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Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

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DOI:

10.3791/55664

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1 de mayo de 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 3Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Hemos desarrollado una nueva técnica de microscopía electrónica, "Flash-y-congelación", que permite la visualización de la dinámica de la membrana con ms resolución temporal. Esta técnica combina la estimulación optogenético de neuronas con la congelación de alta presión. Aquí, demostramos los procedimientos y describimos los protocolos en detalle.

Resumen

Las células cambian constantemente su arquitectura membrana y distribución de las proteínas, pero es extremadamente difícil de visualizar estos eventos a una resolución temporal y espacial del orden de ms y nm, respectivamente. Hemos desarrollado una técnica resuelta en el tiempo microscopía electrónica, "flash-y-congelación", que induce eventos celulares con optogenética y visualiza la dinámica membrana resultante mediante la congelación de las células en los puntos de tiempo definidos después de la estimulación. Para demostrar esta técnica, expresamos canalrodopsina, un canal catiónico sensible a la luz, en las neuronas del hipocampo del ratón. Un destello de luz estimula la actividad neuronal e induce la liberación de neurotransmisores desde las terminales sinápticas a través de la fusión de las vesículas sinápticas. La estimulación de las neuronas optogenético se acopla con la congelación de alta presión para seguir los cambios morfológicos durante la transmisión sináptica. El uso de un instrumento comercial, capturamos la fusión de las vesículas sinápticas y la recuperación de la synamembrana de la vesícula PTIC. Para visualizar la secuencia de eventos, grandes conjuntos de datos se generaron y analizaron a ciegas, ya que los cambios morfológicos fueron seguidos en diferentes células en el tiempo. Sin embargo, flash-y-congelación permite la visualización de dinámica de la membrana en las micrografías electrónicas con resolución temporal ms.

Introducción

Visualización dinámica de la membrana y proteínas dentro de una célula es un paso clave hacia la comprensión de la biología celular de procesos particulares. eventos de tráfico dinámico se pueden capturar usando la luz o microscopía de fluorescencia. Sin embargo, el contexto subcelular está en gran parte ausente en este tipo de imágenes porque las estructuras subcelulares no puede ser completamente "pintadas" por colorantes o sondas fluorescentes y resueltas espacialmente y espectralmente 1, 2. Por otro lado, si bien la microscopía electrónica puede delinear la arquitectura subcelular con exquisito detalle, no puede capturar la dinámica celular, ya que las muestras deben fijarse antes de la imagen. Así, es típicamente no es suficiente para entender completamente la dinámica celular usando solamente una modalidad de imagen.

Para superar las limitaciones de la luz y microscopía electrónica, se han desarrollado técnicas de microscopía correlativos. Correlativa de luz y microscopía electrónica(CLEM) visualiza dinámica intracelular utilizando microscopía de luz y estructuras subcelulares subyacentes con microscopía electrónica. En CLEM, las células que participan en varios procesos, tales como la citocinesis y la endocitosis 3, 4, 5, 6, son-live imagen y luego procesados para microscopía electrónica. Aunque CLEM captura ciertos aspectos de la dinámica intracelulares, hay cuatro factores que limitan la utilidad de este enfoque. En primer lugar, la resolución temporal está limitada por la rapidez con la que las células pueden inmovilizarse, que típicamente toma s - min debido a la lenta difusión y la reacción de fijadores 7. En segundo lugar, se observa la arquitectura subcelular post facto 8; Por lo tanto, los cambios morfológicos dinámicas no pueden ser capturados utilizando este enfoque. En tercer lugar, las micrografías de fluorescencia y de electrones no se pueden alinear con precisión debido a sh tejidorinkage causada por la deshidratación durante la preparación de la muestra para microscopía electrónica 9, 10. En cuarto lugar, eventos como la citocinesis y la endocitosis no tienen lugar al mismo tiempo en todas las células 5, 11, y por lo tanto, una célula particular que se dedica en caso deben ser identificados a partir de una gran población de células. Este proceso es a menudo laborioso. Por lo tanto, un nuevo método es necesaria para inducir eventos particulares en cada célula y para capturar la dinámica celular resultantes por la rápida inmovilización de células en puntos de tiempo definidos.

Recientemente, varios se han desarrollado herramientas para inducir particulares dinámica celular utilizando la luz (optogenética). Canalrodopsina es un canal de catión sensible a la luz, no selectivo aislado de Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Cuando se expresa en canalrodopsina neuronal membranas, un breve destello de luz induce una afluencia de iones de sodio en neuronas y desencadena una acción potencial 14, 15. El potencial de acción se propaga entonces en los terminales sinápticos, donde las vesículas sinápticas se fusionan en cuestión de milisegundos 16, 17, 18 Por lo tanto, canalrodopsina induce la actividad neuronal. Para seguir dinámica de la membrana en las terminales sinápticas, las neuronas deben ser inmovilizados en puntos de tiempo definidos después de la estimulación con precisión ms.

Para capturar dinámica de la membrana después de la inducción de la actividad neuronal, que acoplamos la estimulación de luz con alta presión de congelación 17, 18, 19. Congelación de alta presión permite la inmovilización casi instantánea de las células con la formación de cristales de hielo reducida 20. Los cristales de hielo can romper las membranas y perturbar la arquitectura subcelular 21. Variando los intervalos de tiempo entre la estimulación y la congelación, el tráfico de membrana dentro de los terminales sinápticos fue capturado después de la inducción de un potencial de acción.

Aquí, demostramos procedimientos experimentales usando un congelador de alta presión comercializado que las parejas un control temporal ms de estimulación de la luz con la congelación de alta presión. A diferencia de otros instrumentos que requieren un dispositivo externo para controlar la estimulación de luz y la congelación, la estimulación de luz está totalmente integrado en este sistema y se puede aplicar con precisión ms 19. Este proceso implica varios pasos. 1) las neuronas del hipocampo de ratón se cultivan en discos de zafiro e infectadas con lentivirus que lleva un vector de expresión para canalrodopsina 18. 2) Las neuronas son estimuladas y se congelaron a puntos de tiempo definidos después de la estimulación. 3) El agua vitrificada es sustitutod con un disolvente orgánico, mientras que los lípidos y las proteínas son reticulados por fijadores para preservar la arquitectura intracelular. 4) Las muestras se infiltraron y embebidos en resina epoxi. 5) secciones ultrafinas se recogen usando un ultramicrotomo. 6) Las secciones finas se forman imágenes en un microscopio electrónico de transmisión. 7) de adquisición y análisis de imágenes se llevan a cabo a ciegas con respecto a los puntos de tiempo o genotipos. La dinámica celular se pueden determinar a través de la reconstrucción de imágenes con resolución temporal 17, 18. Preparación de la muestra (pasos 2 - 5 más arriba) requiere una semana, pero el análisis de la imagen subsiguiente requiere meses a un año.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las reglas y regulaciones de uso de animales por parte de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Johns Hopkins School of Medicine.

1. Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratón

  1. Diseccionar cortezas de un día postnatal 0 - día 2 (P0 - 2) de cerebro de ratón 18. Aislar los astrocitos a partir de las cortezas.
    NOTA: El cerebro de ratón se aisló después de la decapitación. Los astrocitos sirven como una capa de alimentación para las neuronas del hipocampo.
  2. Tratar las cortezas con 800 l de 0,05% de tripsina-EDTA durante 15 minutos a 37 ° C para disociar los astrocitos.
  3. Cultura los astrocitos en un matraz T-75 con 13 ml de DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 0,2% de penicilina-estreptomicina durante una semana a 37 ° C y 5% de CO2.
  4. Coloque pe cubreobjetos de vidrio de un lavadas con ácido y esterilizados 18 mmr pocillo de una placa de 12 pocillos.
  5. Brevemente lavar dos discos de zafiro de carbono recubierto de 6 mm en 70% de etanol y colocarlos en la parte superior de cada cubreobjetos de vidrio.
  6. Preparar la solución de poli-D-lisina (PDL) mediante la mezcla de 3 ml de 17 ácido acético nM con 1 ml de colágeno de cola de rata y 1 ml de PDL (1 mg / ml). Aplicar 200 l de solución de PDL a los discos de zafiro y cubreobjetos de vidrio durante 5 min a RT.
  7. Eliminar la solución de PDL y secar al aire. Antes de su uso, esterilizar la placa como se ha preparado en los pasos 1.4 a 1.6 durante 30 minutos bajo luz ultravioleta.
  8. Sembrar el astrocitos procedentes de la etapa 1.3 en 2 ml de DMEM a una densidad de 5x10 4 células / pocillo en la placa como se ha preparado en los pasos 1.4 - 1.6. Crecer ellos a 37 ° C y 5% de CO 2 durante una semana.
  9. Añadir 20 l de fluoro-desoxiuridina (concentración final: 80 mM) a cada pocillo durante al menos unos pocos h antes de cultivar las neuronas.
    NOTA: fluoro-desoxiuridina detiene la división de los astrocitos.
  10. Cambiar el medio a 1,5 ml de bas neuronalesal medio (véase la Tabla de Materiales) que contiene 1% de L-alanil-L-glutamina (véase la Tabla de Materiales), 2% de suplemento libre de suero para células neuronales (véase la Tabla de Materiales), y 0,2% de penicilina-estreptomicina .
  11. Preparar la solución de papaína mediante la adición de 20 unidades de papaína a 5 ml de solución de enzima (cisteína 1,65 mM, 1 mM de CaCl2, y EDTA 0,5 mM en DMEM). Se acidifica la solución haciendo pasar gas CO2 durante 20 min. Filter-esterilizar con un filtro de 0,22! M.
  12. Se recoge el cerebro de un P0 - 2 de ratón 18. transferir inmediatamente el cerebro para solución salina equilibrada-Hanks' enfriado con hielo (HBSS). Diseccionar los hipocampos bajo un microscopio estereoscópico, manteniendo el tejido sumergido en HBSS.
  13. Coloque los dos hipocampos en 1 ml de la solución de papaína preparado en la etapa 1.11. Incubar durante 1 h en un termomezclador a 37 ° C y 750 rpm.
  14. Reemplazar la papaína con 1 ml de solución que contiene la inactivación2,5 mg de inhibidor de tripsina y 0,5 mg de albúmina por ml de DMEM. Incubar durante 5 min a 37 ° C. Aspirar la solución de inactivación.
  15. Añadir 200! L de medio basal neuronal (véase la Tabla de Materiales) al hipocampo aislado. Se tritura usando una punta de pipeta de 200 l para disociar las células. Esperar hasta que las células no disociadas se asientan en la parte inferior. Retirar con cuidado el medio con células de la parte superior.
  16. Repita el paso 1.15 3x. Piscina todas las células disociadas en un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml.
  17. Contar el número de células utilizando un hemocitómetro. Neuronas placa a una densidad de 6,5 x 10 4 células / pocillo en la parte superior de la capa de astrocitos preparado en los pasos 1.1 - 1.10.
  18. Infectar las neuronas con lentivirus que expresan canalrodopsina en DIV 3 (3 d in vitro) 18.
  19. Realizar flash-and-congelación de DIV 14, como se describe en los pasos 2.1 - 2.5, a continuación.

2. Flash unad-Freeze

  1. Preparación de fijador
    1. Bajo una campana química, añadir las siguientes sustancias a un tubo cónico para preparar el fijador: 2,5 ml de glutaraldehído (10% stock en acetona), 0,25 g de tetróxido de osmio, 0,25 ml de agua, y 22,25 ml de acetona anhidra.
      NOTA: La concentración final de cada componente debería ser de 1% en acetona. se añade glutaraldehído para preservar las estructuras de las proteínas durante la congelación-sustitución. PRECAUCIÓN: La toxicidad aguda de tetróxido de osmio es alta. La exposición a vapores podría dañar la córnea del ojo. Se debe manejarse solamente en una campana química certificado.
    2. Alícuota de 1 ml de fijador en viales criogénicos numerados (2 ml). Mantenga el fijador congelados en nitrógeno líquido hasta su uso.
      NOTA: El tetróxido de osmio y glutaraldehído reaccionan de forma cruzada y precipitar; Así, una vez mezclado, alícuota de inmediato, la tapa de los tubos, y sumergir los criotubos en nitrógeno líquido para congelar el fijador. Utilice un lápiz para contar el crioviales génicas, ya que la acetona pueden lavar marcadores.
  2. Preparación de solución salina fisiológica
    1. Hacer solución salina fisiológica mediante la mezcla de Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM), y glucosa (10 mM).
      NOTA: Estos valores son concentraciones finales. Crio-protectores no se utilizan para cultivos en monocapa. Sin embargo, se requiere una adecuada crio-protector para los especímenes más gruesas que 5 m. El uso de 20% de BSA se recomienda generalmente. Pasta de levadura y E. OP50 coli también se pueden usar como crio-protectores para larvas de mosca o C. elegans.
    2. Añadir CaCl 2 a 4 mM y MgCl 2 en 1 concentraciones finales mM.
      NOTA: Las concentraciones de CaCl2 y MgCl2 varían dependiendo de los experimentos. Para garantizar la captura de los productos intermedios exocytic, calcio 4 mM se utiliza para estos experimentos particulares para aumentar la probabilidad de liberación de vesículas 18.
    3. Comprobar elosmolaridad mediante un osmómetro. Asegúrese de que es de 300 ± 5 mOsm.
    4. Añadir antagonista del receptor de AMPA (NBQX) a una concentración final de 3 M y antagonista del receptor de GABA (bicuculina) a una concentración final de 30? M.
      NOTA: se añaden los antagonistas de receptores de neurotransmisores para evitar la actividad de red recurrente después de la estimulación neuronal 18.
    5. Calentar la solución salina fisiológica a 37 ° C para su uso.
  3. Preparación de la Especializada de alta presión congelador y una unidad automatizada Freeze Sustitución
    1. Antes de la congelación de alta presión, enfriar una unidad de sustitución congelación automatizado a -90 ° C por llenar el tanque con nitrógeno líquido.
    2. Enfriar acetona en una pequeña taza a -90 ° C mediante la colocación dentro de la cámara de muestras.
    3. Llenar el vaso Dewar de nitrógeno líquido y dewar de almacenamiento del congelador de alta presión (véase la Tabla de Materiales) con nitro líquidoGen.
    4. Configurar el protocolo de estimulación de la luz utilizando el monitor de pantalla táctil.
      1. Nombre del programa haciendo clic en "Editar" junto a "Nombre del programa" en la ventana de estimulación de la luz. Otra ventana se abrirá.
      2. Establecer un programa escribiendo "15.000 ms" en "fase oscura", "100 ms" en "período", "10 ms" en "pulso" y "1" en "número de períodos" para un único estímulo de 10 Sra. Congelar las células 90 ms más tarde (Figura 1C).
        NOTA: La "fase oscura" permite que las células se recuperen de exposición a la luz durante la carga de la muestra. "Período" define la frecuencia de estimulación. Por ejemplo, si el estímulo debe ser aplicado a 20 Hz, esta columna debe fijarse en 50 ms. "Pulso" define la duración del estímulo de luz. Por último, el "número de períodos de" define el número total de estímulos aplicadas. Para la creación de una estimulación de alta frecuencia, consulte Figura 1E.
    5. Para un "sin estimulación" control, tipo "15 s" en "fase oscura", "0 ms" en "período", "1 ms" en "pulso", y "0" en "número de períodos de" a la luz ventana de configuración de la estimulación, como se describe en el paso 2.3.4.
      NOTA: Por defecto, el "pulso" debe ser de al menos 1 ms.
    6. En la pantalla principal, asegúrese de que la caja para la estimulación de luz está marcada.
    7. Configurar el protocolo de almacenamiento haciendo clic en "Espécimen de almacenamiento" en la pantalla principal. Haga clic en "Editar". En la siguiente ventana, utilice "+" o "-", para seleccionar "2" para almacenar 2 discos en cada canal (3 canales en total). Marque "habilitado almacenamiento LN2."
  4. Carga de la muestra y la congelación en la alta presión Congelador
    NOTA: Todo el montaje de la muestra y de carga pasos se realizan bajo un estereomicroscopio con una gama 7.5-60X ampliación. Un TWEEZer se utiliza en los pasos 2.4.1 - 2.4.4 para manipular las muestras. Los experimentos deben realizarse a temperatura fisiológica.
    1. Colocar un disco de zafiro, celda en el lado hacia arriba, en el pozo de la placa de negro, media (Figura 1B).
    2. Colocar un anillo espaciador 100 micras sobre el disco de zafiro (Figura 1B).
    3. Colocar un disco de zafiro en blanco sobre el anillo espaciador (Figura 1B) después de sumergir un lado del disco en la solución salina precalentada de la etapa 2.2. Asegúrese de que no queden burbujas de aire atrapadas entre los dos discos de zafiro.
    4. Coloque otro anillo espaciador 100 micras y un anillo espaciador 400 m (Figura 1B). Retire el exceso de líquido con papel de filtro.
    5. Coloque el conjunto de la etapa 2.4.3 entre los dos medios cilindros transparentes (Figura 1A). Cierre la cubierta superior rojo para iniciar el proceso de congelación.
      NOTA: El protocolo preestablecido se ejecuta automáticamente una vez que la tapa está cerrada. La muestra se mantiene en la misma orientación en la cámara de congelación, y un destello de luz se aplica desde la parte superior del conjunto de la muestra. La cubierta roja aparece una copia de seguridad de forma automática una vez que se haya completado el proceso de congelación.
    6. Almacenar la muestra en el vaso Dewar de almacenamiento.
      NOTA: Después de la congelación, el espécimen se deja caer automáticamente en un dewar de almacenamiento lleno con nitrógeno líquido y se almacena allí hasta su posterior procesamiento. El dewar de almacenamiento tiene tres cámaras, y cada cámara puede contener hasta 3 muestras a lo más. Típicamente, dos muestras se congelan en las mismas condiciones de estimulación, y el congelador de alta presión está programado para almacenar tanto en la misma cámara.
    7. Repita los pasos 2.4.1 - 2.4.6 para cada muestra.
    8. Continúe en el paso 2.5 una vez que todas las cámaras están llenas.
      NOTA: El dispositivo fue creado para almacenar hasta 6 muestras en el Dewar de almacenamiento a la vez. Por lo tanto, después de cada muestra de 6º, paso 2.5 debe ser realizada. Una vez descargado, repita los pasos 2.4.1 - 2.4.6.
  5. Ejemplo de recogida y transferencia a una unidad automatizada de congelación-sustitución
    1. Abrir la puerta de la dewar de almacenamiento, que se encuentra debajo de la mesa del congelador de alta presión. Retire el vaso Dewar almacenamiento y colocarlo sobre la mesa de trabajo.
    2. El uso de las manos, retire la cámara de muestras del dewar y la transfiere en la bandeja de muestras especializada lleno de nitrógeno líquido. Desbloquear el mando para liberar la copa de muestras.
    3. Retire las transparentes semicilindros de la copa de muestra utilizando un par de pinzas después de pre-enfriamiento de las puntas de las pinzas con nitrógeno líquido (~ -196 ° C). transferir cuidadosamente el medio, negro placa a una pequeña taza que contiene nitrógeno líquido.
      NOTA: Las puntas de las pinzas deben ser enfriado previamente a la temperatura del nitrógeno líquido. La muestra debe mantenerse bajo nitrógeno líquido en todo momento para evitar la formación de cristales de hielo.

3. Freeze sustitución en el Automated Freeze-sustitución Unidad

  1. Usando las pinzas preenfriados (consejos en ~ -196 ° C), transferir rápidamente la placa media de la etapa 2.5.3 a la acetona previamente enfriada (-90 ° C).
  2. Separar el disco de zafiro de la placa media agitando suavemente o tocando.
    NOTA: En ocasiones, puede ser difícil separar el disco de zafiro de la placa intermedia. En tal situación, deje la placa media en acetona previamente enfriada (-90 ° C) durante unos pocos minutos. golpecitos suaves con pinzas también ayuda a disociar el zafiro de la placa intermedia.
  3. Colocar un vial criogénico que contiene fijadores (paso 2.1) dentro de una cámara de muestras de la unidad de sustitución. Transferir el disco de zafiro al vial criogénico y colocar un tapón en el vial.
  4. Configurar el programa de sustitución de congelación de la siguiente manera: (i) -90 ° C durante de 5 - 30 h, (ii) -90 - -20 ° C en 14 h (5 ° C / h), (iii) -20 ° C durante 12 h, y (iv) -20 ° C - 20 ° C en 4 h (10 ° C / h).
    NOTA: El duración de la primera etapa a -90 ° C se podría variar. La duración total de la sustitución de congelación se establece de tal manera que el programa termina en la mañana (~ 1,5 d postexperiment) alrededor de 8 a.m. a fin de que los pasos subsiguientes pueden llevarse a cabo durante el día.

4. La infiltración y la inclusión en plástico con resina de epoxy

  1. Una vez que termine el programa, utilizar las manos enguantadas para transferir los viales criogénicos que contienen los discos de zafiro de la cámara de muestras de la unidad de sustitución a una campana química.
  2. Usando una pipeta, añadir acetona (temperatura ambiente) a cada vial criogénico y lavar cada disco de zafiro 4 - 6x durante 1 - 2 h.
  3. Opcionalmente, se incuban las muestras en acetato de uranilo al 0,1% durante 1 h si se necesita contraste extra. Lavar 4 - 6x con acetona durante 1 - 2 h.
    NOTA: PRECAUCIÓN: Existe el riesgo asociado con la exposición interna después de la inhalación de acetato de uranilo, que causa irritación de las vías respiratorias superiores. La alta exposición puede Damagcélulas de la sangre e. Trabaja con acetato de uranilo se debe realizar bajo ventilación de escape. Se recomienda ropa de protección.
  4. Preparar medio de resina epoxi líquida pesando 6,2 g de glicerol poliglicidil éter, 4,4 g de bisfenol A-resina epoxi, y 12,2 g de anhídrido succínico dodecenilo (DDSA). Mezclar bien y añadir 800 l de bencil dimetilamina (BDMA) mientras se mezcla. De-gas durante 10 min.
  5. Preparar 30, 70, y 90% de resina epoxi en acetona a partir de la resina epoxi 100% preparado en la etapa 4.4.
  6. Añadir resina epoxi 30% a los viales criogénicos que contienen discos de zafiro y se incuba durante 2 - 3 h a TA en un agitador orbital a 120 rpm.
  7. Reemplazar la resina epoxi 30% con resina epoxi 70% mediante pipeteo y se incuba durante 3 - 4 h a TA en un agitador orbital.
  8. Usando pinzas, transferir cada disco de zafiro, celda en el lado plano, a la tapa de una cápsula de incrustación. Añadir resina epoxi 90% a la tapa. Incubar O / N a 4 ° C.
  9. Al día siguiente, hacen medio de resina epoxi fresco, como en el paso 40.4.
  10. Transferir cada disco de zafiro, del lado de la célula hacia arriba, a la tapa de una cápsula de incrustación. Llenar la tapa con resina epoxi 100% recién preparado. Cambiar a resina fresca epoxi 100% cada 2 h, repitiendo tres veces.
  11. Colocar las muestras en un horno de 60 ° C durante 48 h para polimerizar.

5. Las muestras de montaje

  1. Coloque la muestra al revés en el microscopio estereoscópico para que el disco de zafiro se encuentra en la parte superior del bloque de resina. Eliminar la capa delgada de resina epoxi de la parte superior por el rascado con una hoja de afeitar.
  2. Utilizando una hoja de afeitar, cortar una línea de poca profundidad a lo largo del borde del disco de zafiro; esta línea ayuda a separar el disco de zafiro de la resina epoxi en el paso 5.3.
  3. Separar el disco de zafiro de la resina epoxi por inmersión en nitrógeno líquido durante aproximadamente 10 s.
    NOTA: Las células permanecerán en la resina epoxi.
  4. Después de retirar el disco de zafiro, utilizar un microscopio de disección para encontrar un área con células (4-10X aumentos). Cortar alrededor de la región de interés (~ 2 x 2 mm) usando una cuchilla de afeitar (doble filo). Para mantener el espécimen en su lugar, lleve a cabo este paso, mientras que la muestra se pega en la superficie del microscopio.
  5. Montar la pequeña pieza de plástico (~ 2 x 2 x 5 mm) que contiene las células usando pegamento que contiene cianoacrilato de etilo en un bloque artificial cilíndrica hecha de resina epoxy. Incubar el bloque a 60 ° C durante 1 h.

6. seccionamiento

  1. Utilice un ultramicrotomo a la sección de la muestra.
    1. Recortar la superficie de la muestra de plástico incrustado con un cuchillo de vidrio a una velocidad de 3 mm / s y un espesor de 200 nm / sección. Cortar 4 - 5 secciones de la superficie donde se encuentran los astrocitos.
    2. Cambiar a un cuchillo de diamante y la sección a una velocidad de 0,8 mm / s y un espesor de 40 nm / sección. Cortar 20 - 25 secciones.
  2. Recoger cintas de secciones sobre rejillas de cobre de una sola ranura cubiertas de acetato de polivinilo 0,7% (véasela Tabla de Materiales).

7. Imaging El uso de un microscopio electrónico de transmisión (TEM)

  1. Antes de TEM de formación de imágenes, manchar la sección con acetato de uranilo al 2,5% en metanol durante 5 min.
  2. Lavar el 15x rejilla en 50% de metanol. A continuación, lavar en agua ultrapura 15x, con cada lavado una duración de 30 s.
  3. Brevemente aire seque la sección y coloque la rejilla en un portamuestras de la TEM.
  4. Imagen con una ampliación 93,000X.
  5. Adquirir imágenes.
    NOTA: Imaging se realiza normalmente ciegos a los puntos de tiempo o genotipos, y típicamente ~ 200 imágenes se recogen / punto de tiempo.

Análisis 8. Imagen

  1. Analizar las imágenes mediante un software (por ejemplo, ImageJ) con una macro personalizada (Watanabe, Davis, y Jorgensen, sin publicar).
    NOTA: El x / coordenadas y se registran a partir de vesículas, la membrana plasmática, la membrana zona activa, y todos los otros orgánulos unidos a la membrana en las sinapsis. El fil de textoes la información que contienen se exportan a otro software (por ejemplo, Matlab). Los datos se analizan adicionalmente mediante programas personalizados.

Resultados

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, se realizó "flash-y-Freeze" experimentos en las neuronas del hipocampo de ratón que expresan canalrodopsina. Estas neuronas se congelaron sea de 15 ms o 100 ms después del inicio de la iluminación. Hemos demostrado anteriormente que la exocitosis y la endocitosis de las vesículas sinápticas se producen en las terminales sinápticas en los 15 ms y 100 ms de tiempo de puntos, respectivamente 18. Estos eventos fueron capturados con éxito en los momentos apropiados (Figura 2), lo que sugiere que los experimentos de flash-y-Freeze pueden llevar a cabo con éxito en el congelador de alta presión especializado elegido (véase la Tabla de Materiales).

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Figura 1. carga de la muestra y la programación en la alta presión del congelador. A) mesa de carga de muestra de un alto-pcongelador resión. La placa intermedia, que se muestra en el recuadro para el detalle estructural, se coloca en un CLEM holder para la carga de la muestra. Uno de los semicilindros se coloca en la parte inferior de la tabla de carga de muestra, y el otro está unido con un clip a la cubierta superior. Una vez que se carga la muestra, la placa media se empuja hacia delante a la media-cilindro inferior y la tapa está cerrada para iniciar la congelación. B) conjunto de muestras. El disco de zafiro que contiene neuronas se coloca en el pocillo de la placa media, con el lado de células hacia arriba. Un anillo 100 m se coloca directamente encima del disco de zafiro el interior del pozo. A continuación, un disco de zafiro vacío sumergido en solución salina fisiológica se coloca con la cara hacia abajo solución. Las burbujas de aire deben ser evitados. Finalmente, un anillo de 100 micras y un anillo de 400 micras se colocan ajustadamente anteriormente. Cualquier exceso de líquido se elimina con papel de filtro. C) Una sección transversal de una cápsula de la incrustación con el disco de zafiro sumergido en resina epoxi. el Sappdisco contratar se coloca en la parte inferior de la cápsula, con el lado de la célula hacia arriba y cubierto con resina epoxi para la infiltración y la incrustación. D) Programación del congelador de alta presión para una sola, 10 ms estímulo. Las muestras se congelan 90 ms después de que el pulso de luz. E) Programación del congelador de alta presión durante 10 estímulos a 20 Hz. Las muestras se congelan 5 ms después del último pulso de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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La Figura 2. La visualización de la exocitosis y la endocitosis en el ratón las neuronas del hipocampo. Las neuronas del hipocampo se estimularon una vez y se congelaron a los tiempos indicados. Las micrografías electrónicas muestran la exocitosis de vesículas sinápticas A) y endocitosis ultrarrápida B). PSD, Densidad post-sináptica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El enfoque de "flash-y-congelación" visualiza dinámica de la membrana mediante la inducción de un evento celular particular con la optogenética y mediante la congelación de las células en los puntos de tiempo definidos después de la estimulación 19. En esta demostración, se utilizó canalrodopsina, un canal catiónico sensible a la luz, para estimular las neuronas y capturó la fusión y la recuperación de las vesículas sinápticas en los terminales sinápticas. En los últimos años, muchas herramientas optogenéticos se han desarrollado 22, 23, todos los cuales son compatibles con flash-y-congelación. Por ejemplo, el tráfico de orgánulo puede ser inducida mediante heterodimerización inducida por la luz de criptocromo y CIB1 24. Del mismo modo, la composición lipídica de la membrana plasmática puede ser alterado por la translocación inducida por la luz de las fosfatasas phosphoinositide a la membrana plasmática 25. Además, pequeñas, compuestos sensibles a la luz como ch azobencenoconformación ange dependiendo de las longitudes de onda de iluminación. Este cambio conformacional se puede utilizar para activar los canales activados por ligando o para cambiar la composición de lípidos en la membrana 26, 27. compuestos enjaulados también se pueden utilizar para inducir la actividad celular. Sin embargo, el LED se utiliza en la configuración actual no puede producir suficiente energía para uncaging; Por lo tanto, otras optimizaciones del sistema son probablemente necesario. Sin embargo, las aplicaciones de estas herramientas activable por luz son eventos celulares flexibles-muchos pueden ser inducidas por un destello de luz. "Flash-y-congelación" puede capturar la dinámica de membrana resultantes.

Hay dos principales limitaciones para el método de "destello y congelación". En primer lugar, se capta "instantáneas" de un evento en particular de diferentes células. En otras palabras, no es posible seguir la dinámica de la membrana en una celda durante un período de tiempo. Por lo tanto, para la reconstrucción de cualquier celular, inclusot, uno debe adquirir y analizar un gran número de imágenes de cada muestra y en cada punto de tiempo. Además, en las neuronas, un número aún mayor de las imágenes es necesario, ya que la fusión de las vesículas sinápticas solamente tiene lugar en 20 - 30% de las sinapsis en las neuronas del hipocampo del ratón 18, 28. El análisis de un gran conjunto de datos de este tipo requiere enormes cantidades de tiempo. En el futuro, la adquisición y análisis de imágenes necesitan ser automatizado para hacer el enfoque más eficiente 29, 30.

La segunda limitación es impuesta por la naturaleza de la técnica de congelación de alta presión. Cuando las células se congelan, agua celular reorganiza para formar cristales de hielo si la velocidad de congelación es inferior a 100 K / s 21. Estos cristales de hielo pueden penetrar en las membranas o concentrarse solutos para alterar la presión osmótica local, dando como resultado la rotura de las membranas. Para evitar los cristales de hielo, high presión (~ 2,000 atm) se aplica a los especímenes. Debido al efecto de super-enfriamiento, una velocidad de congelación de 100 K / s es suficiente para evitar que el agua de formación de cristales de hielo a esta presión 21. En teoría, especímenes tan gruesa como de 500 micras se pueden congelar sin cristales de hielo, pero aproximadamente 200 micras es probable el límite práctico, como formas cúbicas de hielo tienden a formar en el tejido de espesor, comprometiendo la morfología. Cuando el procesamiento de muestras más gruesas que 5 m, el uso de un crio-protector adecuado, tal como BSA, es necesario. Sin embargo, BSA va a cambiar la osmolaridad de la solución y puede afectar la respuesta fisiológica de las células. Por lo tanto, se requieren extensos experimentos de control para validar el uso de BSA en sistemas particulares. Los cristales de hielo también se pueden formar después de la congelación de alta presión si los especímenes se retiran accidentalmente desde el baño de nitrógeno líquido. Por lo tanto, es crítico para mantener los especímenes en el nitrógeno líquido en todo momento y para el uso de fórceps preenfriado amanipularlos.

Cuando la planificación de experimentos, los tres puntos siguientes deben ser considerados. En primer lugar, la intensidad máxima de la luz (la línea de 460 nm) es 5,5 a 8,0 mW / mm 2. Si esta intensidad es suficiente para inducir la actividad debe ser verificado con imágenes de células vivas en un microscopio de fluorescencia antes de los experimentos de inflamación y liofiliza. En segundo lugar, los experimentos deben realizarse a temperatura fisiológica. La etapa del congelador de alta presión se calienta hasta 37 ° C para los experimentos con las neuronas del hipocampo del ratón 31. Por último, los puntos de tiempo deben ser elegidos cuidadosamente para capturar la dinámica de la membrana. Los estudios iniciales indicaron que la endocitosis es completa después de 100 ms de estimulación. Por lo tanto, los tres puntos de tiempo adicionales (15, 30, y 50 ms) también fueron examinados para seguir la dinámica de la membrana 17, 18. Estos puntos de tiempo fueron necesarios para visualizar caso el tráfico de membranas durante la transmisión sináptica. Sin embargo, el requisito para el número de puntos de tiempo son diferentes en cada evento celular. Por lo tanto, algunos puntos de tiempo deben ser muestreados antes de iniciar la recogida de datos de gran tamaño.

Divulgaciones

Publicación de acceso abierto de este artículo fue patrocinado por Leica Mikrosysteme GmbH.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Johns Hopkins University (SW). Agradecemos a la Escuela Johns Hopkins de instalación de medicina microscopio por su apoyo técnico. Agradecemos a Erik Jorgensen y Christian Rosenmund y los miembros de sus laboratorios para el desarrollo de la técnica. Agradecemos a M. Wayne Davis para el diseño del dispositivo inicial. Agradecemos a Paul Wurzinger, Cveta Tomova y Delgermaa Luvsanjav por su asistencia técnica. Agradecemos también a Natalie R. Hamilton y Grant F. Kusick para su lectura crítica del manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sistema de Sustitución por Congelación e Inclusión a Baja Temperatura para Microscopía Óptica y Electrónica -AFS IILeica 
Congelador de alta presión - EM-ICELeica EM ICE es un congelador de alta presión especializado que permite un control preciso de la estimulación de la luz y la congelación.
OsmómetroGonotec
Ultramicrotomo UC7Leica 
HornoAzul M
Hoja de afeitar Personna
GlutaraldehídoEMS16530
Tetróxido de osmioEMSRT19132Tóxico, abierto solo bajo cubierta química certificada
AcetonaEMS RT10016
HEPESEmdmillipore391340-250GM
GlucosaSigma49159-1KG
KClSigma746436-1KG
NaClSigmaS7653-1KG
CaCl2Sigma 21115-250ML
MgCl2J.T.Baker2444-01
Resina epoxi líquida Eponate 12Ted Pella18028
Resina epoxi de bisfenol A Araldita 502Ted Pella18028
Anhídrido succínico de dodecenil (DDSA)Ted Pella18028
Bencil dimetil amina (BDMA)Ted Pella18241
Cápsula de inclusión especial (BEEM)EMS70021
Rejilla de cobreTed Pella1GC12H Acetato
de polivinilo ( Pioloform F)Ted Pella19244
Acetato de uraniloPolysciences21447-25
Cianoacrilato de etilo (superpegamento)Scotch170497
Trypsin-EDTAThemo scientific25300-120
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)Thermo scientific10569-044Debe calentarse a 37 ° C antes
de usar FBS (Suero Fetal Bovino)Thermo scientific26140-079
Pen-StrepThermo scientific15140-122
Fluoro-desoxiuridina (FUDR)SigmaF0503
Cubreobjetos de vidrioFisherS175223 Debe lavarse con ácido
Disco de zafiroTechnotrade616-100
Acetic ácidoEmdmillipore1000631011
Poly-D-Lisina (PDL)SigmaP6407
Cola de rata colágenoThermo scientificA10483-01
Neurobasal AFisher10888022Debe calentarse a 37 ° C antes
de usar L-alanil-L-glutamina (Glutamax)Fisher35050-079
Suplemento libre de seraum  (B-27) Solución
Hanks (HBSS)Thermo scientific24020117
PapainWorthingtondebe calcularse para cada lote
ThermomixerEppendorf Thermomixer C
Inhibidor de tripsinaSigmaT9253
NBQXTocris03-731-0
BicculineTocris01-091-0
Papel de filtro Whatman I
Philips CM20
salina balanceada de Fisher 17504044 La unidad activa de LS003126 Microscopio electrónico de transmisión GE

Referencias

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