). | TCSPC @ SMD i TTTR-tilstand. Mål scatter decay mønster. |
| Bestem G-faktor for hvert spektralvindue. | TCSPC @ SMD i TTTR-tilstand. Sammenligne intensiteterne formede henfaldshaler tilpasning til polarisationer. |
| Bestem detektionseffektivitetsforholdet i spektrale vinduer (g R / g G ). | (I) Intensitetsmålinger af et farvestof med bredt emissionsspektrum (nM-koncentration). (Ii) Mål referencer FRET linjer (pM koncentrtion). I MFD skal underbefolkningen falde på den statiske FRET-linje. |
| Udfør endelig kontrol (levetid og anisotropi). | Kontrolleret levetid og anisotropi fra enkeltmolekylær måling af frit diffunderende farvestof med et enkelt eksponentielt henfald ( f.eks. Rhodamine 110). |
| Bestem forholdet mellem acceptor og donorkvantumudbytte. | (I) Stoichiometri plot (S PIE ) Eq. 1. og 4.2. |
| Bestem baggrundstallet. | Intensitetsmålinger af den valgte "buffer". |
| Bestem cross-talk (α). | Intensitetsmålinger af donorfarvestoffer tager højde for fluorescensemissionsspektret og detekteringseffektivitet. |
Tabel 1: Kalibreringstrin for FRET-eksperimenter i enkeltmolekyleforsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde præsenteres protokollen til justering, kalibrering og måling af interdyeafstande med høj præcision ved brug af PIE-MFD-enkeltmolekylære FRET-eksperimenter. Ved omhyggeligt at kalibrere alle instrumentelle parametre kan man øge nøjagtigheden af de målte afstande og nå Angstrom-nøjagtighed. For at gøre det bruges forskellige multidimensionale histogrammer til at analysere og identificere populationer til yderligere karakterisering. Ved hjælp af den gennemsnitlige makro tid for at verificere stabiliteten af de målte prøver er det muligt at korrigere for donor- og acceptorfotobleaching og for at vælge FRET-populationer baseret på støkiometriparameteren. Imidlertid kan acceptorens fotofysiske egenskaber ændre sig afhængigt af placeringen af etiketten. Således kan man anvende en S PIE- fordeling for korrekt at korrigere for acceptorkvantumudbyttet. Korrekt fotofysisk karakterisering er nødvendig for at bestemme gammafaktoren (ƴ), som sammen med anden korrektionsfaktorOrs ( f.eks. Α for crosstalk og β for acceptor excitation med donorlaseren), kan bruges til at øge nøjagtigheden af den målte interdyeafstand. Denne fremgangsmåde blev bekræftet ved anvendelse af to designet dsDNA standardprøver, og en nøjagtighed på ~ 1 Å sammenlignet med forventede værdier blev bestemt.
Forskellige farvestofselektioner kræver tilpasning af mikroskopoptiske elementer, såsom de dikroiske og båndpasfiltre, for at rumme det korrekte spektralvindue af de udvalgte farvestoffer. Derfor skal pulserende lasere vælges. Endnu vigtigere er udvælgelsen af farvestoffer afgørende på grund af flere mulige fotofysiske artefakter, såsom acceptor- og donorblegning, triplet eller farveblinkning eller farvestof, der klæber til proteinoverflader. Disse artefakter kan kompromittere fortolkningen af eksperimentelle data. MFD er ideel i dette scenario, fordi det ved at inspicere flere parametre er muligt at identificere kilderne til disse artefakter, retteFor dem, eller i det mindste være opmærksomme på deres eksistens. Dipoleorienteringsparameteren, det meste af tiden antaget som K 2 = 2/3, kan forårsage større afvigelser af den bestemte afstand, hvis farvestoffet fortrinsvis stikker til overfladen af biomolekylerne. Anisotropi af donorprøven, acceptorprøven og donoracceptor kan hjælpe med at løse om denne antagelse er gyldig eller ej. I dette forsøg er det konstateret, at der er en maksimal fejl på ~ 2,5% på den målte afstand sammenlignet med ikke at foretage den korrekte korrektion og opnå en 10-20% fejl. Kvantumudbyttet fra acceptoren kan skabe en større fejlkilde. S PIE er således vigtigt for at løse dette vigtige problem.
Det er muligt at anvende en lignende strategi for at forstå det konformationelle landskab i det ligandbindende domæne af NMDA-receptoren for at forstå mekanismen for agonisme på NMDAR. Det blev konstateret, at LBD i tHans tilstedeværelse af en antagonist dækker tilgængeligheden af en høj-FRET-stat, der er postuleret til at være ansvarlig for åbningen af kanalen 73 . Ved sammenligning af eksperimentelt afledte afstande og de forventede værdier baseret på krystallografiske oplysninger blev en aftale inden for 3 Å opnået. Endnu vigtigere kan de nye lavbefolkede stater identificeres med tilsvarende præcision.
Sammenfattende giver single-molekyle FRET-eksperimenter i MFD-tilstand 42 mulighed for korrekt at redegøre for eksperimentelle artefakter og at udlede interdyeafstand i området fra ~ 30-70 Å. Hvis der i stedet for en enkelt målt afstand er afledt et netværk af afstande, er det muligt at anvende disse som begrænsninger i strukturel modellering, især for stater, der er vanskelige at karakterisere med mere standardmetoder for strukturbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser med indholdet af denne artikel.
Acknowledgments
VJ og HS anerkender støtte fra NIH R01 GM094246 til VJ. HS anerkender startfonde fra Clemson University Creative Research Program og Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies på Clemson University. Dette projekt blev også støttet af et træningsfællesskab fra Keck Center for Tværfaglig Bioscience Training af Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) og Schissler Foundation Fellowship for Translational Studies of Common Human Diseases til DD. Indholdet er udelukkende forfatterens ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| charcoal | Merck KGaA | K42964486 320 | |
| syringe filter | Fisherbrand | 09-719C | size: 0.20 µm |
| chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | 1.5 borosilicate glass, 8 wells |
| microscope cover glass | Fisher Scientific | 063014-9 | size: 24 x 60-1.5 |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 148859 | nuclease free |
| tween-20 | Thermo Scientific | 28320 | 10% solution of Polysorbate 20 |
| acceptor DNA strand (High FRET) | Integrated DNA Technologies | 178124895 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| acceptor DNA strand (Low FRET) | Integrated DNA Technologies | 177956424 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| donor DNA strand | Integrated DNA Technologies | 177951437 | 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG) |
| DNA strand (No FRET) | Integrated DNA Technologies | 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) | |
| thermal cycler | Eppendorf | E6331000025 | nexus gradient |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Thermo Scientific | A10254 | termed cyan-green fluorophore in the manuscript |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Thermo Scientific | A20347 | termed far-red fluorophore in the manuscript |
| Rhodamine 110 | Sigma-Aldrich | 83695-250MG | |
| Rhodamine 101 | Sigma-Aldrich | 83694-500MG | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | For culture of E. coli |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection |
| Tetracyline | Calbiochem | 58346 | Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Origami B(DE3) Competent Cells | Millipore | 70837-3 | Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755 | For induction of E. coli protein expression |
| HiTrap Chelating HP | GE Life Sciences | 17-0409-01 | For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| PD-10 Desalting Column | GE Life Sciences | 17-0851-01 | |
| AktaPurifier | GE Life Sciences | 28406264 | FPLC Instrument |
| Dialysis tubing | Spectrum labs | 132562 | 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll |
| Dichroics | Semrock | FF500/646-Di01-25x36 | 500/646 BrightLight |
| 50/50 Beam splitter polarizer | Qioptiq Linos | G33 5743 000 | 10 x 10 film polarizer |
| Green pass filer | Chroma | ET525/50m | ET525/50m 25 mm diameter mount |
| Red pass filter | Chroma | ET720/150m | ET720/150m 25 mm diameter mount |
| Power Meter | ThorLabd | PM200 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary300Bio | |
| Fluorolog 3 fluorometer | Horiba | FL3-22-R3 | |
| Fluorohub TCSPC controller | Horiba | Fluorohub-B | TCSPC electronics for ensemble measurements |
| NanoLed 485L | Horiba | 485L | Blue diode laser |
| NanoLed 635L | Horiba | 635L | Red diode laser |
| Olympus IX73 Microscope | Olympus | IX73P2F | Microscope frame |
| PMA 40 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932200, PMA 40 | Optimized for green detection |
| PMA 50 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932201, PMA 50 | Optimized for ed shifter sensitivity |
| 485 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-485 | |
| 640 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-640 | |
| Hydraharp 400 and TTTR acqusition software | PicoQuant | 930021 | Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software |
| SEPIA II SLM 828 and SEPIA software | PicoQuant | 910028 | Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller. |
| computer | Dell | optiplex 7010 | cpu: i7-3770 ram:16GB |
| FRET Positioning and Screening (FPS) software | Heinrich Heine Unviersity | It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html | |
| MFD suite | Heinrich Heine Unviersity | It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html |
References
- Kendrew, J. C.
- Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
- Henzler-Wildman, K., Kern, D.
- Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
- Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838 (2007).
- Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
- Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
- Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
- Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
- Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
- Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
- Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
- Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
- Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
- Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
- Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121 (2012).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
- Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
- Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
- Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791 (2011).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
- Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
- Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
- Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
- Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
- Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
- Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
- DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
- McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
- McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
- Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
- Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
- Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
- Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256 (2014).
- Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
- Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
- Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
- Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
- Steven, A. C., Baumeister, W.
- Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
- Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
- Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
- Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
- Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
- Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
- Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
- Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
- Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
- Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
- Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
- Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
- Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
- Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104 (2005).
- Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
- Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
- Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
- Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
- Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
- Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
- Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
- Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
- Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
- Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
- Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).
