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Artículo de método

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como

18.1K vistas

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DOI:

10.3791/55704

⸱

8 de junio de 2017

 ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Harvard Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es demostrar la preparación, cultivo, tratamiento e inmunotinción de los explantes cocleares murinos neonatales. La técnica puede utilizarse como una herramienta de cribado in vitro en la investigación auditiva.

Resumen

Aunque ha habido notables avances en la investigación auditiva durante las últimas décadas, todavía no hay cura para la Pérdida de la Audición Sensorineural (SNHL), una condición que típicamente implica daño o pérdida de las delicadas estructuras mecanosensoriales del oído interno. Los ensayos sofisticados in vitro y ex vivo han surgido en los últimos años, permitiendo la selección de un número creciente de compuestos potencialmente terapéuticos, al tiempo que se minimizan los recursos y se aceleran los esfuerzos para desarrollar curas para SNHL. Aunque los cultivos homogéneos de ciertos tipos de células siguen desempeñando un papel importante en la investigación actual, muchos científicos ahora se basan en cultivos organotípicos más complejos de orejas internas murinas, también conocidas como explantes cocleares. La preservación de estructuras celulares organizadas dentro del oído interno facilita la evaluación in situ de diversos componentes de la infraestructura coclear, incluyendo las células ciliadas internas y externas, neuronas ganglionares espirales, neuronasItes y células de soporte. Aquí presentamos la preparación, cultivo, tratamiento e inmunotinción de los explantes cocleares murinos neonatales. La cuidadosa preparación de estos explantes facilita la identificación de mecanismos que contribuyen al SNHL y constituye una herramienta valiosa para la comunidad de investigadores de audición.

Introducción

La Pérdida Auditiva Sensorineural (SNHL) refleja daños en el oído interno o en la vía auditiva ascendente. Mientras que la pérdida auditiva es el déficit sensorial más común en los seres humanos 1 , las terapias curativas aún no existen 2 . Aunque los implantes cocleares o auditivos del tronco encefálico pueden restaurar un cierto grado de audición a los pacientes con SNHL severa a profunda, la audición proporcionada por estos dispositivos sigue siendo muy diferente de la audición "natural", especialmente durante los intentos de entender el habla o escuchar música.

Si bien la degeneración de las células ciliadas se ha considerado durante mucho tiempo como la consecuencia primaria de los eventos auditivos traumáticos ( por ejemplo, la exposición a ruidos fuertes), existe una creciente evidencia de que las sinapsis que transmiten información de las células capilares al nervio auditivo son al menos tan vulnerables al trauma acústico 3 , 4 , 5 > , 6 . Dado que los umbrales audiométricos humanos, el patrón oro actual para la evaluación de la función auditiva, no predicen daño celular específico en el oído interno, se necesitan herramientas más refinadas para detectar la degeneración celular lo antes posible e iniciar un tratamiento adecuado 7 .

Los tratamientos farmacológicos prometedores para la pérdida auditiva se prueban a menudo en cultivos celulares homogéneos in vitro , pero estos sistemas no modelan con precisión el microambiente coclear. Se sabe que las células cocleares segregan factores tróficos que influyen en otros tipos de células dentro de la cóclea 8 , 9 , un proceso crucial in vivo que se pierde cuando el órgano de Corti 10 , 11 o neuronas ganglionares espirales (SGN) 12 se cultivan en aislamiento o cuando Se analizan marcadores molecularesSin embargo, los estudios in vivo que pueden ser necesarios para la validación de datos in vitro para establecer nuevos tratamientos personalizados para la pérdida auditiva en la búsqueda de "medicina de precisión" requieren recursos y tiempo significativos, lo que es especialmente relevante cuando se considera Cuánto esfuerzo se requiere para perfeccionar y realizar las inyecciones de membrana de oído medio o de ventana redonda con pruebas auditivas y la subsiguiente disección de monturas cocleares enteras El cribado eficiente de compuestos prometedores en cultivos organotípicos ex vivo conocidos como explantes cocleares proporciona una alternativa económica y confiable 14 , 15 , 16 , 17 .

Este artículo detalla un protocolo para generar, mantener y evaluar explantes cocleares tratados. Se destacan las aplicaciones específicas para este modelo, incluyendo su uso en elDe compuestos potencialmente terapéuticos y la evaluación comparativa de vectores virales para la terapia génica. Un ex vivo explante enfoque permite a los investigadores para visualizar los efectos de un determinado tratamiento en diferentes poblaciones celulares in situ , lo que facilita la identificación de los tipos de células específicas de los mecanismos y el posterior perfeccionamiento de la terapéutica objetivo.

En general, esta técnica proporciona un modelo para estudiar la cóclea ex vivo, a la vez que preserva vital cruce entre los diferentes tipos de células que coexisten dentro de la cóclea.

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Protocolo

El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Massachusetts Eye and Ear. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial.

1. Preparación de la disección

  1. Preparación de la mesa quirúrgica
    1. Use etanol al 70% para desinfectar la mesa quirúrgica.
    2. Coloque dos almohadillas de preparación no estériles junto al microscopio.
    3. Prepare la bandeja del instrumento, incluyendo tijeras de operación esterilizadas por calor, una manija de bisturí, un cuchillo micro, y fórceps (dos de cada uno de # 4 y # 55). Coloque la bandeja del instrumento y una placa de petri de 50 mm de paredes claras con fondo de vidrio sobre una almohadilla no estéril.
    4. Obtenga una cuchilla de bisturí estéril # 15; Una bolsa o recipiente de plástico sellable (para disponer de las canales de acuerdo con las directrices institucionales); Hielo en un cubo; Y solución de sal equilibrada, fría y estéril Hank (HBSS). Coloque estos elementos en elOtra almohadilla no estéril.
    5. Transfiera el HBSS en un tubo de laboratorio plástico de 50 ml y colóquelo en hielo.
  2. Preparando el cultivo
    1. Prepare todos los materiales en una campana de flujo laminar. Por cada cuatro muestras, coloque cuatro tapas de vidrio redondo de 10 mm en autoclave en las cuatro incrustaciones de la placa de Petri de 4 pocillos de 35 mm.
    2. Para cada 4 muestras, mezcle un volumen total de 300 μL que conste de lo siguiente en un tubo de microcentrífuga: 10 μl de adhesivo tisular, 285 μL de NaHCO3 y 5 μL de NaOH.
    3. Colocar 45 μL de la solución resultante en cada cubreobjetos y dejarlo allí durante al menos 20 minutos a TA; Esta solución se puede dejar en el cubreobjeto durante varias horas, pero no se puede dejar O / N.
    4. Coloque una o dos placas Petri de 4 pocillos de 35 mm en una placa de Petri de 10 cm para crear dos barreras contra la contaminación.
    5. Preparar un medio de cultivo que contenga 98% de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 1% de N - 2 y 1% de ampicilina (65 μL por pocillo en un tubo (micro) centrífugo). Calentar la solución a 25 ° C antes de su uso.

2. Dissección del explante coclear murino

  1. Decapitación del ratón neonatal
    1. Obtenga una placa de Petri de plástico de 60 mm y rocíe 70% de etanol en su tapa para que la superficie esté mojada.
    2. Vierta HBSS frío del tubo de laboratorio de plástico en la parte inferior del plástico de 60 mm y la placa de petri de fondo transparente de 50 mm de paredes claras. Guarde el tubo de laboratorio de plástico y las dos placas de Petri sobre hielo para mantener el tejido frío siempre que no se esté disectando.
    3. Coloque un ratón neonatal de edad P3 - P5 sobre hielo en un dedo de corte de un guante de látex y espere hasta que la hipotermia induzca pérdida de conciencia (aproximadamente 1-3 minutos).
    4. Decapitar el ratón rápidamente con las tijeras de funcionamiento y disponer del cuerpo en la bolsa de plástico sellable. Coloque la cabeza cortada del recién nacido70% de etanol en la tapa de la placa de petri plástica de 60 mm.
  2. Disección macroscópica del hueso temporal
    1. Retire la piel del cráneo haciendo un corte superficial desde el extremo anterior al posterior (directamente sobre la sutura sagital) usando la cuchilla del bisturí.
    2. Cortar ambos canales auditivos externos con la cuchilla del bisturí y doblar la piel anteriormente para exponer el cráneo entero.
      NOTA: Aunque normalmente no se necesita un microscopio de disección para este paso, se puede utilizar para una mejor visualización.
    3. Abra el cráneo a lo largo de la sutura sagital usando la cuchilla # 15 del escalpelo. Asegúrese de cortar el cráneo moviendo suavemente la hoja hacia arriba y hacia abajo desde la parte anterior a la posterior para evitar la compresión de las cócleas.
      NOTA: El cráneo no debe ser osificado a esta edad y debe cortarse fácilmente.
    4. Retire y deseche el hocico haciendo un corte vertical directamente posterior a las órbitas usando el escalpelo # 15espada.
      NOTA: La parte posterior del cráneo debe todavía contener el cerebro y las cócleas.
    5. Deseche el cerebro anterior, el cerebelo y el tronco encefálico mediante disección romo con pinzas # 4.
  3. Extracción microscópica de las cócleas
    1. Ajuste el microscopio (ampliación de 6,5X) y la fuente de luz colocando pinzas bajo el alcance y optimizando la iluminación y el enfoque.
    2. Coloque las dos mitades del cráneo en la placa de petri de plástico de 60 mm llena de HBSS frío.
    3. Exponga completamente la cóclea, identificable como adyacente a la arteria estapedial circundante (una arteria tortuosa dentro del hueso temporal), y separe sin rodeos el órgano del hueso temporal usando una pinza # 4.
    4. Transferir la cóclea en la placa de 50 mm, de paredes claras, de fondo de vidrio petri y la posición del plato bajo el microscopio.
    5. Coloque la placa de petri de 60 mm de plástico con la otra mitad del cráneo sobre hielo.
      6. Retire la cóclea del sistema vestibular y disecar cuidadosamente la cápsula otica coclear (típicamente cartilaginosa a esta edad) con una pinza # 4. Utilice fórceps # 55 para todos los pasos adicionales.
  4. Pasos finales del procesamiento de tejidos
    1. Continuar con el procesamiento del tejido del oído interno separando cuidadosamente el ligamento espiral adherente al órgano de Corti del resto de la cóclea y el modiolo usando el micro cuchillo o dos fórceps.
      1. Corte en el área más oscura y translúcida en la grieta entre el ligamento espiral y la región de la célula del pelo y proceda a la subsiguiente eliminación del ligamento espiral agarrándolo en el aspecto más basal y desenrollándolo suavemente mientras se mueve apical.
    2. Coloque la muestra para obtener una vista longitudinal y sagital de la cóclea y corte la cóclea en dos o tres secciones utilizando el micro cuchillo, clasificando estas secciones como apical, (medio,) ybSe vuelve Quitar el tejido superior e inferior a la capa real de las células ciliadas y neurites con el fin de lograr una pieza de coclear explante que puede colocar horizontalmente en la placa de Petri.
      NOTA: Un tamaño apropiado para la adhesión estable al plato de cultivo es aproximadamente la mitad de un giro coclear.
    3. Retire la membrana tectorial, una capa translúcida muy delgada inmediatamente superior al órgano de Corti, suavemente pelándola con fórceps.
    4. Quitar la membrana de Reissner, inmediatamente superior a los SGN, por tocarla con fórceps en ambos lados y pelar lejos.
      NOTA: Retire las áreas de las células del cabello dañadas lateralmente localizadas cortándolas con el micro cuchillo.

3. Transferencia de especímenes a las placas de cultivo

  1. Retire los 45 μl de solución de adhesivo tisular de los cuatro cubreobjetos. Lavar cada cubreobjetos con 50 μl de H 2 O estéril. Aspirar el agua.
  2. Recoja la pipeta de 1 ml. Humedezca la punta de la pipeta con aproximadamente 120 μL de DMEM para evitar que la muestra se adhiera al interior de la punta.
  3. Transferir los especímenes individualmente usando la pipeta de 1 ml. Pipetear un máximo de 70 μL de la placa petri pequeña, de paredes claras, de fondo de vidrio y coloque la muestra junto con el líquido en una de las 4 incrustaciones (preparadas con tapas) en la placa de petri de 4 pocillos .
  4. Compruebe bajo el microscopio (ampliación 50X) que la muestra está en la orientación correcta. Asegúrese de que el área de las células capilares a partir de la cual se retiró la membrana tectorial está orientada hacia arriba. Asegúrese de que la membrana basilar, junto con la parte basal recortada del modiolo, esté orientada hacia abajo y se adhiera al cubreobjetos.
    1. Si el espécimen está orientado al revés tras la inspección, deposite el HBSS que permanece en la punta de la pipeta en la incrustación y reposicione la pieza hasta que esté correctamente orientada.
      NOTE: Esto evitará que las células capilares floten en el medio de cultivo sin el apoyo estructural de la cubreobjetos, lo que podría conducir a la degeneración.
  5. Aspirar el exceso de HBSS usando la pipeta de 1 ml. Espere 15 s.
  6. Pipetar 60 μL del medio de cultivo caliente preparado (98% de DMEM, 1% de N-2 y 1% de ampicilina) directamente sobre la muestra. Tenga cuidado de no tocar el espécimen con la pipeta. Reemplazar las cubiertas de la placa de petri interior y exterior e incubar O / N a 37 ° C.
  7. Coloque todas las soluciones madre en sus lugares apropiados, deseche las canales y los residuos residuales, descontaminar la tabla quirúrgica de acuerdo con las directrices institucionales ( por ejemplo, utilizando etanol o hipoclorito), limpiar y esterilizar en autoclave los instrumentos y descartar los objetos punzocortantes en el recipiente apropiado .

4. Adición de medios de cultivo finales y sustancias de interés

NOTA: Los explantes cocleares estarán listos para su uso 10-16 h después.

  1. Preparar una mezcla(97% de DMEM, 1% de suero bovino fetal (FBS), 1% de N-2 y 1% de ampicilina (65 μL por pocillo en un tubo de microcentrífuga, calentar la solución a 25 ° C antes de su uso).
  2. Añadir otras sustancias de interés para las soluciones para los grupos de tratamiento respectivos. Si se añaden sustancias fluorescentes ( por ejemplo, los virus que expresan la proteína fluorescente verde (GFP), en una publicación reciente, se utilizó una concentración de 10 10 GC de virus adeno-asociados (AAV) durante 48 h en 50 μl) 18 , ligero.
  3. Transferir las placas petri que contienen el explante coclear de la incubadora y colocarlas debajo de la campana de flujo laminar.
  4. Aspirar el medio de cultivo antiguo (sin FBS) con la pipeta de las incrustaciones.
  5. Añadir 60 μL por pocillo del medio de cultivo caliente (tratamiento) preparado (97% de DMEM, 1% de FBS, 1% de N-2, 1% de ampicilina y las sustancias de interés).
  6. Coloque la placa de Petri de nuevo en la incubadora (37 ° C).
  7. Vista rPor ejemplo, bajo el microscopio para identificar signos de contaminación, migración celular o desprendimiento del explante coclear y realizar tinción después de un máximo de 7 días.

5. Inmunofluorescencia - Día 1

  1. Preparar una solución de bloqueo (solución salina tamponada con fosfato al 94% (PBS), suero normal de cabra o caballo al 5% (NGS / NHS, dependiendo de los anticuerpos secundarios) y un 1% de tensioactivo no iónico (véase la tabla de materiales ) (98,6% de PBS, 1% de NHS y 0,4% de tensioactivo no iónico con los respectivos anticuerpos).
    NOTA: Los anticuerpos incluyen anti-Myo7A de conejo a una concentración de 1: 400+ (miosina 7A, para células ciliadas interiores y exteriores) y ratón anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulina, para SGNs) OR ratón (IgG1) anti 1: 50+ (densidad postsináptica, para postsinapse), y pollo anti - NF - H 1: 1000+ (neurofilamento, proteína de unión c - terminal para presinapse) Para SGNs y fibras nerviosas). MeaNs "o superior."
  2. Aspirar el medio de cultivo con una pipeta. Tenga cuidado de no tocar la muestra.
  3. Bajo la campana de flujo laminar, enjuague los explantes cocleares dos veces con PBS estéril, colocando los especímenes en un agitador durante 5 min después de cada lavado.
  4. Fijar el tejido en 4% de paraformaldehído (PFA - PRECAUCIÓN) durante 20 minutos en el agitador (debajo de la campana). Aspirar la PFA.
  5. Aplique 60 μL de PBS a los explantes cocleares y coloque la placa de Petri en un agitador durante 5 min. Aspirar el PBS. Repita 3x.
  6. Colocar los explantes cocleares en una solución de bloqueo preparada (94% de PBS, 5% de NHS y 1% de tensioactivo no iónico) durante 30 minutos en el agitador.
  7. Colocar los explantes cocleares en una solución de anticuerpo de reserva preparada (98,6% de PBS, 1% de NHS y 0,4% de tensioactivo no iónico) con los respectivos anticuerpos primarios (vórtice antes del uso) O / N en un contador a RT.
    NOTA: Envuelva las placas de Petri con toallas de papel húmedas envueltas en una envoltura de plástico (o papel de aluminio si la solución agregadaIon contiene materiales fluorescentes tales como virus que expresan GFP) para mantener los platos húmedos y para evitar la evaporación de la solución de anticuerpos O / N.

6. Inmunofluorescencia - Día 2

  1. Preparar la tinción 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (300 nM) y utilizar la solución madre de anticuerpo para obtener las mezclas secundarias de anticuerpos correctas, complementarias de los anticuerpos primarios en la etapa 5.1. ( P. Ej ., Cabra anti-ratón 488 1: 200+ y cabra anti-ratón 568 1: 200+ O cabra anti-ratón (IgG1) 568 1: 1000+, cabra anti-ratón (IgG2a) 488 1: 500+, Y cabra anti-pollo 647 1: 200+ OR Phalloidin 568 1: 200+ (para las células ciliadas interiores y exteriores)).
  2. Aspirar la solución de anticuerpos primarios.
  3. Aplique 60 μL de PBS a los explantes cocleares y coloque la placa de Petri en un agitador durante 5 min. Aspirar el PBS. Repita 3x.
  4. Colocar los explantes cocleares en solución madre de anticuerpo preparada (98,6% de PBS, 1% de NHS y 0,4% de tensioactivo no iónico) con la res(Vórtice antes del uso) durante 1,5 h en un mostrador y protegerse de la luz.
  5. Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y enjuagar los explantes cocleares con una tinción DAPI (colocar en un agitador durante 1 min y luego aspirar).
  6. Aplique 60 μL de PBS a los explantes cocleares y coloque la placa de Petri en un agitador durante 5 min. Aspirar el PBS. Repita 3x.
  7. Use una pinza para quitar cubreobjetos con muestras de la placa de 4 pocillos, sumerja en un recipiente lleno de H2O destilada y seque los cubreobjetos poniéndolos en contacto vertical con las toallas de papel.
  8. Coloque una gota de medio de montaje antifade en el portaobjetos del microscopio e invierta los cubreobjetos para sumergir el tejido hacia abajo en el medio.
  9. Selle el cubreobjetos utilizando un esmalte transparente que cubre circunferencialmente el borde (sin aplastar el espécimen debajo del cristal). Deje las diapositivas acostadas en un área cubierta lejos de la luz durante 15 - 20 min hasta que se sequEn lugar de ellos en una caja o examinar bajo el microscopio confocal.
    NOTA: La tinción fluorescente se conserva mejor almacenando los portaobjetos a 4 o -20 ° C.

7. Imágenes confocales

  1. Obtenga una visión general y imágenes ampliadas para el órgano de la región de Corti, incluyendo neuritas y SGNs.
    NOTA: Ajustes estándar para el proceso de imagen: Formato de 1.024 x 1.024 píxeles, velocidad de 400 Hz, promedio de fotogramas de 3, 20% de intensidad total del láser y, usualmente, lentes de 20X y 63X con inmersión en aceite (potencialmente combinado con zoom digital de 2X). Los ajustes de canal para el protocolo de tinción DAPI, Myo7A y TuJ1 se describen anteriormente: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766,8V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% isotiocianato de fluoresceína (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% de isotiocianato de tetrametilrhomadina (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%.
  2. Combina las imágenes en una pila z con laSoftware para obtener una proyección del eje z.

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Resultados

Mientras muchos protocolos se centran en el órgano de los explantes de Corti, esta técnica intenta preservar la anatomía de todo el giro coclear, incluyendo los SGN. Esto da a los investigadores la oportunidad de analizar los efectos de un determinado tratamiento en neurites y somata de SGNs además del órgano de Corti. Realizar una disección que conserva parte del modiolo, como se describe aquí, es técnicamente más difícil que explantar el órgano de Corti solo. Sin embargo, la neurita y ...

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Discusión

Los investigadores deben perfeccionar la técnica de disección antes de llevar a cabo experimentos relacionados con explantes cocleares. Las células ciliadas son comúnmente dañadas durante las disecciones realizadas en las primeras etapas de la curva de aprendizaje, y un momento particularmente problemático para su integridad es la eliminación de la membrana tectorial, que requiere manos estables, herramientas adecuadas y experiencia. Para ahorrar tiempo y recursos, se debe realizar un control visual bajo el microscopio ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Sordera y otros trastornos de la comunicación subvenciones R01DC015824 (KMS) y T32DC00038 (apoyo SD), el Departamento de Defensa W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fundación Bertarelli (KMS), el Nancy Sayles Day Foundation (KMS) y el Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Damos las gracias a Jessica E. Sagers, BA por comentarios perspicaces sobre el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ampicilina, sal de sodioInvitrogen11593-027
anticuerpo anti-CtBP2, ratón (IgG1)BD Transduction Laboratories612044
anticuerpo anti-Myo7A, conejoProteus Biosciences25-6790
anticuerpo anti-NF-H, polloEMD MilliporeAB5539
anticuerpo anti-PSD95, ratón(IgG2a)Anticuerpos Inc.75-028
Anticuerpo anti-TuJ1 de ratón,BioLegend801202
Cell-Tak de ratón Adhesivo para células y tejidos, 5 mgTubos de354241
CELLSTAR de 15 mL, fondo cónico, graduación, estérilGreiner Bio-One188161
CELLSTAR Placa de cultivo celular, 100 x 20 mmGreiner Bio-One664160
CELLSTAR Plato de cultivo celular, 35 x 10 mm, 4 anillos interioresGreiner Bio-One627170
CELLSTAR Plato de cultivo celular, 60 x 15 mmGreiner Bio-One628160
CELLSTAR 50 mL Tubos de centrífuga, fondo cónico, graduación, estérilGreiner Bio-One227261
Esmalte de uñas transparenteCiencias de la Microscopía Electrónica72180
Platos con fondo de vidrio de pared transparente (vidrio de 40 mm), PELCO®, Funda/20, 50 x 7 mmTed Pella Inc.14027-20
Cubreobjetos, Redondos, Vidrio, 10 mm de diámetro, Espesor #1, 0.13 - 0.16mmTed Pella Inc.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)Thermo Fisher ScientificD1306
Agua destilada, 500 mLThermo Fisher Scientific15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), alto contenido de glucosa, piruvato, sin glutamina, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
Pinzas Dumont #4Fine Science Tools11241-30
Dumont #55 Pinzas (Dumostar)Fine Science Tools11295-51
Alcohol etílico (EtOH), puro, 200 grados, anhidro, ≥ 99.5%Sigma-Aldrich459836-1L Suero
fetal bovino (FBS), calificado, regiones aprobadas por el USDA, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028 Alícuota en tubos de 50 mL y almacenar en -20° C congelador
anti-pollo de cabra-647 anticuerpo secundarioThermo Fisher ScientificA-21469
anti-ratón de cabra (IgG)-568 anticuerpo secundarioThermo Fisher ScientificA-11004
anti-ratón de cabra (IgG1)-568 anticuerpo secundarioThermo Fisher ScientificA-21124
anti-ratón de cabra (IgG2a)-488 anticuerpo secundarioThermo Fisher ScientificA-21131
anticuerpo secundario anti-conejo-488 para cabrasThermo Fisher ScientificR37116
H2O, estéril, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mLEMD MilliporeTMS-006-B
Solución salina equilibrada de Hank's (HBSS), calcio, magnesio, rojo sin fenol, 500 mLThermo Fisher Scientific14025-092
Bandeja de instrumentos con tapa Acero inoxidableMountainside MedicalTechMed4255
Micro (disección) cuchillo – angulado 30°Fine Science Tools10056-12
Portaobjetos de microscopio, VistaVision, codificados por colores, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm de grosor, blanco, paquete de 72VWR16004-382
N-2 Suplemento (100X), 5 mLThermo Fisher Scientific17502-048
NaHCO3, solución de bicarbonato de sodio al 7,5 %, 100 mlThermo Fisher Scientific25080-094
NaOH, solución de hidróxido de sodio, 1 LThermo Fisher ScientificSS266-1
Suero normal para caballos (NHS)Invitrogen16050130
Tijeras de operaciónRoboz Surgical Instruments Co.RS-6806
Paraformaldehído (PFA), grado reactivo, cristalinoSigma-AldrichP6148Antes de usar: Establezca procedimientos operativos estándar basados en protocolos disponibles en línea
PBS, pH 7.4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023 Autoclave antes de su uso
Faloidina, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher ScientificA12380
, no estéril Medline05136CS
Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 0,5 mLAutoclave Eppendorf022363719antes de usar
Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 1,5 mLAutoclave Eppendorf022363204antes de usar
Hojas de bisturí - #15Fine Science Tools10015-00
Mango de bisturí - #4Fine Science Tools10004-13
Stemi 2000-C Microscopio estereoscópicoZeiss 000000-1106-133
Microscopio confocal TCS SP5LeicaN/A
Triton-X (tensioactivo no iónico)IntegraT756.30.30
Medio de montaje antidecoloración VectaShield para fluorescenciaVector Laboratories, Inc.H-1000
Bolsa con Cremallera, Resellable, 4 x 6'' - 2 mm de grosorZipline 0609132541599
centrífuga Corning 260368Almohadilla de preparación

Referencias

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
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