El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores, incluyendo la arquitectura ambiental, la abundancia de los miembros, los rasgos y las interacciones. Este protocolo describe un ambiente sintético y microfabricado para el seguimiento simultáneo de miles de comunidades contenidas en pozos de femtoliter, donde factores clave como el tamaño de nicho y el confinamiento pueden ser aproximados.
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Artículo de método
Montaje y Seguimiento de Desarrollo Comunitario Microbiano dentro de una Plataforma de Matriz de Micropedulos
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores deterministas y estocásticos complejos que pueden alterar drásticamente la distribución espacial y las actividades de los miembros de la comunidad. Hemos desarrollado una plataforma de matriz de micropocillos que se puede utilizar para montar y rastrear rápidamente miles de comunidades bacterianas en paralelo. Este protocolo destaca la utilidad de la plataforma y describe su uso para supervisar ópticamente el desarrollo de comunidades simples de dos miembros dentro de un conjunto de matrices dentro de la plataforma. Esta demostración utiliza dos mutantes de Pseudomonas aeruginosa , parte de una serie de mutantes desarrollados para estudiar la patogenicidad de la secreción de Tipo VI. Las inserciones cromosómicas de los genes mCherry o GFP facilitan la expresión constitutiva de proteínas fluorescentes con distintas longitudes de onda de emisión que pueden usarse para monitorear la abundancia y ubicación de los miembros de la comunidad dentro de cada micropocillo. Este protocolo describe una metodologíaD para ensamblar mezclas de bacterias en los pocillos de la matriz y usar imágenes de fluorescencia en intervalos de tiempo y análisis cuantitativo de imágenes para medir el crecimiento relativo de cada población miembro a lo largo del tiempo. Se discute la siembra y el ensamblaje de la plataforma de micropocillos, los procedimientos de imagen necesarios para el análisis cuantitativo de las comunidades microbianas dentro de la matriz y los métodos que pueden usarse para revelar interacciones entre el área de las especies microbianas.
Introducción
Las comunidades microbianas están formadas por factores deterministas, como la estructura del medio ambiente y los procesos estocásticos, que están asociados con la muerte celular, la división, la concentración de proteínas, el número de organelos y la mutación 1 . Dentro del entorno natural, puede ser casi imposible analizar el impacto individual de estas influencias en la composición y actividad de la comunidad. Obscurecido por las estructuras naturales y enterrado dentro de un medio químico y biológico, la identificación de los miembros de la comunidad y la resolución de su distribución espaciotemporal en el medio ambiente natural es extrem....
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Protocolo
1. Fabricación del Microwell-arsenal del silicio
- Revestimiento de parileno
- Depositar entre 1-1,5 μm de parileno N en obleas de silicio utilizando un sistema de revestimiento de parileno comercialmente disponible según las especificaciones e instrucciones del fabricante (ajustes: punto de consigna del vaporizador = 160 ° C, punto de ajuste del horno = 650 ° C).
NOTA: Aproximadamente 6 g de parileno N cargado en una cámara producen recubrimientos de 1-1,5 μm de espesor.
- Depositar entre 1-1,5 μm de parileno N en obleas de silicio utilizando un sistema de revestimiento de parileno comercialmente disponible según las especificaciones e instrucciones del fabricante (ajustes: punto de consigna del vaporizador = 160 ° C, punto de ajuste del horno = 650 ° C).
- Fotolitografía
- Revestir por centrifugación las obleas revestidas con N de parileno con un promotor de adhesión, ....
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Resultados
La plataforma experimental presentada aquí está diseñada para estudios de alto rendimiento y alto contenido de comunidades bacterianas. El diseño permite que miles de comunidades, que crecen en pozos de diferentes tamaños, sean analizadas simultáneamente. Con este diseño de la matriz de micropocillos, se puede determinar la dependencia de la composición final de la comunidad sobre las densidades iniciales de siembra, el tamaño del pozo y el ambiente químico. Este trabajo demuestra el cre.......
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Discusión
En este artículo se presentó un dispositivo de matriz de micropocillos y protocolos experimentales diseñados para permitir el análisis de alta capacidad y alto contenido de células vivas basados en imágenes del desarrollo de la comunidad bacteriana. Si bien el objetivo de la demostración aquí fue estudiar los efectos de la secreción de tipo VI mediada por contacto en el desarrollo de la comunidad, los arrays fueron diseñados para ser flexible y acomodar el estudio de una amplia gama de comunidades microbianas y las in.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Las matrices de micropocillos se fabricaron y caracterizaron en la División de Instalaciones de Usuarios del Centro de Ciencia de Materiales de Nanofase, Oficina de Ciencias Básicas de Energía, Departamento de Energía de los Estados Unidos. El apoyo financiero para este trabajo se proporcionó a través del Fondo de Investigación y Desarrollo del Director del Laboratorio Nacional de Oak Ridge. Los autores también desean agradecer al Laboratorio J. Mougous (Universidad de Washington, Seattle, WA) por el suministro de cepas de P. aeruginosa usadas en estos estudios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| recubrimiento especial | parileno N | N.º CAS:1633-22-3 | |
| Recubrimiento de parileno | Sistemas de recubrimiento especiales | Labcoter 2 Unidad de deposición de parileno PDS2010 | |
| oblea de silicio | WRS Materiales de | 100 mm de diámetro, 500-550 μ m de espesor, Prime, 10-20 resistividad, N/Phos< 100>, | |
| promotor de adhesión | Shin-Etsu Microsci MicroPrime | P20 promotor | |
| fotorresistente de tono positivo | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (propiedad de Dow) | Microposit S1818 Fotorresistencia positiva (código 10018357) | |
| Quintel Alineador de contacto | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Alineador | |
| Herramienta de grabado iónico reactivo | Oxford Instrumentos | Plasmalab System 100 Grabador | |
| R2A Caldo | TEKnova | R0005 | |
| Albúmina de suero bovino | Sigma | A9647 | |
| Lector de placas multimodo | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 | |
| Microscopio fluorescente | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| Etapa automatizada | Prior | ProScan III | |
| Cámara CCD | Nikon | DS-QiMc | |
| Cámara de control ambiental de nivel superior | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC | |
| Solución salina tamponada con fosfato | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| UltraPure Agarosa | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| 25 x 75 mm No. 1.5 cubreobjetos | Nexterion | Alto rendimiento #1.5H cubreobjetos | |
| Diapositivas de referencia de fluorescencia | Ted Pella | 2273 | |
| Perfilómetro de palpador físico | KLA Tencor | P-6 | |
| toallitas de laboratorio | Kimberly Clark | Kimipe Kimtech SCIENCE Marca, 34155 | |
| software comercial | Nikon | NIS Elements | |
| Zeiss 710 Microscopio confocal | Zeiss | ||
| cubos de filtro | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Rojo (96313) |
Referencias
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
