Los Gránulos de Estrés (SG) son estructuras citoplasmáticas no membranosas que se forman en células expuestas a una variedad de tensiones. SGs contienen mRNAs, proteínas de unión a ARN, pequeñas subunidades ribosómicas, factores relacionados con la traducción, y diversas proteínas de señalización celular. Este protocolo describe un flujo de trabajo que utiliza varios enfoques experimentales para detectar, caracterizar y cuantificar SGs de buena fe .
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Artículo de método
Métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos
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Resumen
Resumen
Las células son a menudo desafiadas por cambios ambientales repentinos. Los Gránulos de Estrés (SG), complejos de ribonucleoproteínas citoplasmáticas que se forman en células expuestas a condiciones de estrés, están implicados en diversos aspectos del metabolismo celular y la supervivencia. Las SG modulan las vías de señalización celular, la expresión génica post-transcripcional y los programas de respuesta al estrés. La formación de estos gránulos que contienen mRNA está directamente conectada a la traducción celular. SG se desencadena por la iniciación de la traducción inhibida, y el desmontaje SG se promueve por activación de la traducción o por elongación de la traducción inhibida. Esta relación se pone más de relieve por la composición SG. Los componentes de núcleo SG son complejos de preiniciación de traducción estancados, mRNA, y proteínas RNA-binding (RBPs) seleccionadas. El propósito de la asamblea de SG es conservar la energía celular secuestrando los mRNAs de mantenimiento doméstico traducionalmente estancados, permitiendo la traducción mejorada de proteínas que responden al estrés. En additiSobre los constituyentes del núcleo, tales como complejos de preiniciación de traducción estancada, SGs contienen una plétora de otras proteínas y moléculas de señalización. Los defectos en la formación de SG pueden alterar la adaptación celular al estrés y, por lo tanto, pueden favorecer la muerte celular. Las SG y los gránulos similares que contienen ARN se han ligado a una serie de enfermedades humanas, incluyendo trastornos neurodegenerativos y cáncer, dando lugar al reciente interés en clasificar y definir subtipos de gránulos de ARN. Este protocolo describe ensayos para caracterizar y cuantificar SGs de mamíferos.
Introducción
Las células emplean muchos mecanismos para responder al estrés. Algunas respuestas se producen a nivel post-transcripcional e implican la regulación de la traducción y / o la estabilidad del mRNA 1 , 2 . La detención y degradación de la ARNm de mRNA modulada por estrés se asocian con la formación de focos celulares no membranosos específicos, siendo los más bien caracterizados los Stress Granules (SGs) 3 . Las SGs son focos citoplasmáticos que concentran mRNPs no traducientes en células detenidas en translación que responden al estrés ( por ejemplo, oxidación, choque térmico, ....
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Protocolo
1. Preparación de células
- Añadir cubreobjetos autoclavados a 12 pocillos de una placa de 24 pocillos, como se indica en la Figura 1A ; Esto se puede hacer usando una pipeta Pasteur estéril unida a un vacío para recoger cada cubreobjetos. Golpee suavemente la cubreobjetos en el lado del pozo para liberar la succión, permitiendo que la cubreobjetos caiga en el pozo.
- Placa 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) células de osteosarcoma por pocillo a un volumen final de 500 μl de medio. Mueva la placa de lado a lado y arriba y abajo varias veces para asegurarse de que las células están distribuidas uniformemente.
- Presione suaveme....
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Resultados
Los focos inducidos por el estrés no son necesariamente SGs. Las SG se clasifican como focos citoplásmicos que contienen mRNAs, factores de iniciación de la traducción y proteínas de unión al ARN y están en equilibrio con la traducción activa. El protocolo anterior puede usarse como una plantilla para caracterizar si un esfuerzo dado induce SGs de buena fe .
Las SG se colocalizan con otros marcadores SG conocidos, inc.......
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Discusión
Como evidenciado por estudios inmunohistológicos en múltiples enfermedades, el estrés crónico conduce a la formación de diferentes focos intracelulares. Por ejemplo, la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por agregados intracelulares de proteínas insolubles. La presencia de SG-proteínas asociadas en tales agregados es a menudo la base para concluir que tales focos son SGs. Una conclusión similar se deduce también cuando se observan focos citoplasmáticos con marcador positivo en células tratada.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a los miembros de los laboratorios Ivanov y Anderson por su útil discusión y comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [GM111700 y CA168872 a PA, NS094918 a PI], el Centro Nacional de Ciencias en Polonia [otorgar UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 a WS]. WS también reconoce al Ministerio de Ciencia y Educación Superior en Polonia (Programa Mobility Plus) ya la Comisión Fulbright Polaco-Americana por el apoyo financiero de su investigación en los Estados Unidos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| U-2 OS | ATCC | ATCC® HTB-96 y comercio; | Comúnmente escrito "U2OS" Cultura a 37 ° C por debajo del 5% de CO2 en 10% FBS/DMEM |
| Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) | Corning | 10-013-CV | Contiene 4,5 g/L de glucosa, piruvato y fenol rojo Suplementado con 10% de FBS, 10 mM de HEPES y penicilina/steptomicina Precalentar la dilución de fármacos previos Suero |
| fetal bovino (FBS) | Sigma | F2442-500ml | Se utiliza para complementar los medios |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | Se utiliza para complementar la |
| estreptomicina de penicilina | Sigma | P0781-100ml | Se utiliza para complementar la |
| placa de 24 pocillos | de comunicación Costar | 3524 | |
| Pañuelos de papel de laboratorio (toallitas kimtechSCIENCE | 34120 | ||
| Cubreobjetos para el crecimiento | Fisher Scientific | 12-545-82 | Esterilizado en autoclave antes de su uso Mantener estéril en la campana de cultivo |
| de tejidos (meta)arsenito de sodio ≥ 90% (SA) | Sigma | S7400-100G | Disolver en agua a una concentración de 1 M, luego diluir a 100 µ M como material de trabajo |
| Vinorelbine (VRB) | TSZ CHEM | RS055 | Disolver en agua hasta 10 mM |
| Puromicina | Sigma | P9620 | Se utiliza para evaluar el nivel de traslación (ribopuromicilación) -Se utiliza para evaluar la conexión de SG con la traducción activa Diluir en agua hasta 10 mg/mL |
| Clorhidrato de emetina hidrato Sigma | E2375 | Se utiliza en combinación con puromicina para evaluar el nivel general de traducción Se utiliza para evaluar la conexión de la SG con la traducción activa -Diluido en agua hasta 10 mg/mL | |
| de cicloheximida (CHX) | Sigma | C4859 | Se utiliza para evaluar la conexión de la SG con la traducción activa Diluir en agua hasta 10 mg/mL |
| de solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Lonza / VWR | 95042-486 | Tampón de lavado para inmunofluorescencia |
| Grado de reactivo de paraformaldehído, cristalino (PFA) | Sigma | P6148-500G | Prepare una solución al 4% en PBS caliente en la campana extractora, revuelva hasta que se disuelva Las alícuotas se pueden almacenar a -20 & grados; C durante varios meses Peligroso, uso ventilación Desechar en residuos especiales |
| Metanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | Preenfriar a -20 & deg; C antes de usar Deseche en los residuos especiales |
| Suero de caballo normal (NHS) | Thermo Fisher Scientific | 31874 | Diluir al 5% en PBS Agregue azida de sodio para almacenar a 4 & grados; C Solución de bloqueo para inmunofluorescencia |
| Etanol, puro, 200 pruebas (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | Diluir al 70% con agua |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus de | Fisherbrand Fisherbrand | 12-550-15 | |
| anticuerpo anti G3BP1 para ratones (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | Almacenar en 4 & grados; C 1/100 dilución |
| anti anti eIF4G anticuerpo (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | Almacenar en 4 & deg; C 1/250 dilución |
| cabra anti eIF3η (N-20) anticuerpo | Santa Cruz | sc-16377 | eIF3η también se conoce como eIF3b Almacene en 4 & deg; C dilución 1/250 |
| anti puromicina 12D10 anticuerpo | Millipore | MABE343 | Tienda a 4 & grados; C dilución 1/1.000 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | Reconstituir en agua por fabricante' s instrucciones y luego almacene a 4 ° C dilución 1/250 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | Reconstituir en agua según el fabricante' s instrucciones luego almacene a 4 & deg; C 1/2.500 dilución |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | Reconstituir en agua según el fabricante' s instrucciones luego almacene a 4 & deg; C dilución 1/250 |
| Hoechst 33258 solución | Sigma | 94403-1ML | Incubar con anticuerpos secundarios Solución madre 0,5 mg/mL en dH20, proteger de la luz -Almacenar a 4 & grados; C |
| Cy3 Estreptavidina | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | Reconstituir en agua por fabricante' s instrucciones, luego almacene a 4 ° C 1/250 dilución |
| oligo-(dT)40x sonda biotinilada | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | Reconstituir en agua a 100 ng/mL, alícuota y almacenar a -20 ° C Diluir en tampón de hibridación 1/50 antes de usar |
| Caja de hibridación | / | /Haga | una cámara de humedad con cualquier caja de portaobjetos de almacenamiento agregando papel humidificado en la parte inferior - precalentar la caja antes de su uso |
| 20x Tampón SSC | Thermo fisher Ambion | AM9763 | Diluir a 2x SSC usando agua libre de RNasa (tratada con DEP) Almacenar en RT Tampón de lavado para FISH |
| Tampón de hibridación PerfectHybPlus Sigma | H7033-50ml | Tampón de incubación de bloques y sondas para | |
| medios de montaje de portaobjetos | hecho en casa | / | Mezcla 5 g de " soluble en frío" poli(alcohol vinílico) en 20 mL de PBS Mezclar por sonicación, seguido de agitación O/N a RT Añadir 5 mL de glicerol y 0,2 mL de azida sódica al 20 %, y agitar durante 16 h a RT Centrifugación a 20.000 g durante 20 min, desechar el líquido viscoso alícuota de pellets grande , Almacenamiento a largo plazo a -20 ° C, 1 semana a 4 & deg; C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | |
| Poli(alcohol vinílico) | Sigma | P-8136-250G | Reactivo para hacer vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | Reactivo para hacer |
| azida sódica de | Fisher Scientific | S2002-5G | Agente conservante para la solución de bloqueo y vinol Hacer una dilución del 20% en agua |
Referencias
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
- Buchan, J. R.
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Reimpresiones y permisos
