Montaje y Seguimiento de Desarrollo Comunitario Microbiano dentro de una Plataforma de Matriz de Micropedulos

Summary

El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores, incluyendo la arquitectura ambiental, la abundancia de los miembros, los rasgos y las interacciones. Este protocolo describe un ambiente sintético y microfabricado para el seguimiento simultáneo de miles de comunidades contenidas en pozos de femtoliter, donde factores clave como el tamaño de nicho y el confinamiento pueden ser aproximados.

Abstract

El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores deterministas y estocásticos complejos que pueden alterar drásticamente la distribución espacial y las actividades de los miembros de la comunidad. Hemos desarrollado una plataforma de matriz de micropocillos que se puede utilizar para montar y rastrear rápidamente miles de comunidades bacterianas en paralelo. Este protocolo destaca la utilidad de la plataforma y describe su uso para supervisar ópticamente el desarrollo de comunidades simples de dos miembros dentro de un conjunto de matrices dentro de la plataforma. Esta demostración utiliza dos mutantes de Pseudomonas aeruginosa , parte de una serie de mutantes desarrollados para estudiar la patogenicidad de la secreción de Tipo VI. Las inserciones cromosómicas de los genes mCherry o GFP facilitan la expresión constitutiva de proteínas fluorescentes con distintas longitudes de onda de emisión que pueden usarse para monitorear la abundancia y ubicación de los miembros de la comunidad dentro de cada micropocillo. Este protocolo describe una metodologíaD para ensamblar mezclas de bacterias en los pocillos de la matriz y usar imágenes de fluorescencia en intervalos de tiempo y análisis cuantitativo de imágenes para medir el crecimiento relativo de cada población miembro a lo largo del tiempo. Se discute la siembra y el ensamblaje de la plataforma de micropocillos, los procedimientos de imagen necesarios para el análisis cuantitativo de las comunidades microbianas dentro de la matriz y los métodos que pueden usarse para revelar interacciones entre el área de las especies microbianas.

Introduction

Las comunidades microbianas están formadas por factores deterministas, como la estructura del medio ambiente y los procesos estocásticos, que están asociados con la muerte celular, la división, la concentración de proteínas, el número de organelos y la mutación ¹ . Dentro del entorno natural, puede ser casi imposible analizar el impacto individual de estas influencias en la composición y actividad de la comunidad. Obscurecido por las estructuras naturales y enterrado dentro de un medio químico y biológico, la identificación de los miembros de la comunidad y la resolución de su distribución espaciotemporal en el medio ambiente natural es extrem....

Protocol

1. Fabricación del Microwell-arsenal del silicio

1. Revestimiento de parileno
   1. Depositar entre 1-1,5 μm de parileno N en obleas de silicio utilizando un sistema de revestimiento de parileno comercialmente disponible según las especificaciones e instrucciones del fabricante (ajustes: punto de consigna del vaporizador = 160 ° C, punto de ajuste del horno = 650 ° C).
      NOTA: Aproximadamente 6 g de parileno N cargado en una cámara producen recubrimientos de 1-1,5 μm de espesor.
2. Fotolitografía
   1. Revestir por centrifugación las obleas revestidas con N de parileno con un promotor de adhesión, he....

Results

La plataforma experimental presentada aquí está diseñada para estudios de alto rendimiento y alto contenido de comunidades bacterianas. El diseño permite que miles de comunidades, que crecen en pozos de diferentes tamaños, sean analizadas simultáneamente. Con este diseño de la matriz de micropocillos, se puede determinar la dependencia de la composición final de la comunidad sobre las densidades iniciales de siembra, el tamaño del pozo y el ambiente químico. Este trabajo demuestra el cre.......

Discussion

En este artículo se presentó un dispositivo de matriz de micropocillos y protocolos experimentales diseñados para permitir el análisis de alta capacidad y alto contenido de células vivas basados ​​en imágenes del desarrollo de la comunidad bacteriana. Si bien el objetivo de la demostración aquí fue estudiar los efectos de la secreción de tipo VI mediada por contacto en el desarrollo de la comunidad, los arrays fueron diseñados para ser flexible y acomodar el estudio de una amplia gama de comunidades microbianas y las in.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
recubrimiento especial	parileno N	N.º CAS:1633-22-3
Recubrimiento de parileno	Sistemas de recubrimiento especiales	Labcoter 2 Unidad de deposición de parileno PDS2010
oblea de silicio	WRS Materiales de	100 mm de diámetro, 500-550 μ m de espesor, Prime, 10-20 resistividad, N/Phos< 100>,
promotor de adhesión	Shin-Etsu Microsci MicroPrime	P20 promotor
fotorresistente de tono positivo	Rohm and Haas Electronics Materials LLC (propiedad de Dow)	Microposit S1818 Fotorresistencia positiva (código 10018357)
Quintel Alineador de contacto	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Alineador
Herramienta de grabado iónico reactivo	Oxford Instrumentos	Plasmalab System 100 Grabador
R2A Caldo	TEKnova	R0005
Albúmina de suero bovino	Sigma	A9647
Lector de placas multimodo	Perkin Elmer	Enspire, 2300-0000
Microscopio fluorescente	Nikon	Eclipse Ti-U
Etapa automatizada	Prior	ProScan III
Cámara CCD	Nikon	DS-QiMc
Cámara de control ambiental de nivel superior	In Vivo Scientific	STEV ECU-HOC
Solución salina tamponada con fosfato	ThermoFisher Scientific	14190144
UltraPure Agarosa	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm No. 1.5 cubreobjetos	Nexterion	Alto rendimiento #1.5H cubreobjetos
Diapositivas de referencia de fluorescencia	Ted Pella	2273
Perfilómetro de palpador físico	KLA Tencor	P-6
toallitas de laboratorio	Kimberly Clark	Kimipe Kimtech SCIENCE Marca, 34155
software comercial	Nikon	NIS Elements
Zeiss 710 Microscopio confocal	Zeiss
cubos de filtro	Nikon	Nikon FITC (96311), Nikon Texas Rojo (96313)