Racimos del corazón ventricular de eje corto murino para estudios electrofisiológicos

Resumen

Aquí, describimos la preparación de cortes ventriculares viables de ratones adultos y su uso para registros de potencial de acción de electrodos agudos. Estas preparaciones multicelulares proporcionan una estructura de tejido conservada in vivo como, lo que los convierte en un valioso modelo para estudios electrofisiológicos y farmacológicos in vitro .

Resumen

Los cardiomiocitos murinos se han utilizado ampliamente para estudios in vitro de fisiología cardiaca y nuevas estrategias terapéuticas. Sin embargo, las preparaciones multicelulares de cardiomiocitos disociados no son representativas de la compleja estructura in vivo de cardiomiocitos, no miocitos y matriz extracelular, que influye tanto en las propiedades mecánicas como electrofisiológicas del corazón. Aquí se describe una técnica para preparar viable ventricular rodajas de corazones de ratón de adultos con un preservado in vivo como estructura de tejido, y demostrar su idoneidad para electrofisiológicos grabaciones. Después de la excisión del corazón, los ventrículos se separan de las aurículas, se perfunden con solución libre de Ca2 ⁺ que contiene 2,3-butanodiona monóxima y se insertan en un bloque de agarosa de bajo punto de fusión al 4%. El bloque se coloca sobre un micrótomo con una hoja vibrante, y se preparan rebanadas de tejido con un espesor de 150-400 μm, manteniendo la vibración freDe la cuchilla a 60-70 Hz y moviendo la hoja hacia adelante lo más lentamente posible. El espesor de las rebanadas depende de la aplicación posterior. Las rodajas se almacenan en solución de Tyrode helada con Ca2 ⁺ 0,9 mM y 2,3-butanodiona monóxima (BDM) durante 30 min. Después, las rebanadas se transfieren a DMEM a 37ºC durante 30 minutos para lavar el BDM. Los cortes se pueden utilizar para estudios electrofisiológicos con electrodos afilados o matrices de microelectrodos, para mediciones de fuerzas para analizar la función contráctil o para investigar la interacción de cardiomiocitos derivados de células madre trasplantados y tejido huésped. Para grabaciones de electrodo agudo, se coloca una rebanada en un plato de cultivo celular de 3 cm sobre la placa calefactora de un microscopio invertido. La rebanada se estimula con un electrodo unipolar, y los potenciales de acción intracelular de los cardiomiocitos dentro de la rebanada se registran con un electrodo de vidrio afilado.

Introducción

Las rebanadas de tejido fino se han utilizado con frecuencia en la ciencia básica ya que Yamamot y Mcllwain demostraron en 1966 que la actividad eléctrica de las rebanadas del cerebro se mantiene in vitro ¹ . Desde entonces, se han realizado estudios electrofisiológicos y farmacológicos sobre cortes de cerebro ² , hígado ³ , pulmón ⁴ y tejido miocárdico ^{5 , 6 , 7} . En 1990 se describieron las primeras grabaciones de parche-clamp en rodajas ventriculares de corazones de ratas neonatales, pero esta técnica cayó en el olvido durante algún tiempo. Más de una década más tarde, nuestro grupo estableció un nuevo método para preparar murino embrionario ⁹ , neonatal ¹⁰ y adultos ¹¹ rebanadas de corazón. Estos cortes de tejido viable se pueden utilizar para experimentos agudos (trozo de adultoS se pueden cultivar durante varias horas) o experimentos de cultivo a corto plazo (se pueden cultivar por unos días los cortes embrionarios y neonatales). Los cortes muestran in vivo como características electrofisiológicas y una propagación de excitación homogénea según se evaluó mediante un potencial de acción de electrodo nítido y grabaciones de electrodos de microelectrodos ¹¹ . Debido a su morfología "bidimensional", permiten el acceso directo de electrodos de grabación a todas las regiones del ventrículo, lo que las convierte en una herramienta interesante para las investigaciones electrofisiológicas y plantea nuevas opciones experimentales en comparación con los corazones enteros perfundidos de Langendorff. La respuesta de fármacos de los cortes a los bloqueadores de los canales iónicos como el verapamilo (bloqueador del canal de Ca ²⁺ tipo L), lidocaína (bloqueador del canal de Na ⁺ ), 4-aminopiridina (bloqueador de canal de K ⁺ dependiente del voltaje no selectivo) y linopirdina (KCNQ K ^{+ -} bloqueador de canales) ^{9 , 11} correspondieron a efectos conocidos sobre cardiomiocitos disociados. Medidas de fuerza isométrica reveló una relación de frecuencia de fuerza positiva y sugiere fuertemente la función contráctil intacta [ ^10] . Estos hallazgos demostraron que los cortes ventriculares murinos son adecuados como un modelo de tejido in vitro para estudios fisiológicos y farmacológicos. Además, las rodajas ventriculares de los corazones receptores en combinación con registros de electrodos agudos han demostrado ser una herramienta muy útil para caracterizar la integración eléctrica y mecánica, así como la maduración de ¹² cardiomiocitos fetales ^{12 , 13 , 14} y derivado de células madre trasplantados.

En resumen, las rodajas ventriculares son un modelo valioso y bien establecido de tejido multicelular y deben considerarse complementarias a los cardiomiocitos disociados y los corazones perfundidos de Langendorff(En contraste con las células disociadas), así como el acceso directo de las tecnologías de medición como registros de electrodos agudos a todas las regiones del corazón (en contraste con las preparaciones enteras del corazón).

Protocolo

La manipulación de los animales debe ajustarse a las directrices del Comité local del bienestar de los animales ya la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo.

1. Preparar soluciones

1. Preparar la solución de Tyrode sin Ca ²⁺ (composición en mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH ₂ PO ₄ 0,33, MgCl ₂ 1, glucosa 10, HEPES 5, 2,3-butanodiona monóxima (BDM) 30. Ajustar el pH a 7,4 Con NaOH a 4ºC.
2. Preparar la solución de Tyrode con Ca ²⁺ (composición en mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH ₂ PO ₄ 0,33, MgCl ₂ 1, glucosa 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl ₂ 0,9. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH a 4 ° C.
3. Preparar 4% de agarosa de bajo punto de fusión: Poner 0,6 g de agarosa de bajo punto de fusión en 15 ml de solución de Tyrode sin Ca ²⁺ . Calentar la mezcla en un horno de microondas dos veces a 750 W durante 10-15 s hasta que la agarosa se disuelva. Mantener la solución a una temperatura constante de 37 &# 176; C y agitar continuamente.
4. Mantener el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin suero a 37 ° C burbujeado con carbógeno (5% de CO _$ ₂ _$ , 95% de O _$ ₂ _$ ).

2. Preparar el micrótomo

1. Encienda el micrótomo.
2. Llenar la cámara externa del microtome con hielo.
3. Llenar la cámara del microtomo interior con solución de Tyrode helada sin Ca2 ⁺ y oxigenar continuamente la solución con 100% de O2.
4. Coloque una hoja de acero en el porta-cuchilla del micrótomo.

3. Aislamiento del corazón del ratón

1. Inyectar 2.500 U de heparina por vía subcutánea. Esperar 15 min.
2. Sacrificar al animal por dislocación cervical.
3. Abra el pecho por esternotomía.
4. Cuidadosamente disecar el pericardio con tijeras pequeñas y una pinza # 5.
5. Insertar una cánula en la aorta ascendente y perfundir las arterias coronarias in situ con hielo frío TyrodeSin Ca ^{2 +} hasta que se retire la sangre restante.
6. Retirar suavemente el corazón con una pinza y unas tijeras y transferir el corazón en hielo frío solución de Tyrode montado sin Ca ^{2 +} .
7. Separar las aurículas de los ventrículos con un bisturí o unas tijeras.

4. Incorporación de los ventrículos en 4% de Agarosa de bajo punto de fusión

1. Coloque los ventrículos con el ápice hacia arriba en el molde de agarosa ( Figura 1 ). Coloque el pasador en el centro del molde en la cámara ventricular izquierda.
2. Llenar el molde con 4% de agarosa de bajo punto de fusión a 37 ° C, hasta que el corazón está completamente cubierto.
3. Coloque el molde sobre hielo para un endurecimiento más rápido de la agarosa evitando la flotación del tejido.
4. Retire el bloque de agarosa que contiene los ventrículos del molde con un bisturí.
5. Gire el bloque boca abajo y llene las cámaras ventriculares y el hueco en la parte posterior del bloque de agarosa, que iS dejada por el pasador de la muda, con 4% de agarosa de bajo punto de fusión usando una jeringa con una aguja de 20 G.
6. Corte el bloque de agarosa con un bisturí para lograr un fondo plano del bloque y la posición vertical del ápice cardíaco.

5. Rebanado del tejido ventricular

1. Fijar el bloque en el soporte del espécimen del micrótomo con una gota de pegamento de cianoacrilato. Hacer frente al vértice cardiaco hacia arriba.
2. Coloque el porta-espécimen en la cámara del espécimen interno del microtomo, que se llena de Tyrode helado sin Ca ²⁺ . Cubra completamente el bloque de agarosa con la solución de Tyrode.
3. Prepare rebanadas de eje corto con un espesor de 150-400 μm, dependiendo de la aplicación adicional (para grabaciones de electrodos puntiagudos de 150-200 μm), mantenga la frecuencia de vibración de la cuchilla a 60-70 Hz y mueva la hoja hacia adelante lo más lentamente posible .
4. Utilice un cepillo fino para quitar cuidadosamente la agarosa restante de las rebanadas.
5. Suavemente transfeR con una pipeta Pasteur en la solución de Tyrode con Ca2 ⁺ 0,9 mM aireado con 100% de O2 y almacenarlos durante al menos 30 minutos sobre hielo para recuperarse del procedimiento de corte.
6. Después, mantener las rebanadas durante 30 min en DMEM a 37 ° C, aireadas con carbógeno, para lavar el BDM antes de su uso posterior.

6. Preparación de la configuración del electrodo afilado

1. Para el precalentamiento, encienda todos los dispositivos eléctricos 30 minutos antes de que empiecen las grabaciones.
2. Colocar un plato de cultivo celular de 3 cm sobre la placa de calentamiento colocada en el microscopio invertido.
3. Coloque el electrodo de anillo personalizado ( Figura 2 ) en el plato y conecte los cables de conexión a tierra del preamplificador y el electrodo de estimulación.
4. Conecte los tubos flexibles del sistema de perfusión al plato.
5. Llenar el depósito del sistema de perfusión con DMEM, aireado con carbógeno.
6. Encienda la bomba de perfusión y ajuste la perfusiónTe a 2-3 ml / min.
7. Ajuste la temperatura del DMEM en el plato a 37 ° C mediante la regulación del calentador de flujo y la placa calefactora.

7. Grabaciones Potenciales de Acción

1. Coloque una rebanada ventricular en el plato lleno DMEM.
2. Compruebe la integridad estructural y la viabilidad (basada en la función contráctil) del tejido con el microscopio invertido.
3. Llene un electrodo de vidrio de registro con KCL de 3 M.
4. Llene un electrodo de estimulación con DMEM.
5. Coloque el electrodo de registro y el electrodo de estimulación en los portaelectrodos.
6. Coloque el electrodo de estimulación cuidadosamente en la rebanada y encienda el estimulador eléctrico. Comience con una frecuencia de estimulación de 1-2 Hz.
7. Mueva el electrodo de grabación con el micromanipulador sobre la posición de grabación deseada.
8. Baje lentamente el electrodo de registro hasta que la punta toque el tejido.
9. Aplique un pulso eléctrico rectangular corto a través delElectrodo de registro para penetrar en la membrana celular.
10. Reposicione cuidadosamente el electrodo de registro hasta que se asegure una señal estable.
11. Inicie la grabación de los potenciales de acción.

Resultados

El infarto de miocardio conduce a una pérdida virtualmente irreversible de cardiomiocitos. La terapia de reemplazo celular utilizando cardiomiocitos derivados de células madre para la regeneración cardíaca exógena es un enfoque terapéutico prometedor. La integración eléctrica y la maduración de las células trasplantadas son cruciales para la seguridad y la eficacia de la terapia de reemplazo celular.

Para evaluar la integració...

Discusión

Las rodajas ventriculares permiten estudios electrofisiológicos, farmacológicos y mecánicos con una estructura de tejido conservada in vivo como y el acceso directo de la tecnología de medición a todas las regiones del corazón. Las propiedades potenciales de la acción fisiológica se han demostrado en rodajas embrionarias, neonatales y adultas ^{9 , 10 , 11} . La vitalidad de las rodajas, con la excepción de las c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania		Microtomo con cuchilla vibratoria.
Cuchillas de acero inoxidable	Campden Instruments, Loughborough, Inglaterra	7550-1-SS
Pipetas Pasteur	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU.	Z627992
Cepillo fino, p. ej. tamaño 6 (4/32")	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
Mesa			de fabricación propia
Muda para incrustar ventrículos en agarosa			de
1 mL de fabricación propia Jeringa	Becton, Dickinson; Franklin Lakes, EE. UU.	300013 Agujas
de 27 G x 3/4''	Braun, Melsungen, Alemania	4657705
20 G Agujas de 11/2''	4657519
Tijera pequeña	WPI, Sarasota, EE. UU.
#5, punta de 0,1 x 0,06 mm	WPI, Sarasota, EE. UU.	500342
Gas oxígeno (grado médico O2)	Linde, Múnich, Alemania
Gas carbógena (95 % O2, 5 % CO2)	Linde, Múnich, Alemania
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU.	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU.	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU.	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU.	S5761
D(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU.	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU.	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, EE. UU.	S8045
Pegamento de cianoacrilato	Henkel, Dü Sseldorf, Alemania
Agarosa de bajo punto de fusión	Roth, Karlsruhe, Alemania	6351.2
Heparina-sodio-25000 I.E./5 mL	Ratiopharm, Ulm, Alemania
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), alto contenido de glucosa, GlutaMAX	ThermoScientific, Waltham, EE. UU.	10566016
Amplificador SEC-10LX npi	electronic GmbH, Tamm, Alemania	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Alemania
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, Alemania
Micromanipulador de bajo aumento	Narashige, Tokio, Japón	Nm-3
Micromanipulador de tres ejes de alto aumento	Narashige, Tokio, Japón	MHW-3
Bomba	de perfusión peristálticaSistemas multicanal, Reutlingen, Alemania	PPS2
de 2 canales	Sistemas multicanal, Reutlingen, Alemania	TCO02
Estimulador de pulsos cuadrado	Natus Europe GmbH, Planegg, Alemania	Grass SD9
Capilares de vidrio	WPI, Sarasota, EE. UU	1B150F-1

de preparación Pinzas de 501263 . . Controlador de temperatura .