Sobreacumulación de Ileectomy inducida por bilis en intestino de ratón

En investigación biomédica moderna, modelos de animales genéticamente manipulados son ampliamente utilizados para recoger ideas sobre enfermedades humanas. En particular, tejido o célula-funciones específicas de ganancia y la pérdida de genes se han utilizado para estudiar la regulación molecular así como efectos biológicos inducidos. A pesar de los avances en la manipulación de genes diana en vivo, hay limitaciones persistentes. Primero, muchas células o tejido deleciones específicas afecta múltiples órganos. Por ejemplo, canceladura del gene epitelial eliminará la expresión en los epitelios de tejidos múltiples. Además, incluso si la eliminación se limita a un tejido específico, control espacial es raramente factible. Por ejemplo, en un tejido como el intestino, distintos segmentos realizan funciones muy específicas que no pueden manipularse con precisión en vivo. En estas situaciones, la resección de los tejidos que contienen el gen se considera un enfoque de estudio más eficiente para determinar el significado funcional y mecanicista de la comunicación del tejido.

Ileectomy es sobre todo utilizado en pacientes con Crohn y enfermedades inflamatorias que involucra el íleo distal ^1,2,3. El íleon normalmente produce varias hormonas de almacenamiento de energía como factor de crecimiento fibroblástico 15/19 (FGF15/19), péptido YY (PYY) y péptido similar al glucagón GLP1/2; 1/2 estas hormonas desempeñan importantes funciones locales y endocrinas en muchas funciones biológicas^4,5,6. Entre estas hormonas, FGF15 ha sido identificado como un robusto endocrino inhibidor de síntesis de ácidos biliares en el hígado. Una vez reabsorbido en enterocitos ileales, ácidos biliares activan el receptor de farnesoid X receptor nuclear (FXR) para estimular la expresión de Fgf15 , que posteriormente conduce a la inhibición de la regeneración de la síntesis de ácido biliar hepática ⁷. En un estudio reciente, introdujo el modelo de ileectomy de ratón para estudiar el íleon kruppel-like factor 15 (KLF15) -Fgf15 señalización eje que regula la producción de los ácidos biliares en el hígado ⁸. Lo más importante, hemos introducido a una nueva familia, los factores kruppel-like, particularmente KLF15, en Biología del ácido de bilis. Basado en estudios funcionales, incluyendo la ileectomy, se determinan KLF15 estimula ácido de bilis síntesis a través de un mecanismo indirecto de no-hepático. Por último, KLF15 ileal también se identifica como el primer regulador negativo endógeno de Fgf15.

Los segmentos intestinales desde proximal a distales regiones son responsables de la absorción de diferentes nutrientes. El íleon es el segmento principal responsable de ácido biliar y vitamina B₁₂ (v._B12) absorción ⁹. Un estudio anterior empleó un modelo de ratón de la resección de intestino proximal para estudiar el síndrome de intestino corto; varias longitudes de resección, las dietas y tipos de sutura se propusieron mantener una tasa de supervivencia después de la cirugía óptima del ¹⁰. Además, una revisión más reciente indica que la resección ileal típicamente resulta en una enfermedad más severa que otras resecciones de segmentos gastrointestinales (GI) debido a la disminuida capacidad de adaptación de los restantes de la zona ¹¹. Este tema ha ganado a intensivo intereses de grupos de investigación básica y clínica, mientras que la comprensión de los enfoques terapéuticos eficaces y recuperación son todavía limitadas.

Diarrea biliar ácida el resultado de desequilibrios en la homeostasis ácido de bilis en la circulación enterohepática ^12,13. Puede ser una consecuencia de la resección ileal, enfermedad gastrointestinal o un resultado de malabsorción idiopática de ácidos biliares. Se han encontrado más de 80% de los pacientes que presentan diarrea tras someterse a una resección ileal ¹⁴. Ileectomy tiene el potencial para ser un modelo de cirugía importante para la investigación de la diarrea de ácidos biliares. En este estudio, una serie de resecciones ileales proporcionar una evaluación del gradiente de FGF15 deficiencia así como malabsorción de sales biliares intestinales, sobreacumulación y daños tóxicos.

animal protocolo fue revisado y aprobado por el cuidado institucional de animales y uso en el caso Western Reserve University School of Medicine y se llevó a cabo con arreglo a la guía de institutos nacionales de salud (NIH) para la Uso y cuidado de animales de laboratorio (8ª edición, 2011). Ratones fueron sacrificados por métodos compatibles con las directrices de la Asociación Médica Veterinaria americana (AVMA) para la eutanasia de animales (edición de 2013). C57BL/6J, ratones machos, de 8-16 semanas de edad fueron utilizados en el presente Protocolo. Ratones fueron alojados en un entorno de ciclo luz/oscuridad de 12 horas.

1. preparación preoperatoria

1. transferencia de ratones en una jaula limpia 24 h antes del procedimiento. Permitir que los animales libre acceso al agua. Vuelva a poner comida chow con alimentos blandos (suplemento dietético gel) 4-6 h antes de la cirugía para reducir el contenido del intestino para la cirugía.
2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y preparar el material quirúrgico estéril de un solo uso. Limpiar el área de cirugía y el cono de nariz anestesia con etanol al 70%.
3. Creó un microscopio de disección, vaporizador anestésico isoflurano, instrumentos y una control de temperatura pequeños animal mesa quirúrgica para el mantenimiento de la temperatura de cuerpo. Organizar los instrumentos, suturas y jeringas en un lugar de libre acceso durante la cirugía.
4. Configurar una fuente de luz para proporcionar suficiente luz para el área quirúrgico.
5. Preparación de solución salina 0.9% estéril en la jeringa de 5 mL para la limpieza intestinal y abdominal.

2. Ileectomy y Anastomosis

1. Anesthetize ratones con isoflurano (2-3%) en una cámara de incubación animales pequeños. Determinar la anestesia adecuada, utilizando la técnica del pellizco del dedo del pie mientras que el animal está en isoflurano.
2. Retire pelo abdominal aplicando producto del retiro del pelo y pelo lejos usando esponjas quirúrgicas mientras mantiene la anestesia. Coloque el ratón sobre un control de temperatura pequeños animal mesa quirúrgica ( figura 1 A) a mantener la temperatura corporal en anestesia de mantenimiento de 37 ° C. con isoflurano (1-2%) a través de una máscara. Tratamiento de los ojos del ratón con el ungüento ocular.
3. Limpiar la piel con povidona yodada y el 70% alcohol y cubrir la zona quirúrgica del abdomen con una gasa quirúrgica estéril ( figura 1 B).
4. Hacer una incisión abdominal de línea media, utilizando un bisturí quirúrgico una vez que la anestesia es en efecto. Use un aplicador con punta de algodón para proteger el intestino y tire del ratón músculo abdominal con separadores para poder abrir y exponer la cavidad abdominal ( figura 1 C).
5. Localiza el ciego. A partir del ciego, mueva con cuidado la parte del yeyuno e íleon conectado fuera de cavidad abdominal ( figura 1 D).
   Nota: El ciego puede ser fácilmente identificado debido a su gran tamaño incluso después de un ayuno.
6. Ligar la rama superior de la arteria mesentérica superior con una sutura de seda 7-0 para ocluir la sangre suministra el segmento ileal que debe ser suprimido. El íleon color cambia de rosado a púrpura oscuro después de la ligadura. ( figura 1 E - F).
7. Dependiendo de la finalidad del experimento, usando las tijeras, suprimir y eliminar el 50% o el 90% de íleon.
   Nota: Para la cirugía del impostor, no realice la ligadura de la arteria mesentérica superior y no retire el íleo.
8. Irrigue el lumen de ambos extremos ileales con solución salina al 0.9%.
   Nota: como el íleo intacto restantes todavía está recibiendo un suministro normal de sangre desde la arteria mesentérica superior, una pequeña cantidad de sangre saldrán hacia fuera durante el proceso. Esto también indica que el suministro de sangre a los extremos ileales es normal y no garantiza isquemia durante el procedimiento de la anastomosis ( figura 1 G).
9. Ubicar los entresijos del lado de ambos extremos ileales. Alinee los entresijos y suturar los extremos ileales con sutura 8-0 ( figura 1 G - H).
10. Sutura de la parte contralateral del íleo para evitar el íleo anastomosada de forma natural ( figura 1 ).
11. Sutura los lados superiores e inferiores entre las dos suturas originales a bien unir los dos ileal extremos juntos ( figura 1 J).
12. Confirmar que no hay ninguna salida desde el sitio de la anastomosis después de terminar el procedimiento de sutura de tres pasos ( figura 1 G-I). Volver el intestino ciego y el intestino en la cavidad abdominal a la localización anatómica original. Lave el área quirúrgica con solución salina 0.9% tibia utilizando una aguja Roma. ( figura 1 K).
13. Cerrar la incisión de la capa de músculo abdominal con sutura 6-0. Alinee la incisión de la piel abdominal con unas pinzas y sutura de la piel abdominal para facilitar la óptima cicatrización de heridas ( figura 1 L).

3. Cuidados postoperatorios

1. transferencia después de la cirugía a la unidad de cuidados intensivos para recuperación. Alojarlos en una jaula de la ropa de cama de papel sobre una almohadilla de calefacción de temperatura controlada para continuar la recuperación después de la cirugía durante la noche. Ratones con alimentos blandos además de comida regular y el agua de la fuente.
2. Administra buprenorfina (0.05 - 0.1 mg/kg) con la inyección subcutánea cada 8-12 h para la analgesia.
   Nota: Eutanasia ratones por CO ₂ si severamente enfermo.
3. En el punto final, sacrificar ratones utilizando muestras overdosed de isoflurano y cosecha según sea necesario (sección 4).

4. Evaluación de sobreacumulación de bilis inducida por Ileectomy

1. pesan y diseccionar los ratones un día después de una resección de 0% (falso), 50% o el 90% de íleon.
2. Retirar el tracto gastrointestinal y pésalo. Calcular el peso de GI al cociente de peso corporal para evaluar la gravedad de la malabsorción de sales biliares y sobreacumulación.
3. Transferencia de los tractos GI en tubos cónicos de 15 mL y cortarlas en segmentos cortos con unas tijeras. Después del corte, centrifugar a 3.000 x g durante 10 minutos transferir el sobrenadante (líquido de GI que contiene sales biliares) a un tubo limpio.
4. Medir el volumen total y el peso de líquido GI y calcular el peso de fluido al cociente de peso tracto GI más evaluar sobreacumulación de bilis en el tracto GI.
5. Determinar la cantidad total de bilis en el sobrenadante por el análisis de ácido biliar como se describe en la referencia ⁸.

Los procedimientos para la ileectomy se muestran en la figura 1. El primer paso incluye preparación de la piel abdominal de ratón, haciendo una incisión abdominal y usando retractores para exponer completamente el intestino (figura 1A-C). A continuación, el ciego de ratón fue localizado (figura 1D); Dado que su tamaño y su forma hacen un hito fácilmente identificable. El ciego, íleon y parte del yeyuno distal fueron expuestos y quitados de la cavidad abdominal (figura 1D). Una vez determinado el resecting segmento ileal, la arteria mesentérica superior, suministro de sangre al segmento fue ligada y el color del segmento de íleon de cambiar rápidamente a púrpura oscuro (figura 1E - F), mientras que el resto del intestino mantener un color rosado normal. El segmento de íleon isquémico todo fue resecado totalmente seguido de lavado que el corte termina con solución salina al 0.9% (figura 1G). Los dos extremos ileales entonces fueron suturados juntos por un proceso de sutura de tres etapas (figura 1H-J). En figura 1K-L, el anastomosis intestino volvió a la original ubicación anatómica en la cavidad abdominal y la Incisa y capas de la piel se suturan juntos.

Los ácidos de bilis producidos por el hígado enzimáticamente se sintetizan de colesterol y distribuidos en el sistema enterohepática. Son reabsorbidos en su mayoría por el íleo distal y luego devueltos al hígado a través de la vena porta hepática. Ácido de bilis circulación entre hepatocitos en el hígado y el enterocito en el íleon se resume en la figura 2A. En el íleon, los ácidos biliares son absorbidos por el transportador de ácido biliar dependiente de sodio apical (ASBT) en el lado luminal de los enterocitos del epitelios y transferidos por proteína ileal de unión a ácido de bilis (IBABP) a la membrana basolateral de la emanación en la sangre a través de la transportador de solutos orgánico (OST). En enterocitos, los ácidos biliares también activa FXR para inducir la hormona específica de íleo FGF15, que es un potente inhibidor de la endocrino de la síntesis de ácido biliar particularmente por disminuyendo CYP7A1 hepática, la enzima inicial y limitación de velocidad para la síntesis de ácidos biliares en el hígado. Sin embargo, Fgf15 es reprimido por ileal KLF158. Nuestro análisis de la reacción en cadena (RT-qPCR) en tiempo real cuantitativa de la polimerasa detecta abundante expresión de Fgf15, Asbt, Ibabpy Ostβ mRNA en el íleon y menos a la extremadamente baja expresión en el yeyuno y el resto del intestino (figura 2B-2E). Sin embargo, el nivel de mRNA poliposis adenomatosa coli (Apc) (control negativo) siendo comparable en todo el intestino entero (figura 2F).

Estos datos son consistentes con un anterior estudio15 y apoyan que la reabsorción intestinal de ácidos biliares se produce principalmente en el íleon. Estos datos sugieren que la bilis es esencial para la digestión de nutrientes y de la emulsificación para la absorción eficiente de nutrientes solubles en lípidos en el intestino proximal, lo que biológicamente se adapta a las funciones digestivas y absorción primarias del duodeno y del yeyuno . Al llegar al intestino delgado distal, la bilis ha completado su función digestiva y es reabsorbida por el íleon para regresar al hígado y seguir siendo parte de la circulación enterohepática. Reabsorción de la bilis también permite llevar a cabo una de sus funciones de señalización mediante la estimulación del íleon para producir la molécula de señalización secundaria FGF15, que viaja al hígado y suprime la síntesis de ácidos biliares los ácidos biliares. En nuestro anterior estudio, hemos demostrado el efecto regulador de un eje de KLF15 -Fgf15 ileal en la síntesis hepática de ácidos biliares por una resección quirúrgica de ~ 90% de íleon 8. Síntesis de ácidos biliares en el hígado pierden el control inhibitorio de FGF15 después de la remoción mecánica fundamental del íleon, lo que provoca también malabsorción de ácidos biliares en el intestino. Por lo tanto es overaccumulated la gran cantidad de bilis en el intestino causando graves efectos adversos como diarrea, colestasis y pérdida de la actividad gastrointestinal. Para evaluar el efecto de la magnitud de la resección y determinar un modelo de ileectomy seguro, utilizamos ratones C57BL6/J para realizar 0% (falso), 50% y 90% resección del íleon. Después de 24 h, la morfología intestinal demostró cambios característicos del gradiente (figura 3A-3D). El intestino en cirugía ficticia fue normal y comparable a la de los ratones no cirugía. Quitar 50% de íleo había causado cierta acumulación de bilis, aumento en el tamaño intestinal y dilatación un día después de la resección. Sin embargo, el ratón que experimentó la resección 90% exhibió mayor bilis sobreacumulación, mayor tamaño intestinal y dilatación severa. Para evaluar la sobreacumulación de bilis inducida por resección ileal en el intestino, se recolectaron interno líquido de los tractos GI de después de la cirugía. Los volúmenes de líquido exhiben una mejora degradada de 0% a 90% en los ratones ileectomy (figura 4A). El cociente de peso GI versus peso fue aumentado significativamente sólo en los ratones de íleo resecado 90% (figura 4B). El líquido GI recogidas de los tractos GI de después de la cirugía y el peso de líquido GI al cociente de peso tracto de GI demostró un aumento del gradiente debido a la resección (figura 4C y 4 D). Finalmente, el análisis de ácido biliar confirmó que la cantidad de ácidos biliares detectados en el sobrenadante aumenta con aumento de la resección ileal (figura 4E). Colectivamente, los resultados indican que la resección de íleon de 50% es un modelo de ileectomy de ratón más aplicable con efectos adversos relativamente moderados, como acumulación suave del ácido de bilis en el intestino.

Figura 1: Procedimientos de cirugía de Ileectomy. (A) mantener la temperatura con una control de temperatura pequeños animal mesa del cuerpo. (B) cubierta el área quirúrgica con gasas estériles después de la preparación de la piel abdominal. (C) exponga el intestino mediante una incisión abdominal de línea media. (D) ciego (resaltada en la línea discontinua blanca) es una marcada para localizar el íleo. Exponga el íleo (línea punteada amarilla) y ramas de la arteria mesentérica superior (flechas amarillas). (E) ligar las ramas de la arteria mesentérica superior, que suministran sangre al íleo. Sitios de ligadura están indicados por flechas amarillas. El íleon cambio de color a morado oscuro o negro después de la ligadura de la arteria. El segmento isquémico es resaltado en la línea punteada amarilla. (F) la punteada línea indica la demarcación del íleo isquémico y normalmente perfundido; la flecha indica zona isquémica del íleo. (G) cortar y retirar la parte isquémica del íleo y al ras de los extremos (líneas punteadas amarillas) con solución salina al 0.9%. Las flechas amarillas indican los lados mesentéricos. (> H) sutura los extremos ileales juntos y mantener el mesenterio alineado. La primera sutura en el lado mesentérico es indicada por la flecha amarilla. () Sutura de la parte contralateral del íleon (flecha amarilla). (J) los lados superiores e inferiores de extremos ileales para totalmente unir el íleon de la sutura. Las suturas están indicadas por la flecha amarilla. (K) volver el intestino ciego y el intestino en la cavidad abdominal. La zona de la anastomosis está resaltada en el círculo amarillo de la discontinuo. El color rosa indica que no hay isquemia en el área de la anastomosis. (L) cerrar la incisión de la capa de músculo abdominal y sutura la incisión de la piel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Síntesis de ácidos biliares en los hepatocitos y reabsorción por el enterocito en el íleon. (A) imagen esquemática de la síntesis de ácidos biliares en el hígado, la reabsorción en el íleon y regreso al hígado vía la vena porta hepática. Los ácidos biliares se sintetizan de colesterol por una serie de enzimas como la enzima inicial y Tarifa-limitación citocromo P450 CYP7A1 en hepatocitos. La mayoría de ácidos biliares se reabsorben por el transportador ASBT en el lado luminal de los enterocitos ileales. Absorbe los ácidos biliares se asocian con IBABP y effluxed en la vena porta por el transportador basolateral OST para el transporte hacia el hígado. En enterocitos, los ácidos biliares también activa el receptor hormonal nuclear FXR, que induce la hormona específica de íleo FGF15, un inhibidor de la endocrina robusto de la síntesis hepática de ácidos biliares. En cambio, ileal KLF15 inhibe la expresión de FGF15. (B-F) Expresión relativa de Fgf15, Asbt, Ibabp, Ostβy el mRNA de la Apc en el conjunto del intestino desde proximal a distales segmentos incluyendo el duodeno (D), yeyuno (J), íleo (I) y colon (C) (n = 5). Barras de error de ± SD. * P < 0.05 vs duodeno por de Student t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Gradiente resecciones de íleon y colestasis en intestino. (A) intestino de ratón no exhibe dilatación después de la cirugía simulada. El contenido interno muestra quimo digestivo. (B) después de la resección ileal de 50%, el intestino muestra dilatación moderada con colestasis importante. (C) después de la resección ileal de 90%, el intestino muestra gran cantidad de acumulación de la bilis y la excesiva dilatación. (D) el GI tracto (desde el estómago hasta el recto) fue aislado de los ratones con cirugía ficticia (izquierda), resección de íleon de 50% (medio) y resección de íleon de 90% (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Biliares sobreacumulación causada por Ileectomy. (A) fluido interno del intestino de ratón 24 h después de la farsa, 50% y 90% ileectomy. (B) peso de los cocientes de la GI versus el peso del cuerpo en cirugías ileectomy sham, 50% y 90% (n = 5). (C) el fluido GI volúmenes. (D) las proporciones de líquido GI pesos contra pesos de GI. (E) los ácidos biliares totales en los líquidos recogidos de los intestinos después de ileectomy sham, 50% y 90% (n = 5). GI: gastrointestinal, GIW: peso gastrointestinal, PC: peso corporal. Barras de error de ± SD. * P < 0.05 vs impostor, # P < 0.05 vs 50% ileectomy por One-Way ANOVA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.