Summary
Dette arbejde beskriver en optimeret methyl-CpG-bindingsdomæne (MBD) sekventeringsprotokol og en beregningsrørledning til identifikation af differentielt methylerede CpG-rige regioner hos patienter med kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL).
Abstract
Rollen af lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er) i kræft kommer frem i forgrunden på grund af den voksende interesse for at forstå deres mekaniske funktioner under udvikling af kræft og progression. På trods af dette er den globale epigenetiske regulering af lncRNA'er og gentagne sekvenser i kræft ikke blevet undersøgt godt, især i kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL). Denne undersøgelse fokuserer på en unik tilgang: Den immunpræcipitationsbaserede indfangning af dobbeltstrengede, methylerede DNA-fragmenter ved anvendelse af methyl-bindende domæne (MBD) proteiner efterfulgt af næste generations sekventering (MBD-seq). CLL patientprøver tilhørende to prognostiske undergrupper (5 IGVH-muterede prøver + 5 IGVH-ikke-muterede prøver) blev anvendt i dette studie. Analyse afslørede 5.800 hypermethylerede og 12.570 hypomethylerede CLL-specifikke differentielt methylerede gener (cllDMG'er) sammenlignet med normale sunde kontroller. Det er vigtigt, at disse resultater identificerede adskillige CLL-specifikke, differentielt methylerede lncRNA'er, rePetitive elementer og proteinkodende gener med potentiel prognostisk værdi. Dette arbejde beskriver en detaljeret protokol for en MBD-seq og bioinformatik pipeline udviklet til en omfattende analyse af globale methyleringsprofiler i højt CpG-rige regioner ved brug af CLL patientprøver. Endelig valideredes et proteinkodende gen og et lncRNA under anvendelse af pyrosequencing, hvilket er en meget kvantitativ metode til analyse af CpG-methyleringsniveauer for yderligere at bekræfte resultaterne fra MBD-seq-protokollen.
Introduction
Anvendelsen af næste generations sekventeringsteknikker til analyse af globale DNA-methyleringsprofiler er blevet stadig mere populært i de seneste år. Genom-brede methyleringsassays, herunder mikroarray- og ikke-mikroarray-baserede metoder, blev udviklet baseret på følgende: bisulfitomdannelsen af genomisk DNA, methyleringskänslig restriktionsenzymfordøjelse og immunpræcipitation af methyleret DNA under anvendelse af methyl CpG-specifikke antistoffer .
Aberrant DNA-methylering er et kendetegn ved leukæmi og lymfomer, herunder kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL). Tidligere har flere grupper, herunder vores, karakteriseret DNA-methyleringsprofilerne fra forskellige CLL-prognostiske undergrupper og normale, sunde B-cellekontroller under anvendelse af bisulfitomdannelsen af genomisk DNA efterfulgt af mikromarraybaserede metoder eller helgenomsekvensering 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Bisulfitomdannelsen af genomisk DNA fører til deaminering af umodificerede cytosiner til uracil, hvilket efterlader de modificerede methylerede cytosiner i genomet. Efter omdannelse kan methyleringsstatusen for DNA'et bestemmes ved PCR-amplifikation og sekventering under anvendelse af forskellige kvantitative eller kvalitative metoder, såsom mikro-array-baseret eller helgenoms-bisulfit-sekventering (WGBS). Selvom bisulfit-konverteringsbaserede metoder har mange fordele og er meget udbredt i forskellige kræfttyper til analyse af DNA-methyleringsniveauer, er der nogle ulemper forbundet med denne teknik. WGBS sekventering tillader single-base-pair opløsning med lavere mængder af DNA og er den bedst egnede mulighed for at analysere et stort antal prøver. Denne metode undlader imidlertid at differentiere modifikationerne mellem 5 mC og 5 hmC niveauerne i genomet 5 , 6 . Desuden tilbyder microarray-baserede metoder ikke komplet cOverage af genomet.
I en nylig undersøgelse fra vores laboratorium 7 blev immunpræcipitationsbaserede metoder, snarere end bisulfitkonvertering, anvendt til at identificere højt CpG-rige, differentielt methylerede regioner i global skala hos CLL-patienter og normale sunde kontroller. Inmethyl-CpG-bindingsdomæne (MBD) næste generations sekventering (MBD-seq) afhænger berigelsen af dobbeltstrenget fragmenteret DNA af graden af CpG-methylering. Denne fremgangsmåde kan overvinde ulemperne ved bisulfitomdannelsesmetoden og kan også tilvejebringe genomomfattende dækning af CpG-methylering på en upartisk og PCR-uafhængig måde. Derudover kan MBD-seq i modsætning til bisulfit-konverteringsbaserede mikroarray-metoder anvendes til at analysere gentagelseselementers methyleringsstatus, såsom lange interspersed-nukleare elementer (LINE'er), korte interspersed-nukleare elementer (SINEs), lange terminale gentagelser (LTRS), Osv . Imidlertid sammenlignet med bisulfitomdannelsesmetoder,En MBD-seq-protokol kræver en relativt stor mængde input-DNA. Kvaliteten af sekventeringen læser også, og dataene afhænger af specificiteten, affiniteten og kvaliteten af de anvendte antistoffer.
Den nuværende undersøgelse forklarer en detaljeret MBD-seq-protokol til berigelse af methyleret DNA til næste generations sekventering. Den anvender et kommercielt methyleret DNA-bindings berigelse kit (opført i Materialetabellen ) samt en beregningsrørledning til visualisering og fortolkning af methylerings-sekventeringsdata for at identificere CLL-specifikke hyper- og hypomethylerede regioner sammenlignet med normale sunde kontroller. I grund og grund gør denne metode brug af MBD'ens evne til human MBD2-proteininteraktion med methylerede CpG'er til ekstraktion af DNA beriget med methylerede CpG'er, og dette efterfølges af høj-gennemstrømningssekvenseringen af methyleret DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den etiske godkendelse til indsamling af CLL-prøverne er fra 2007-05-21, med følgende registreringsnummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alle CLL-patienter blev diagnosticeret ifølge nyligt reviderede kriterier 8 , og prøverne blev samlet på diagnosetidspunktet. Patienterne i undersøgelsen blev inkluderet fra forskellige hæmatologiske afdelinger i den vestlige del af Sverige efter skriftligt samtykke. Kun prøver af CLL perifert blodmononukleær celle (PBMC) med en tumorprocent af leukæmiske celler ≥70% blev udvalgt i dette studie.
1. Forberedelser
- Isolere PBMC'er til DNA-ekstraktioner fra CLL og normale, sunde perifere blodprøver ved brug af et kommercielt isolationssæt (se Materialebordet ) i henhold til producentens anvisninger.
- Autoklav 1,5 ml rør. Optø alle reagenser i det methylerede DNA-bindingssæt (se materialetabellen ). </ Li>
- Brug DNase-frit vand til at fremstille 10 ml 1x perlevaskebuffer fra 5x lagervaskebufferen tilvejebragt af sættet for at vaske perler og fortynd MBD-proteinet tilvejebragt af sættet.
- Hent eller forberede følgende varer på forhånd: 3 M natriumacetat, absolut ethanol og 70% ethanol til DNA-udfældning ( Materialebord ).
2. Genomisk DNA-ekstraktion og sonikering
- Brug et kommercielt tilgængeligt DNA-ekstraktionskit ( Materialetabel ) til at isolere genomisk DNA fra patient- og normale PBMC-prøver i overensstemmelse med producentens protokol. Kvantificer det genomiske DNA ved anvendelse af et spektrofotometer ved 260 nm.
BEMÆRK: DNA-ekstraktionskolonnekapaciteten er 5-6 millioner celler, maksimum; Derfor er det vigtigt at bruge mere end en kolonne for prøver med mere end 5 millioner celler. Eliminer DNA'et to gange i lige store mængder i alt 100 μl 10 mM Tris EDTA (TE) buffer. Det MBD-biotinprotein, der anvendes i methylMiner kit til MBD sekventering vil ikke binde til enkeltstrenget DNA. Det er således meget vigtigt at holde det eluerede DNA enten frosset eller ved 4 ° C for at bevare sin dobbeltstrengede natur. - Fortynd 5 μg genomisk DNA fra hver prøve til i alt 200 μl ved anvendelse af TE-puffer (pH 8), hvilket giver en slutkoncentration på 25 ng / μl.
- Udfør sonikering i specialdesignede rør ved hjælp af en sonikator ( Materialebord ) i i alt 30 cykler (30 s til 30 s off per cyklus, efter hver 5 cyklusser drejes kort rørene for at samle prøverne til bunden).
BEMÆRK: Dette vil producere fragmenteret DNA på mellem 150 bp og 300 bp, hvilket er optimalt for denne protokol. - Kontroller sonikationsområdet for alle prøver, før du fortsætter til det næste trin af MBD-sekventering ved at køre 1 μl af de fragmenterede DNA-prøver og en DNA-størrelse-ladder på en kommercielt tilgængelig, forudstøbt 2% agarosegel ved anvendelse af DNA-elektroforese billeddannelsesudstyr. Visualiser tHan DNA ved hjælp af en standard UV transilluminator.
3. Perlepræparation forud for binding med MBD-biotinprotein
- Resuspender de magnetiske streptavidinperler fra stammen, der leveres af kittet, forsigtigt pipettering op og ned for at opnå en homogen suspension. Vortex ikke perlerne eller lad dem tørre.
- Anbring 50 μl perler (for hver 5 μg fragmenteret DNA-prøve) i separate, rene og mærkede 1,5 ml rør. Tilsæt 50 μl 1x perlevaskebuffer for at nå det endelige volumen på 100 μl.
BEMÆRK: Ved anvendelse af små 0,5 ml polymerasekædereaktionsstrimler til vask af perler anvendes omkring 150-200 μl vaskebuffer pr. Rør som nævnt i kit-protokollen. I tilfælde af 1,5 ml rør tilsættes dog mindst 250 μl til 300 μl vaskebuffer pr. Rør til perlevasken. - Placer rørene på et magnetisk stativ i et minut for at lade alle magnetiske perler koncentrere sig på rørets indre vægVendt mod magneten. Fjern væsken uden at berøre perlerne ved hjælp af en 200 μL pipette.
- Fjern rørene fra magnetstativet, tilsæt 250 μl 1x perlevaskebuffer, og bland forsigtigt perlerne med en pipette.
- Gentag trin 3.3 og 3.4 mindst 4-5 gange for alle prøver og endelig resuspenderes i 250 μl 1x perlevaskebuffer. Opbevar dem på is.
4. Binding af MBD-biotinproteinet til de vaskede perler
- Tilsæt 35 μl MBD protein (7 μL for 1 μg DNA-prøve) for at adskille rør og bring det totale volumen op til 250 μl ved anvendelse af 1x perlevaskebuffer.
- Tilsæt 250 μl fortyndet MBD-protein til de 250 μl vaskede perler og lad dem gå i ende-til-ende rotation ved stuetemperatur i 1 time.
- Efter blanding af perler og protein i 1 time vaskes MBD-proteinbiotinet bundet med magnetiske streptavidinperler.
- Placer rørene på magnetstativet i 1 min og fjern tHan flydende uden at berøre perlerne ved hjælp af en pipette. Tilsæt 250 μl 1x perlevaskebuffer og sæt rørene på en rotationsblander i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Gentag trin 4.3.1 to gange og resuspender endelig de vaskede MBD-biotinperler i 200 μl 1x perlevaskebuffer, hvilket gør perlerne klar til methyleret DNA-indfangning.
BEMÆRK: Vaskning 2-3 gange på denne måde fjerner alle de uhindrede MBD-proteinkugler med baggrund og forbedrer den effektive binding af MBD-proteinkoblede perler med fragmenteret genomisk DNA.
5. Bindende MBD-biotinperler med fragmenteret genomisk DNA
- I et rent 1,5 ml DNase-frit rør tilsættes 100 μl 5x perlevaskebuffer og 180 μl af det fragmenterede genomiske DNA (trin 2.3). Bring det endelige volumen til 500 μl ved brug af DNase-frit vand.
- Tilsæt 380 μL DNase-frit vand til de resterende 20 μl af det fragmenterede genomiske DNA og frys dem. Brug disse prøver som input DNEn kontrol og udfældning dem senere sammen med de endelige eluerede methylerede DNA-prøver (se trin 7.1).
- Placer rørene, der indeholder vaskede MBD-biotinperler (trin 4.4) på et magnetisk stativ i 1 min, og fjern væsken uden at forstyrre perlerne. Tilsæt 500 μl fragmenteret genomisk DNA fortyndet i perlevaskebuffer.
- Tæt alle rørene tæt sammen med paraffinfilm og lad dem stå natten over ved 4 ° C på en ende-til-ende rotationsstand ved 8-10 omdr./min.
BEMÆRK: DNA- og biotinbjælkebindingsreaktionen kan udføres i 1 time ved stuetemperatur, men efterlader den ved 4 ° C natten over kan forbedringen af det endelige methylerede DNA forbedres.
6. Fjernelse af det ubundne DNA og udluftning af det methylerede DNA fra perlerne
- Efter DNA- og MBD-vulstbindingsreaktionen placeres rørene på magnetstativet i 1 min for at koncentrere alle perlerne på rørets indre væg.
- Fjern supernatantvæsken med en pipette uden at røre vedPerlerne og gem denne ubundne DNA-prøvefraktion på is.
- Tilsæt 200 μl 1x perlevaskebuffer til perlerne, og rør rørene på roterende stativ i 3 minutter ved stuetemperatur. Placer rørene på magnetstativet og fjern væsken. Gentag vask yderligere to gange for at fjerne det resterende ubundne DNA.
- Efter den endelige vask tilsættes 200 μl højsalt-elueringsbuffer (2000 mM NaCl), der tilvejebringes i sættet for at eluere DNA'et.
- Placer rørene på det roterende stativ i 15 minutter ved stuetemperatur. Placer dem på magnetisk stand i 1 min og brug en pipette til omhyggeligt at overføre supernatanten til et nyt, rent 1,5 ml rør.
- Tilsæt 200 μl højt salt elueringsbuffer og gentag elueringen ved at rotere rørene ved stuetemperatur i 15 minutter. Tilsæt den anden eluering til det samme rør indeholdende 200 μl af den første eluering.
BEMÆRK: Den endelige 400 μl total elueret DNA er nu klar til ethanoludfældning for at ekstrahere den oprensedeDNA egnet til næste generations sekventering.
7. Ethanoludfældning og berigelse af methyleret DNA
- Tilsæt 1 μl glycogen (20 μg / μL; inkluderet i sættet); 40 μl 3 M natriumacetat, pH 5,2; Og 800 μl iskold absolut ethanol til 400 μl elueret DNA og også til 400 μl input DNA-prøver fremstillet i trin 5.2.
- Bland rørene godt ved vortexing og inkuber dem ved -80 ° C natten over.
- Centrifuger rørene ved 12.000 xg (maksimal hastighed) og 4 ° C. Kassér supernatanten forsigtigt, uden at forstyrre pelleten, tilsæt 500 μL 70% ethanol og vortex rørene.
- Centrifuger igen ved maksimal hastighed i 15 minutter ved 4 ° C, og fjern supernatanten ved omhyggeligt at anvende en pipette. Centrifuger rørene med maksimal hastighed i 1 min ved stuetemperatur og fjern den resterende ethanol fuldstændigt ved hjælp af en pipettespids.
- Luft-tørre pelleten i 5 minutter ved stuen temperatur. Tilsæt 10 μl DNase-frit vand til DNA-pellet. Fortsæt til den methylerede DNA-kvantificering (trin 7.6), MBD-sekventering (trin 7.7) og analyse (sektioner 8 og 9).
- Kvantificere de endelige genvundne methylerede DNA-prøver ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt fluorometrisk kvantitativ kit (se materialetabellen ) ifølge fabrikantens anvisninger.
- Bemærk: Ved anvendelse af denne protokol blev 30-50 ng slut DNA genvundet fra hver prøve. DNA-prøver er klar til at sendes på tøris til nedstrøms bibliotekskonstruktion og high-throughput MBD-sekventering
- Udfør DNA bibliotek konstruktion og high-throughput MBD sekventering ved hjælp af en kommerciel platform ( Materialetabel ), som beskrevet i reference 9 .
BEMÆRK: For den indledende kvalitetskontrol af det endelige methylerede DNA udføres bibliotekspræparater ved anvendelse af 50-bp par-ende-sekventering for alle prøver. Behandle de rå data for kvalitetskontrol efter sekventering, aS uddybet i trin 8.1, og videre behandle det ved hjælp af bioinformatikmetoder og statistiske metoder som beskrevet nedenfor (trin 8.2-9.6).
8. Bioinformatikanalyse Metode 1: Identifikation af CLL-associerede differentielt methylerede regioner (cllDMRs)
- Rengør den opnåede 49-bp-læsning (FASTQ-format) for adaptere ved hjælp af tilgængelige kvalitetsstyringsværktøjer, såsom Trimmomatic 10 eller Cutadapt. Crosscheck kvaliteten af den trimmet læsning ved hjælp af FastQC værktøjssæt:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10 - Juster de rensede FASTQ-filer med kortlæsende genomjusterer Bowtie mod et referencegenom 11 . Angiv parametrene som nedenfor:
- Tillad op til to fejlmatcher (Bowtie parameter: -v 2).
- Begræns rapporteringen til de seks bedste justeringer pr. Læsning (Bowtie parameter: -m 6) for at kontrollereTil multi-mapping læser.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
BEMÆRK: Konverter SAM-filer genereret til individuelle prøver efter justering til BAM ved hjælp af SAMtools.
Samtools view -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- Brug den modelbaserede analyse af ChIP-Seq (MACS) top-opkalderen på indstillede prøver (BAM) for at forudsige berigede / methylerede regioner fra CLL-undergrupperne 12 .
BEMÆRK: Sammenligning I: Brug indgangsprøve som kontrolgruppe og både Normal og CLL patientprøver som behandlingsgrupper. Dette trin er at indsamle alle negative toppe (toppe beriget i input / baggrund). Sammenligning II: Brug den normale prøvegruppe som kontrolgruppe og CLL-patientprøvegruppen som behandlingsgruppe. Opnådde positive toppe er CLL hyper-methylerede regioner, og negative toppe er CLL-hypomethylerede regioner over normale eller differentielt methylerede regioner (DMR'er).
macs14-t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - Fjern sammenligning I baggrundstoppe fra differentielt methylerede regioner (DMR'er) ved hjælp af BEDtools 13 .
Bedtools subtraherer -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - Forvent procentdelen af gentagelseselementer (SINE-Alu, LINE osv. ) Beriget i DMR'er.
- Brug fastacmd til at ekstrahere FASTA-sekvensen af DMR'er med de kromosomale koordinater fra referencegenomet HG19.
Fastacmd -d HG19_genome.fa -s kromosom -L Start, slut-l 50000> DMRs.fasta - Brug kommandolinjeværktøjet RepeatMasker til at forudsige procentdelen af gentagelseselementer, der findes i FASTA-sekvensen af DMR'er.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta
- Brug fastacmd til at ekstrahere FASTA-sekvensen af DMR'er med de kromosomale koordinater fra referencegenomet HG19.
- Angiv de forudsagte DMR'er ved hjælp af Homer "annotatePeaks.pl" med den tilgængelige Ensembl [PMC4919035] oR Genkode [PMID 22955987] transkript annotation (protein-kodende og ikke-kodende transkripter).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl eller Genkode GTF>
BEMÆRK: Dette giver information om fordelingen af toppe over forskellige genregioner ( dvs. promotor, exon, intron, 3 'UTR'er og 5' UTR'er) og intergeniske regioner. Transkripter eller gener forbundet med DMR'er hedder differentielt methylerede gener (DMG'er). - Brug berigelsesværktøjet med den opdaterede eller aktuelle funktionsdatabase til at finde funktioner beriget af CLL DMG'er (kun proteinkodende gener) 14 .
BEMÆRK: Gene Set Clustering baseret på Functional Annotation (GeneSCF) 14 er et real-time-baseret værktøj til funktionel berigelsesanalyse, der bruger opdateret KEGG og Gene Ontology som reference database.
9. Bioinformatikanalyse Metode 2: Identifikation af CLL-associeret signifikant diffMethylerede regioner (cll sigDMR's)
- Følg trin 8.1-8.5 fra metode I (afsnit 8) og brug læsningsbaseret differentieringsberigningsanalyse ved at udnytte de tilgængelige værktøjer som uddybet i trin 9.2 - 9.6 for at tilføje endnu et niveau af statistik til analysepireline.
- Kvantificer antallet af læsninger kortlagt til individuelle toppe eller DMR'er i Normal og CLL patientprøver ved hjælp af "featureCounts" fra "Subread" pakken 15 .
Underlæste / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
BEMÆRK: Et kortkvalitetsfilter kan indføres for at undgå at kvantificere læsninger af dårlig kvalitet ( f.eks. -Q 30). For dette trin skal du udarbejde SAF-filer for de opnåede DMR'er. For yderligere oplysninger om SAF filformat, brug venligst dette link http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - Brug en RAW-læsningstabel, der indeholder antallet af læsninger for de individuelle toppe i Normal anD CLL patientprøvegrupper i kantR som indgang 16 .
BEMÆRK: Sammenligne normale versus CLL patientprøvegrupper for at finde sigDMRs. For differentiel berigelsesanalyse skal du følge vejledningen fra edgeR for detaljerede trinvise anvisninger (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - Filtrer sigDMR'erne ved hjælp af den falske opdagelsesfrekvens (FDR) og log-fold ændring, forudsagt af edgeR 16 .
- Angiv de forudsagte sigDMR'er ved hjælp af Homer "annotatePeaks.pl" med den tilgængelige Ensembl eller Genkod-transkriptanotation (proteinkodning og ikke-kodende transkripsioner).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl eller Genkode GTF> -CpG
BEMÆRK: Dette giver information om fordelingen af toppe over forskellige genregioner ( dvs. promotor, exon, intron, 3 'UTR'er og 5' UTR'er) og intergeniske regioner. Transkripter eller gener forbundet med siGDMR'er kaldes sigDMG'er. - Brug et berigelsesværktøj med den opdaterede eller aktuelle funktionsdatabase til at finde funktioner beriget af CLL sigDMGs (kun proteinkodende gener) 14 .
BEMÆRK: GeneSCF, et af realtidsværktøjerne til funktionel berigelsesanalyse, anvender KEGG og Gene Ontology som referencedatabaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBD-seq blev for nylig udført på CLL-patienter og matchede, normale, sunde kontroller til identifikation af CLL-specifikke differentielt hyper- og hypomethylerede gener 7 . Den eksperimentelle og bioinformatiske rørledning, der anvendes til analyse af data genereret fra CLL og normale sunde prøver, er vist i figur 1A og 1B . Disse analyser identificerede adskillige CLL-specifikke differentielt methylerede regioner (cllDMR'er), som var signifikant hyper / hypomethylerede fra IGHV-muterede og IGHV-ikke-muterede prøver sammenlignet med kontrolprøver med en p-værdi <0.00001. Figur 2A viser alle cllDMR'erne opnået fra både normale B-celle og normale PMBC-sammenligninger. Alle cllDMR'erne blev kortlagt til forskellige klasser af proteinkodende og ikke-kodende gener, som vist i figur 2B . Vigtigt, i denne analyse var sammenligningerne perforMed uafhængigt mellem CLL patientprøverne, med to forskellige normale kontroller, sorteret B-celle og PMBC'er. Interessant resulterede analysen i en stor overlapning af almindelige CLL-specifikke differentielt methylerede gener (cllDMG'er, 851 hypermethyleret og 2,061 hypomethyleret) sammenlignet med normal B-cellekontrol og normale PBMC-kontrolprøver ( Figur 2C ), hvilket tyder på, at disse cllDMG'er kan være Mulige CLL signaturgener med signifikante roller i sygdomspatogenese. For at styrke de analyserede data blev flere CpG-steder placeret i et hypermethyleret proteinkodende gen, SKOR1 og et hypomethyleret langt ikke-kodende lncRNA, AC012065.7 , valideret under anvendelse af en pyrosequensionsmetode som beskrevet i tidligere publikationer 7 , 17 , 18 ( figur 3A Og B ). Figur 4 viser forskydet DNAEfter sonicationprotokollen. Det fragmenterede DNA ligger mellem 150 og 300 bp, hvilket gør det ideelt til sekventeringsformål.
Figur 1: Oversigt over arbejdsstrømmen anvendt i denne undersøgelse. Denne figur, der er opnået fra vores nylige publikation 7 , viser designet af den overordnede analyse anvendt til identifikation af de differentielt methylerede regioner (DMR'er) i patienter med kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL). ( A ) Eksperimentelt design af den MBD-baserede berigelse af methyleret DNA. ( B ) Analysepireline for bioinformatik anvendt til at identificere CLL-specifikke differentielt methylerede regioner (cllDMR'er). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Hypermethylerede og hypomethylerede cllDMR'er og cllDMG'er af CLL-patientprøver sammenlignet med normale, sunde, sorterede B-celler 7 . ( A ) Alle de kroniske lymfocytiske leukæmi (CLL) -associerede differentielt methylerede regioner med signifikante p-værdier (<0,001001) opnået ved sammenligning af de IGHV-muterede og -unutinerede CLL-prøver til normalt sorteret B-celler (øverste panel) og normale PBMC-prøver (Nederste panel). De berigelser, der vises i varmekartet, var inden for et ± 3 kb vindue fra differentielt methyleret region (DMR). ( B ) Venn-diagram, der viser overlapningen af CLL-specifikke differentielt methylerede gener (cllDMG'er, hypermethyleret og hypomethyleret) mellem IGHV-muterede og IGHV-ikke-muterede grupper. Cirkeldiagrammet repræsenterer procentdelen af gener tilhørende forskellige klassificering, såsom proteinkodning, Langt ikke-kodende RNA (lncRNA), pseudogener, antisense og andre ikke-kodende RNA'er. ( C ) Venn-diagram, der viser overlapningen af fælles differentielt methylerede gener (IGHV-muterede og IGHV-ikke-muterede prognostiske grupper) mellem B-celle og PBMC sammenligninger. Venstrepanelet på Venn-diagrammet viser overlapningen for hypermethylerede gener og det højre panel for hypomethylerede gener. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Validering af DNA-methyleringsstatus for individuelle CpG-steder på de udvalgte signifikant differentielt methylerede målgener. Pyrosekventeringsdata til kvantificering af procentdelen af DNA-methylering for to udvalgte gener ved anvendelse af et uafhængigt kronisk lymfocytIc leukæmi (CLL) prøve kohort indeholdende 54 prøver og 6 normale, sunde, alders-matchede B-celle prøver. ( A ) Boxplots repræsenterer procentdelen af methyleringsniveauer for 3 individuelle CpG-steder af det hypermethylerede SKOR1- gen under anvendelse af pyrosequensering. ( B ) Boxplot viser graden af methylering for 5 individuelle CpG-steder af hypomethyleret AC012065.7- gen under anvendelse af pyrosequensering. Kasserne angiver interkvartileområdet (25-75%), mens den indvendige vandrette linje angiver medianværdien. Whiskers repræsenterer minimums- og maksimumsværdierne. P-værdien svarende til graden af differentiel methylering af CLL-prøver over normale B-celler er vist i kassepladerne for hvert enkelt CpG-sted. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MBD-seq er en omkostningseffektiv immunpræcipitationsbaseret teknik, der kan bruges til at studere methyleringsmønstre med komplet gennembrydende dækning. Både MeDIP-seq (methyleret DNA-immunpræcipitation efterfulgt af sekventering) og MBD-seq resulterer i berigelse af CpG-rich methyleret DNA. Imidlertid viser MBD-seq mere affinitet mod binding til stærkt CpG-rige regioner, når de sammenlignes med MeDIP-seq 19 . Ved anvendelse af et methylbindende berigelsessæt kan man fraktionere DNA'et til høje CpG- og lav-CpG-rige regioner ved at eluere DNA med henholdsvis højt salt og lavt saltbuffere. I denne undersøgelse blev der kun udført en enkelt fraktion eluering for at opfange højt berigede CpG-rige regioner, der dækker de fleste CpG-øer.
MBD-seq kan være et stærkt alternativ til WGBS, som almindeligvis anvendes i CLL og andre leukæmiundersøgelser. Selvom MBD-seq kræver en relativt højere mængde input DNA sammenlignet med bisulfittenKonverteringsbaserede metoder, gør det muligt at undersøge globale methyleringsændringer, der kun er specifikke for 5 mC modifikationer uden nogen PCR amplifikations-bias skabt efter konverteringen. Således er MBD-seq en ideel metode til at adressere cllDMG'er, som kunne være potentielle epigenetiske-baserede CLL signaturgener med prognostisk værdi.
De afgørende faktorer for udførelse af denne metode er kvaliteten og sonikationsområdet for det fragmenterede DNA, der anvendes før bindingsreaktionen. Alle prøver viste kortere fragmentintervaler, mellem 150 og 300 bp ( figur 4 ), hvilket resulterede i resultater af god kvalitet, med omkring 25-33 millioner unikke læsninger for hver prøve kortlægning til genomet efter datafiltrering og rengøring.
Endelig er methyleringsstatusen for hyper- og hypomethylerede cllDMG'er blevet valideret for få gener ved anvendelse af en pyrosequensionsmetode i en uafhængig prøvekohort. Denne metode giver perceAfhængig af forholdet mellem C-to-T på individuelle CpG-steder baseret på mængden af C og T inkorporeret under sekvensudvidelsen. De hypermethylerede cllDMG'er udviste høje procentdele methylering i CLL-prøver sammenlignet med de normale prøver. Ligeledes viste de hypomethylerede cllDMG'er det modsatte. Pyrosequencing-data for to cllDMG'er er vist i figur 3 .
Sammenlignet med array-baserede metoder tillader denne fremgangsmåde den bredere undersøgelse af sekvenser på tværs af genomet, herunder tidligere annoterede regioner, der spænder over proteinkodende regioner og ikke-annoterede sekvenser, der spænder over gentagne elementer og lncRNA'er. Således identificerede denne tilgang på CLL-patienter adskillige nye cllDMG'er, der spænder over lncRNA'er og gentagne elementer. Da disse undersøgelser ikke tidligere er blevet udført i CLL-patientprøver, tjener denne undersøgelse som en værdifuld ressource til at identificere CLL-associerede differentielle methylerede regioner iForskellige prognostiske undergrupper. Disse cllDMG'er vil tjene som nye biomarkører og mål for epigenetisk lægemiddelbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Det Svenske Forskningsråd, Kræftens Bekæmpelse, Knut- og Alice Wallenbergfonden (KAW), og VD VästraGötalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
