Artículo de método

Creación de un modelo de roedor del Aneurysm aórtico Abdominal bloqueando Adventitial de la Vasa Vasorum de la perfusión

DOI:

10.3791/55763

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8 de noviembre de 2017

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1Department of Medical Physiology, Hamamatsu University School of Medicine, 2Division of Vascular Surgery, Second Department of Surgery, Hamamatsu University School of Medicine, 3Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Kindai University, 4Department of Organ & Tissue Anatomy, Hamamatsu University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Inserción de catéter de poliuretano en la luz aórtica y ligadura de la sutura de la aorta inducir hipoxia crónica debido a la hipoperfusión de los adventitial de la vasa vasorum. Este artículo describe un nuevo modelo animal de aneurisma aórtico abdominal (AAA) de características similares a los de la AAA en los seres humanos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los adventitial de la vasa vasorum (VV) proporciona oxígeno y alimento a la pared aórtica. Hipoxia de la pared aórtica puede causar agrandamiento aneurysms aórticos abdominales (AAAs). Este artículo presenta y describe un protocolo estándar que se utiliza para inducir la AAAs a través adventitial hypoperfusion VV creado con una combinación de inserción de catéter de poliuretano en la luz aórtica y ligadura de la sutura de la aorta abdominal del infrarenal.

El protocolo implica el uso de ratas macho pesa 300-400 g, que proporcionan alimento y agua ad libitum. Después de laparotomía con una incisión abdominal de línea media ventral, se realiza la exfoliación de la aorta, que bloquea el flujo sanguíneo del tejido perivascular. Aortotomy que implica una pequeña incisión adyacente a las ramas de la arteria renal se realiza, y se inserta un catéter de poliuretano utilizando una aguja de calibre 18 residente. Después de reparar la incisión, estrecha ligadura de la aorta sobre el catéter bloquea el flujo de sangre de la VV de la dirección proximal a través de la pared aórtica sin perturbar el flujo sanguíneo aórtico. Esta técnica puede inducir un AAA con dilatación aórtica progresiva.

El mayor beneficio de este modelo es que VV hipoperfusión causa hipoxia tisular y el desarrollo de un infrarenal AAA, que tiene características morfológicas y patológicas similares a las de un humano AAA.

Introducción

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La aorta abdominal se compone de las siguientes tres capas: la pared vascular interna (intima), capa intermedia (media) y la pared vascular externa (adventicia), y de estos, la adventicia tiene una sangre único sistema conocido como los vasa vasorum (VV) de la fuente. Tejido aórtico se suministra con oxígeno a través de adventitial VV perfusión y difusión simple oxígeno de la sangre aórtica flujo1. Sin embargo, geográficamente, la aorta abdominal tiene la menor distribución de VVs en comparación con el que en otras partes de la aorta. 2

Un estudio informó sobre hipoxia tisular en un aneurisma aórtico abdominal humano paredes (AAA) con espesor intramural trombo (ILT)3. Además, se ha demostrado que un VV adventitial enquistada en la paredes se ocluye con cambios arterioescleróticos en una tasa significativamente mayor, que se asocia con hipoxia tisular en los muros de AAA4. Basado en estos resultados, un modelo novedoso de roedor de AAA fue creado por inducir adventitial VV hypoperfusion5. En este modelo, VV hipoperfusión causa hipoxia tisular y el desarrollo de un infrarenal AAA, que tenían características morfológicas y patológicas similares a las de un humano de AAA6. Ejemplos fueron la presencia de ILTs y la acumulación de adipocitos hyperplastic6y el potencial para causar ruptura7,8. Estos resultados se han observado raramente en anteriores modelos de roedores. Por lo tanto, este modelo puede contribuir considerablemente a una comprensión más profunda del mecanismo responsable de la ruptura y el desarrollo de AAA. Introducimos y describir un protocolo estándar que se utiliza para inducir la AAAs a través adventitial hypoperfusion VV, y explicamos cómo inducir hipoxia de la pared aórtica mediante técnicas quirúrgicas.

Protocolo

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cuidado de los animales y los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices de Hamamatsu Universidad de medicina Animal cuidado Comité Escolar en el centro para el cuidado de animales.

1. procedimiento quirúrgico para crear el modelo

Nota: Coloque los instrumentos quirúrgicos en un esterilizador de bolas durante 10 s antes de la operación. Utilizar guantes estériles intraoperatively.

  1. Uso ratas macho pesa 300-400 g. acceder a las ratas a los alimentos y agua ad libitum.
  2. Anestesiar la rata con inhalación isoflurano (2.0-3.0 mL/L). Anestesia adecuada para confirmar pellizco del dedo del pie.
  3. Afeitar el pelo en el abdomen con una afeitadora eléctrica y frote el abdomen con alcohol y una solución de povidona-yodo.
  4. Colocar la rata en la posición supina sobre la mesa de operación. Use ungüento veterinario de la rata ' ojos de s para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.
  5. Realizar una laparotomía con una incisión abdominal de línea media ventral usando unas tijeras. Para asegurar un campo quirúrgico claro, paquete del contenido abdominal dentro de la cavidad abdominal con una gasa estéril con un retractor de heridas.
  6. Para separar la aorta del tejido perivascular, suavemente Levante y rasgar el retroperitoneo con pinzas para exponer la pared aórtica y exfoliar la aorta del infrarenal en el espacio retroperitoneal, desde el nivel de la vena renal izquierda a la bifurcación de la tejido perivascular ( figura 1A).
  7. Ligan los vasos ramificación de la aorta abdominal con un cordón de seda 5-0 a la sangre de bloque de la fuente en un punto de la aorta que no estrecha el lumen aórtico.
  8. Para bloquear el flujo sanguíneo aórtico, colocar clips vasculares justo debajo de la arteria renal y justo por encima de la bifurcación de la aorta.
    Nota: El tamaño de los clips debe ser mayor que el diámetro aórtico para bloquear completamente el flujo de sangre. Un temporal ligadura de cadena seda 5-0 es suficiente para bloquear el flujo de sangre en vez de los clips.
  9. Similar a la creación de una punto de la hemorragia en la superficie de la pared aórtica, cortar la pared anterior aórtica con una micro tijera 5 mm distal de la pinza aórtica, adyacente a las ramas de la arteria renal, insertar un catéter de poliuretano.
  10. Insertar un catéter de poliuretano (diámetro de 0.55 m m, diámetro interior exterior 0.37 mm) utilizando un calibre 24 permanencia de la aguja superficialmente a través de la incisión para lavar sangre en la aorta con agua. Administrar una jeringa de 1 mL llenada de agua hacia el catéter de poliuretano y lavar la sangre restante en la aorta con agua. Después del riego, retire el catéter de la aorta.
  11. Antes de insertar un catéter de poliuretano (diámetro 1,20 mm, diámetro interior exterior 0,94 mm) utilizando una aguja de calibre 18 residente, cortar el catéter de poliuretano 10 mm de largo ( figura 1B). Pieza
    1. Inserte el corte del catéter poliuretano en el lumen aórtico de la incisión hecha en el paso 1.9. Totalmente Coloque el catéter de 10 mm en el lumen aórtico y vuelva a colocar el punto medio de la sonda para que coincida con la ubicación de la incisión (es decir, cubrir la incisión con el catéter).
  12. Reparar la incisión con suturas interrumpidas usando una cuerda de monofilamento de 8-0 ( figura 1).
  13. Ligar la aorta abdominal utilizando una combinación de cuerdas seda 5-0 y el catéter de poliuretano ( figura 1).
    Nota: Se puede mantener el lumen aórtico por catéter permanente. Ligar la aorta firmemente para evitar que el tamaño de la posición del catéter. El cirujano ' nudo s se recomienda, porque añade un toque extra al atar el primer tiro del nudo, formando un doble nudo, y un giro adicional proporciona más fricción y puede reducir el aflojamiento.
  14. Después de la ligadura, retire el clip vascular en la bifurcación aórtica y a continuación, retire el clip vascular por debajo de la arteria renal para restaurar el flujo anterógrado de la sangre. Confirmar la pulsación aórtica grave.
  15. Cerrar la incisión abdominal en dos capas, el peritoneo y otras capas, con una sutura de polipropileno 4-0. Firmemente la sutura la incisión para evitar que un órgano resaltado.
  16. Aplicar lidocaína tópica en la incisión abdominal. Colocar la rata en un cojín de calefacción hasta que regrese de la conciencia. No descuide una rata hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. No devuelva una rata que ha sufrido la operación de la compañía de otras ratas hasta que haya recuperado completamente.
  17. Seguir de cerca la rata después de la operación. Inyectar un bolo de solución salina estéril (1.0-2.0 mL) por vía subcutánea si una rata muestra signos de pérdida de peso de angustia o cuerpo.
  18. Postoperatoriamente, observar el desarrollo del curso temporal de la aorta agrandada en un echogram del ultrasonido. Medir el diámetro máximo del interior del borde al borde exterior de la aorta abdominal como describe 5.

2. Cosecha, fijación y tinción de Elastica-van Gieson (EVG)

  1. veinte y ocho días después de la operación, administrar pentobarbital sódico ≥ 100 mg/kg por vía intraperitoneal a eutanasia a las ratas.
  2. Corte la rata ' cavidades abdominal s ventralmente. Hacer la incisión inicial con bisturí. El aneurysm usando tijeras de cosecha y aortas cosechados en formalina al 10% tamponado neutral para 24-48 h.
    Nota: El cirujano debe ser cuidadoso evitar daños a la aorta y otros órganos cuando expone el aneurisma. Debe observarse un órgano abdominal elevado, lo que indica formación de AAA. la figura 2 muestra una imagen en vivo y ex vivo de la imagen; esta muestra representativa de la AAAs se rompe no.
  3. Tinción de balasto electrónico 9
    1. Preparación de la solución
      1. preparar Verhoeff ' hematoxilina s mezclando los siguientes en el orden dado: hematoxilina alcohólica 20 mL, el cloruro férrico 10% 8,0 mL, y Lugol ' yodo s 8 mL. Mezcle la solución entre cada adición. Esta solución puede prepararse fresca según sea necesario.
      2. Prepare Van Gieson ' solución s mezclando fuchsin ácido 1% 1 mL y ácido pícrico saturado 45 mL. Dejar reposar durante la noche y mezclar bien. Esta solución es estable durante 2 semanas.
      3. Preparar solución diferenciadora (2% de cloruro de férrico) mezcla 10% FECLAS 3 10 mL en 40 mL agua destilada. Esta solución puede prepararse fresca según sea necesario.
      4. Prepare 5% hipo mediante la disolución de tiosulfato de sodio 5,0 g en 100 mL de agua destilada. Esta solución es estable por 1 año.
    2. Procedimiento de tinción
      Nota: ver referencia 9 para más detalles.
      1. Hidratar brevemente, las secciones de parafina fijo de las aortas cosechados en agua destilada por 10 minutos poner las aortas de Verhoeff ' hematoxilina s 25 min lavado con agua y dip de 10 - 30 veces en el distinción de solución (FECLAS de 2% 3). Enjuague con agua. Lugar en juegos de 5% durante 1 minuto en agua. Lugar de Van Gieson ' solución s por 5 min
      2. Deshidratar en alcohol en el siguiente orden: alcohol de 75%, 90%, 95%, 100% y 100% durante 30 s cada uno. Entonces, claro en el xileno durante 5 minutos, dos veces. Lugar en un cubreobjetos con medio de montaje resinoso.
        Nota: las fibras elásticas aparecen azulado a negro; núcleos: azul a bla blaCK; colágeno: rojo; y otros elementos del tejido: amarillo.

Resultados

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Las técnicas quirúrgicas descritas crean un nuevo modelo animal de un crónica inducida por la hipoxia del aneurysm aórtico mediante una combinación de insertar el catéter de poliuretano y la ligadura de la sutura de la aorta abdominal del infrarenal en ratas. Las ratas que se describe en la sección de Protocolo fueron sacrificaron 28 días después del procedimiento. Las aortas fueron cosechadas y reflejadas para visualizar la formación de aneurismas. La figura 2 muestra el desarrollo de la AAA fusiforme. Los extremos superiores e inferiores de la aorta en vivo ex tienen un diámetro normal sin dilatación. Se midieron diámetros aórticos mediante ecografía transabdominal (figura 3). El diámetro generalmente alcanza su tamaño máximo en aproximadamente 14 días después del procedimiento; después de eso, permanece igual o aumenta ligeramente. La figura 4 muestra la imagen histopatológica del aneurisma en su diámetro máximo después de la tinción de balasto electrónico. La imagen del tejido en el día 28 (aneurisma) demostrada prominente degradación de fibras elásticas en comparación con el día 0.

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Figura 1: Procedimientos quirúrgicos para inducir un aneurysm aórtico abdominal (AAA).
(A) la aorta del infrarenal es exfoliación del tejido circundante. (B) un catéter de poliuretano 10 mm largo de corte se inserta a través de una pequeña incisión en la aorta. (C) la incisión se repara con una sutura de monofilamento de 8-0 y se restaura el flujo sanguíneo. (D) la aorta está ligada con una sutura de seda 5-0 sobre el catéter insertado. Barra de escala = 5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Postoperatorio resultados representativos.
Vista macroscópico en el desarrollo de demostración día postoperatorio 28 de aneurysms aórticos abdominales fusiformes. El elevado margen del retroperitoneo se corresponde con el borde externo del aneurisma (líneas quebradas; izquierda). Los extremos superiores e inferiores de la aorta en ex vivo son normales (derecha). Barra de escala = 3 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Diámetros aórticos máximo medidos mediante ultrasonografía transabdominal.
El diámetro aórtico aumentado en este modelo de la rata. Diámetros aórticos se presentan como media ± desviación estándar (n = 12). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imágenes representativas del tejido aneurismático con Elastica van Gieson tinción.
Evaluación histológica con balasto electrónico tinción mostrando la lámina elástico degenerativa en los medios y la formación de un trombo intraluminal 28 días después del procedimiento (derecha). Fragmentación del elástico de la fibra en los medios aórticos y fibra del colágeno escasa en la adventicia aórtica se observan en el día 28. Día 0 es antes del procedimiento (izquierdo). Barra de escala = 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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En condiciones fisiológicas, las capas internas de la pared aórtica se nutren por difusión desde el flujo sanguíneo luminal, mientras que las capas externas y medianas son nutridas por la VV, que penetran de la adventicia en el intermedio VV1. Flujo de sangre VV en la pared aórtica abdominal puede originarse de las siguientes tres direcciones/áreas: (1) la dirección proximal a través de la pared aórtica, dirección (2) distal a través de la pared aórtica y de los tejidos perivasculares (3)10. Anteriormente, el análisis histológico de tejidos humanos identificaron estenosis significativa u oclusión de la VV en la pared del AAA, sugiriendo que el flujo de sangre VV en la pared de la aorta abdominal puede ser reducido4. Es un punto muy importante en este protocolo que un infrarenal AAA fue causada por una combinación de insertar el catéter de poliuretano y la ligadura de la sutura de la aorta abdominal del infrarenal. Para exfoliar cuidadosamente la capa de tejido, cirujanos deben insertar suavemente un catéter de poliuretano en la aorta y ligar firmemente la aorta para causar hipoxia crónica debido a la hipoperfusión de la VV adventicial y formación de aneurismas. Utilizando estas técnicas, por lo tanto disminuye el flujo sanguíneo en la pared aórtica, y se induce un ambiente hipóxico local. La reducción del flujo de sangre y el aneurysm inducida por hipoxia formación indica que flujo de la sangre VV en la pared aórtica abdominal juega un papel en la patogenesia de la formación de AAA.

Específicamente, un modelo de aneurisma de la aorta debe satisfacer las siguientes condiciones: un 1.5-fold aumento del diámetro vascular comparado con el basal, degeneración de la túnica media y la inflamación de la pared aórtica. Los modelos animales más populares han sido construidos mediante la inducción de respuestas inflamatorias utilizando sustancias como CaCl211, elastasa12y angiotensina II13. Estos modelos pueden tener una alta reproducibilidad y obviamente causa cambio patológico, y se han utilizado comúnmente en estudios de investigación. En nuestro modelo, se evaluó el diámetro aórtico mediante ultrasonografía cada 7 días desde antes de que el procedimiento se realizó hasta el día 28 después del procedimiento (figura 3). Los resultados mostraron que el diámetro aórtico aumentado moderadamente durante los 28 días, lo que indica que este cambio en el diámetro es similar a la de anteriores modelos de roedores. Observación bruta de la forma vascular indica una forma fusiforme lisa (figura 2). En el día 28, sacrificaron las ratas y realizó análisis histopatológico del tejido aórtico que se recuperó. Rasgado y la desaparición de las fibras elásticas y el colágeno de la túnica media y adventicia se observan (figura 4). Por otra parte, las células inflamatorias como los macrófagos, estuvieron presentes desde el adventitia de tunica a la túnica media.

Actualmente, las opciones de tratamiento disponibles para la AAAs se limitan a la reparación quirúrgica y stent injerto endovascular, con tasas de mortalidad de 30-50% en pacientes con ruptura de AAA14. Sin embargo, ningún fármaco ha sido aprobado para que uso clínico para el tratamiento de AAAs. Hay un debate que hay discrepancias en los resultados patológicos entre los seres humanos y establecidos los modelos animales utilizados en la investigación del AAA. Similitudes en la patogenia entre AAA humana y modelos animales de AAA son esenciales para el desarrollo de tratamientos farmacológicos. Con respecto a la efectividad de modelos de roedores, nuestro modelo de la rata es morfológicamente similar a los seres humanos en términos de trombo intramural5 y adipogénesis8. Además, aproximadamente el 20% de las ratas en este estudio tenían ruptura de AAA y murió dentro de 28 días después del procedimiento. Aunque la ruptura del aneurysm aórtico es el acontecimiento más crítico de esta enfermedad, ruptura es infrecuente con modelos AAA experimentales establecidos y no se ha aclarado el mecanismo. Por lo tanto, este modelo es útil para comprender el mecanismo de dilatación del diámetro aórtico y ruptura del aneurisma.

La creación de este modelo se requiere para algunos procedimientos quirúrgicos. Por lo tanto, los investigadores deben practicar creando este modelo, que es una limitación de este modelo. En el futuro, nos gustaría crear un modelo de roedor en el que nos podemos disminuir flujo sanguíneo por gradualmente engrosamiento de las paredes VV, dando por resultado la espontánea del aneurysm aórtico.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por subvenciones para científico investigación (B) (20291958) a N.U.; Subvenciones para jóvenes científicos (A) (25713024) a N.Z.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
rataJapón SLC. IncSlc:SD rataSprague – Dawley ratTM
solución de povidona yodadaLibatape Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 cuerda de sedaAkiyama Medical MFG. CO.,LTDJIS No.1
clips vascularesNatsume Seisakusho Co., Ltd.C-42-S-2
(aguja permanente de calibre 24)MEDIKIT24GSupercath Z4VTM,
24 (aguja permanente de calibre 18)MEDIKIT18GSupercath Z3VTM, aguja permanente de calibre 18
Cuerda monofilamento 8-0Sutura EthiconC-42-S-2PROLENE Sutura de polipropileno, Reparar la incisión con la sutura
4987335 111457Catéter de poliuretano catéter de poliuretano con aguja permanente de calibre

Referencias

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